Summary
Her presenterer vi protokoller for innsamling og microinjecting precellular vestlige korn rootworm embryo for å utføre funksjonelle-genomisk analyser som germline transformasjon og CRISPR/Cas9-genomet redigering.
Abstract
Vestlige mais rootworm (WCR) er en viktig pest av korn og er kjent for sin evne til å raskt tilpasse seg pest management strategier. Selv om RNA-interferens (RNAi) har vist seg for å være et kraftig verktøy for å studere WCR biologi, har sine begrensninger. Spesielt RNAi selv er forbigående (dvs. ikke fører til langsiktig Mendelian arv av tilknyttede fenotypen), og det krever å vite DNA sekvensen av målet genet. Sistnevnte kan være begrensende hvis fenotypen rundt kontrolleres av dårlig bevart eller selv romanen gener, fordi identifisere nyttig mål vil være utfordrende, om ikke umulig. Antallet verktøy i WCRS genomisk verktøykassen bør derfor utvides ved utviklingen av metoder som kan brukes til å opprette stabil mutant stammer og aktivere sekvens-uavhengige undersøkelser av WCR genomet. Her, detalj vi metodene som brukes til å samle og microinject precellular WCR embryo med nucleic syrer. Mens protokollene beskrevet her er rettet mot etableringen av transgene WCR, kan CRISPR/Cas9-genomet redigering også utføres ved hjelp av samme protokoller, med den eneste forskjellen er sammensetningen av løsningen injiseres i embryoer.
Introduction
Vestlige mais rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, er en viktig pest korn1. Interessant, WCR synes å overvinne kontroll måler enn mest landbruket skadedyr siden de ikke bare tilpasse fysiologisk, men også behaviorally2,3,4,5, 6. det siste tiåret, RNA-interferens (RNAi), et kraftig funksjonelle genomisk verktøy har blitt undersøkt som potensielle kontroll WCR7,8, og har også blitt brukt som et middel til å studere genet funksjon9. Men mens RNAi er ofte utført av microinjection av double-strandet RNA (dsRNA) i andre arter, er injeksjon-baserte RNAi sjelden i WCR. Faktisk, er det bare noen rapporter om RNAi via microinjection av dsRNA til WCR9. Grunnen er at WCR kan oppnå høy-nivåer av genet knockdown via inntak av dsRNA7,10, selv tillater studiet av embryonale effekter av mate dsRNA mor11. Mens denne metoden gjør WCR et utmerket emne for genomisk funksjonsanalyse via RNAi, har det bremset fremdriften for utviklingen av metoder for embryonale microinjection i denne arten.
Til tross for kraften i RNAi er det noen ulemper. For eksempel svare ikke alle gener like RNAi. Denne variasjonen kan gjøre tolke resultatene av en funksjonell genomforskning analysen vanskeligere. Også RNAi er forbigående, og genererer ikke arvelig mutasjoner. På den annen side, kan germline transformasjon, en annen funksjonelle genomisk verktøyet, generere arvelige mutasjoner via innsetting av et markert transposable element i genomet12,13. Dette gjør germline transformasjon et utmerket verktøy for å lage mutant stammer for bruk i langsiktige genetiske studier. Transformasjon kan også brukes til å redde en mutasjon ved å levere en funksjonell kopi av genet til en mutant genomet14. Videre er germline transformasjon hjørnesteinen i en rekke molekylær genetisk teknikker. I tillegg til fortrenging og/eller redde gen funksjon, kan germline transformasjon brukes for enhancer overlapping15, gene overlapping16, Gal4-baserte ektopisk uttrykk17og genom hele mutagenese18.
Flere nylig, verktøy sofistikert genomet redigering har blitt utviklet. Disse verktøyene inkluderer transkripsjon Activator-Like effektor Nucleases (TALEN) og CRISPR/Cas9-nuclease systemet19,20. Fordelen med disse nye verktøyene er at de tilbyr forskere evnen til å indusere en double-strandet DNA pause på nesten overalt i nesten alle genom. Når indusert, disse pausene kan repareres via enten ikke-homologe end begynte, som kan presentere slettinger eller innsettinger i målrettede genet, eller homologi-rettet reparasjon, som i nærvær av en konstruert konstruksjonen kan katalysere det utskifting av hele gener eller genetisk regioner21,22. Disse metodene krever imidlertid microinjection DNA, RNA og/eller protein i svært ung embryoer.
Enkelt viktigere, i motsetning til dsRNAs som brukes for RNAi, nucleic syrer og proteiner brukes for germline transformasjon og genom redigering ikke kan krysse cellemembraner. Derfor må microinjection plasmider DNAs, mRNAs og/eller proteiner skje under syncytial blastoderm Stadium (dvs. før insekt embryoet cellularizes). Dette gjør tidspunktet for injeksjoner en kritisk faktor. For eksempel i Drosophila melanogastermå embryo injiseres innen to timer etter egg lå12. Derfor må utviklingen av en vellykket embryonale microinjection protokoll for WCR ta hensyn de beste forholdene for kvinnelige egglegging, og den beste metoden for å samle tilstrekkelig mengder precellular embryoer.
Et forsøk på å bringe en rekke molekylær genetisk verktøy på WCR biologi krever utvikle metoder for innsamling og microinjecting precellular WCR embryoer. Her gir vi detaljerte instruksjoner, tips og triks, å hjelpe andre bruker transformasjon-baserte teknikker i WCR forskning. I tillegg til å utvide transgene teknologier til WCR for bruk i funksjonelle genomisk studier, kan disse teknikkene også kraftige nye pest kontroll strategier som gene stasjonen23,24 skal testes i dette økonomisk viktigste pest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni-nivå oppdrett WCR voksne
- Få en tilstrekkelig mengde WCR voksne (500-1000) fra et pålitelig selskap eller forskning laboratorium (se Tabell for materiale for et eksempel) og plasser i en 30 cm3 bur.
Merk: Bruk av en ikke-diapausing belastning anbefales sterkt. - Forberede WCR kunstig kosthold etter produsentens protokoll og hell et 1 cm-tykke lag i en 38 oz beholder (se Tabell for materiale). Etter miksing, lagre ubrukte kosthold på 4 ° C for opptil 2 måneder.
- Sette en Petriskål (100 x 15 mm) med voksen diett (10-15 g) i en 30 cm3 bur. Legg til flere diett når maten er lav eller tørr.
- Sette en kolbe (300 mL) med vann, dekket med en bomull ball, som brukes til å holde på plass en bomull rull (6 "x 3/8-tommers), å tjene som en vannkilde. Endre vannet når det blir lavt.
- Opprettholde WCR på 26 ° C med 60% fukt og en 14:10 light cycle i et insekt oppdrett inkubator.
2. embryo innsamling og justering
- Gjøre et egg samling kammer med 1% agar i vann i et sterilt 100 x 15 mm2 Petriskål. Lagre på 4 ° C etter agar stivner.
- For å samle nylagt egg, kan du plassere en enkelt lag av filter papir, etterfulgt av 4 lag av cheesecloth (hvert snitt til størrelse) på overflaten av agar (figur 1A).
Merk: Cheesecloth kan gjenbrukes, etter å ha blitt vasket i blekemiddel og autoklaveres, men det er ikke nødvendig å gjøre dette for første bruk. Filter papir bør ikke brukes på nytt, og trenger ikke å bli sterilisert. - Legg egg samlingen plate i WCR bur som sent på dagen som mulig (slutten av arbeidsdagen) og dekk med tinfoil telt. La over natten.
Merk: At lysene fra kl 10 til 12 am (14 h) forsinkelser egglegging, dermed tilrettelegge samlingen av yngre egg for microinjection uten lab personell å plassere samling kammer i bur sent på kvelden. - Fjerne egg samling kammeret rundt 8 eller 9 am
- Bruk tang til å plukke opp 1 lag cheesecloth på en tid og sted i et beaker (500 mL) vann. Vask egg av cheesecloth ved forsiktig røring (figur 1B og 1 C).
- Bruk en pære pipette overføre egg til en annen kanne (500 mL) vann. Gjenta 2-3 x å rengjøre eggene.
- Bruke pære pipette for å overføre egg på filter papir (figur 1 d) samtidig minimere mengden vann bære-over.
- Skåret svart filter papir i strimler så bredt som et glass lysbilde og bånd fast til lysbilde for å sørge for at ligger papiret flatt (figur 2A).
Merk: Svart filter papir hjelper forbedre synlighet under mikroskopet ved å redusere mengden av reflektert lys. - Gjelder ikke giftig lim (se Tabell for materiale for et eksempel) til filter papir i fine linjer (figur 2B). Holde lim linjene tynnere enn diameteren på et egg til å unngå å få eggene belagt i lim.
- Bruk en fin børste forsiktig flytte WCR egg enkeltvis fra filter papir lim linjen. Prøv å legge egg på limet før det tørker og holde minst ett egg avstanden mellom hvert egg.
- Maksimere injeksjon effektivitet ved å plassere flere linjer med egg på ett filter papir lysbildet (Figur 3).
- Etter at alle eggene er lagt ut på filter papir, vent til alle limet tørker før microinjection.
Merk: Germline transformasjon og CRISPR/Cas9-mediert genomet redigering, injisere alle embryoer ved middagstid (12 PM) slik at eldste embryoet er ikke mer enn 19 h gamle. Imidlertid, for RNAi er det ingen tidsbegrensning fordi, i WCR, dsRNA kan flytte mellom celler. Faktisk, for RNAi resultere aldring embryo i bedre overlevelse.
3. forberedelse av plasmider DNAs og injeksjon nåler
- Forberede høykvalitets supercoiled plasmider DNA ved hjelp av en endotoxin-fri kommersielle kit (se Tabell for materiale for et eksempel).
- For å forberede injeksjon løsningen, når konsentrasjonen av hver plasmider og deretter kombinere hjelper plasmider (250 ng/µL siste konsentrasjon), donor plasmider (750 ng/µL siste konsentrasjon) og fenol red buffer (20% siste konsentrasjon). Vortex løsningen kort og sentrifuger i 3 minutter på maksimal hastighet til å fremkalle partikler som kan tette nålen.
- Trekke Borosilikatglass nåler (OD 1 mm, ID 0.58 mm, 10 cm lengde) bruker en flammende/brun type brønnene avtrekker. For lagring Fjern sikker trakk nåler på tosidige selvklebende tape i en Petriskål eller annet beholderen.
Merk: For brønnene avtrekker systemet, innstillingene brukes var: varme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100. - Etterfylle injeksjon nålen ved hjelp av en mikro-loader tips (se Tabell of Materials) til Pipetter 0,5 - 1.0 µL ned inne nålen, nær konisk slutten. Fjerne bobler fra spissen av nålen hvis noen oppstår.
- Injeksjon nålen inn nål holder.
- Åpne spissen av nålen ved forsiktig å bryte med en fin tang eller forsiktig rørende/dra spissen på dekkglassvæske eller glass lysbildet.
Merk: Målet er å ha den minste åpningen som fortsatt kan injeksjon mix å komme ut (mindre åpninger krever vanligvis høyere injeksjon press). Skrå nåler krever ikke dette trinnet fordi de er allerede åpen.
4. microinjection og etter injeksjon omsorg
- Bruker en fin pensel, nøye våt overflaten av 1-3 egg med sterilt vann, sette inn nålen og injisere løsningen. Sette inn hvert egg før overflaten tørker. Se for utseendet litt rød farge inni egg under injeksjon for å indikere vellykket microinjection. Knuse eller fjerne alle egg som ser skadet, tom, eller ellers ikke kan injiseres.
Merk: Injeksjon press varierer basert på bar p, 10-13 psi er et godt utgangspunkt. - Etter at alle eggene er injisert, Fjern filter papir fra av objektglass.
- Plass filteret papiret på overflaten av en 1% agar rett (beskrevet ovenfor).
- Bruke plast parafin film å forsegle parabolen, og satt i en 26 ° C insekt oppdrett inkubator i 12 dager.
Merk: Parafin filmen vil bidra til å forhindre kryss-kontaminering av mold mellom retter. Men kan noen andre behandling å forhindre mugg og bakteriell vekst redusere overlevelsen av de injiserte embryoene.
5. dyrking og klekking av embryo
- Begynne å sjekke embryo 12 dager etter injeksjon for nylig klekkes larvene og fortsette daglig i de neste to ukene.
- Overføre larvene, med en fin pensel, en oppdrett boks med spiret korn og jord.
Merk: Mold kan vokse i agar fatet, men Larvene vil fortsatt klekkes i de fleste tilfeller. Se etter Larvene nøye i mold å fange dem alle. Noen larver kan flytte til lokket på fatet og kan sette seg fast i kondens. - Bak Larven på 26 ° C etter standard WCR oppdrett metoder25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En viktig faktor når du utvikler denne protokollen ble embryonale utvikling ved microinjection. Spesielt krever germline transformasjon microinjection av DNAs før embryonale cellularization. Dette er fordi DNAs ikke kan enkelt krysse cellemembraner. Forsøk å visualisere stadier av WCR embryonale utvikling ved hjelp av en kjernefysisk flekk var mislykket fordi dechorionation av WCR embryo egentlig oppløser alle beskyttende membraner ansvarlig for integriteten til fosteret. Men ble denne linjen forespørsel fortrengt av en annen vanskelighet-å skaffe tilstrekkelige mengder av embryo i tide. I feltet WCR hunner legger egg i jord, derfor bør det ikke være noen overraskelse at i laboratoriet, kvinner bare legger egg i mørket. Dette gjør kort dagtid samlinger (2-4 h) vanskelig. For å overvinne problemet, en enkel overnatting egg lå ble utført og ble funnet for å gi store mengder embryoer. Selv om prosessen med å samle (figur 1) og utforme (figur 2) embryo for microinjection er noe arbeidskrevende, hvis gjort raskt gjør denne protokollen microinjection av embryo som er mellom 2-19 h gamle ved injeksjon, og ingen eldre enn 24 h hvis injeksjoner utføres senere på dagen. Sammenligning av utvikling ganger mellom WCR og andre arter antyder at WCR embryo fortsatt skal precellular på 24 h innlegg legge egg (se diskusjon).
Første forsøk på å germline transformasjon av WCR involvert løsemiddel-injeksjon (Figur 3) helper (transposase kilde) og donor (transposon) plasmider i precellular embryoer. Transformasjon merket donor plasmider var et grønt fluorescerende protein (EGFP) gen drevet av en constitutively aktive promoter fra Tribolium castaneum (alpha-tubulin promoter26). Embryonale overlevelse var lav (tabell 1), men 26 G0 voksne ble gjenopprettet. For å fastslå om donor elementet inn bakterie celler, G1 embryo ble vist for EGFP uttrykk. Selv om fluorescerende avkom ble faktisk identifisert (Figur 4), screening WCR embryo med intens lyskilden viste seg for å være dødelig27. Neste runde med germline transformasjon utnyttet en ny donor plasmider, en besitter en rød fluorescerende protein (DsRed) genet drevet av en constitutively aktive promoter fra Drosophila melanogaster (varme sjokk protein 70 arrangøren28 ). Mens overlevelse var mye bedre (tabell 1), produsert de overlevende voksne bare en enkelt DsRed-positive Larven (figur 5). Men var disse eksperimentene særlig informativ i to forhold. Først, det ble oppdaget at microinjection forårsaket forsinkelser i utvikling, noe som resulterer i en lengre tid å luke. Alle embryoer klekking innen 2 uker, injisert embryo klekket mellom 12 og 26 dager innlegget microinjection, dermed krever overvåking lengre å sikre alle skilpadder ble samlet. Andre, ble det bemerket at nylig klekkes larvene var ganske aktiv. De krøp inn på lokket der de ville få fast, og noen ganger rømte fra agar parabolen. Disse problemene ble overvunnet av tetting Petri retter med en parafin film og undersøker lokk og agar nøye for skilpadder.
Den endelige versjonen av denne injeksjon protokollen ble testet microinjecting WCR embryo buffer alene eller hjelper og øye-utbyggeren (3xP329) merket donor DNA plasmider. Som en ekstra kontroll, et annet sett av embryo ble behandlet likt, men var ikke microinjected. Fire sett av embryo ble injisert med enten injeksjon løsning. Totalt 485 embryo ble injisert med buffer og, 148 klekket (Luke rate = 30,5%, tabell 1). Av 1,450 embryo injisert med plasmider DNAs, 289 klekket (rate = 26.8%). Interessant, av de 470 embryoene som gjennomgikk egg-håndtering vilkårene, men uten microinjection, bare 250 klekket (rate = 53.2%). Overlevelse av uninjected embryo som 20% høyere enn overlevelse for injisert embryoer er å være forventet på grunn av den uunngåelige skaden forårsaket av microinjection. Imidlertid liten forskjell er sett mellom buffer injeksjon og DNA injeksjon, noe som antyder DNA legges er akseptabelt for WCR (se diskusjon). Disse resultatene viser også at overlevelse forbedret over tidligere innsats. Vellykket etablering av transgene linjene ved hjelp av denne metoden har vært rapportert andre steder27.
Figur 1: Egg samling. A) Egg samling kammer. B) bratt stigning i visningen av en del av et egg kammer etter 24-h egg lå. Merk piler indikerer plasseringen av noen egg. C) vaske egg av cheesecloth. D) siste overføring av WCR eggene. Merk parentesen angir regionen med tettpakkede WCR embryo (dvs. minimal vann). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: forbereder en injeksjon lysbildet. A) svart filter papir teipet tett til en standard microscope skyve. B) bratt stigning i visningen av en del av en injeksjon skyve under forberedelsesprosessen. Note, pilen #1 viser plasseringen av en rad med egg, #2 delvis linje lim og #3 pin brukes til å spre limet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sprøytebruk embryoer. En injeksjon lysbilde med åtte radene av egg. På grunn av vinkelen injeksjon nålen, kan påfølgende rader av embryo injiseres ved å bevege scenen. Merk det røde fargestoffet i injeksjon nålen hjelpemidler sterkt visualisering av injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Transgene G1 fosteret. Embryoer fra en WCR voksen som var co injisert med piggyBac-basert hjelperen og donor plasmider som et tidlig embryo. Lyse grønne embryoet er positivt for forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) uttrykk mens den andre ikke. EGFP uttrykk er drevet av Tribolium castaneum alpha-tubulin promoter26. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Transgene G1 Larven. 3-skikkelsen larver som foreldre var co injisert med piggyBac-basert hjelperen og donor plasmider som et tidlig embryo. Rød glødende Larvene til venstre er positivt for DsRed uttrykk, larvene til høyre er ikke. DsRed uttrykk er drevet av Drosophila melanogaster varme sjokk 70 promoter28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksperimentet | Behandling | Egg | Klekket | Luke Rate |
| Exp. #1 | ΑtubEGFP-donor | 910 | 57 | 6,3% |
| Exp. #2 | hsp70DsRed-donor | 1580 | 211 | 13,4% |
| Exp. #3 | 3xP3EGFP-donor | 1450 | 389 | 26.8% |
| Buffer | 485 | 148 | 30.5% | |
| No-injeksjon | 470 | 250 | 53.2% |
Tabell 1: Microinjection dataene. Luke priser fra tre microinjection eksperimenter på WCR embryoer, viser antall egg injisert, antall larver som ble klekket og Luke hastigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om microinjection av WCR med dsRNAs for å RNAi har vært rapportert9, er den første protokollen å etablere rutiner for microinjecting precellular WCR embryoer, en kritisk prosess for å gjennomføre germline transformasjon og/eller CRISPR/Cas9 genomet redigering i denne arten. Vellykket microinjection av WCR embryo er avhengig av mange faktorer, som er transformasjon effektivitet. Diskuteres nedenfor er noen av de store problemene påvirker utfallet av bruker denne protokollen germline transformasjonskommando i dette bobla.
Få precellular embryo
Som nevnt ovenfor, DNA ikke krysse cellemembraner måte dsRNA kan. Dette betyr at det er av avgjørende betydning at DNA, mRNA eller proteiner injiseres før cellularization. Tidspunktet for injeksjon er kritisk, var det viktig å finne et sannsynlig vindu for vellykket microinjection basert på hvor lang tid det tar nondiapausing WCR belastning30 å fullføre embryogenesis. Dette ble beregnet basert på detaljerte studier av tidspunktet for syncytial blastoderm scenen i en annen beetle, Tribolium castaneum. I Triboliumoppstår cellularization ~ 8 h innlegget egg lå på 30 ° C31. Siden det tar ~3.5 dager for Tribolium å fullstendig embryogenesis på 30 ° C, foregår cellularization en tiendedel av veien i prosessen. Siden WCR embryo ta nesten 2 uker å utvikle, kan cellularization ikke skje før den andre dag innlegget egg lå. Det ble derfor antatt at vinduet for vellykket microinjection er minst 24 timer lang, som er nyttig, siden WCR krever overnatting egglegging for å skaffe tilstrekkelige mengder av egg for microinjection. Denne metoden ble brukt for vellykket transgenesis27, er det tenkelig at resultatene kan forbedres ved å injisere yngre embryoer, forutsatt håndtering svært tidlig embryo ikke skade dem.
DNA kvalitet og konsentrasjon
Det er ikke overraskende at DNA konsentrasjon spiller en sentral rolle i vellykket transformasjon. Det har lenge vært antatt at holde siste konsentrasjonen av plasmider DNA under 1 mg/mL var nødvendig for å unngå potensielle toksisitet injisert embryo32. Selv om det er nå uklart om toksisitet problemene i siste var på grunn av DNA selv eller var resultatet av forurensninger overført fra renselsesprosess plasmider, denne tommelfingerregelen er standhaftig overholdt for to tiår. Men vi har nylig oppdaget at overstiger 1 mg/mL grensen var ikke bare mulig, men også som gjør slik kan oppnå høyere transformasjon priser, fører til spekulasjoner om at fravær av egg toksisitet kan skyldes fremskritt i plasmider rensing kits, resulterer i færre miljøgifter. Gitt tiden det tar å bak WCR, er noen økning i transformasjon priser nyttig, selv om det resulterer i litt høyere dødelighet.
Myke egg overflaten før microinjection
I motsetning til Tribolium, må ytterst overflaten (plasmocitara) på en WCR fosteret være mildnet før microinjection. Dette er et kritisk steg selv når bruker kvarts nåler. Ideelt sett vann bør brukes på en enkelt embryo umiddelbart før injeksjon, men kan brukes på grupper av 2 til 3 embryo samtidig hvis microinjection kan gjøres før chorions reharden. Uten dette trinnet mislykkes nåler generelt å trenge av plasmocitara, og dermed forårsaker injeksjon forsøket mislykkes og potensielt skadelige spissen av nålen. Videre, hvis nålen skjer kunne trenge en tørr plasmocitara, injeksjon løsningen vanligvis lekkasjer tilbake følge av press i fosteret er høyere enn omgivelsestrykk. Det er imidlertid enkelt å skille tørr fra våte (myknet) embryoer. Spesielt når tørr, embryoer har en distinkt stive, runde form, mens tilsetting av vann forårsaker dem til å miste deres sfærisk utseende. Nedtoningen ikke bare lar nålen å trenge lett i plasmocitara men også reduserer trykket i fosteret nok som injeksjon løsningen ikke lekke ut.
Fuktighet og mold
Injisert embryo blir holdt i et varmt og fuktig miljø gjennom embryogenesis. Disse forholdene ikke bare gi det perfekte miljøet for WCR utvikling, men også fremme veksten av mold. I denne to ukers perioden vokser mold ofte på agar rettene boliger WCR embryoer. Dessverre embryoene krever høy luftfuktighet, og forsøk på å redusere den resulterte i mye lavere Luke priser. Interessant, hadde tilstedeværelse av mold generelt liten innvirkning på Luke priser, med de fleste embryo klekking uten problemer. Videre er soppdrepende behandlinger skadelig for WCR embryo, så den beste måten å redusere muggvekst synes å være å unngå forurensning; rengjøring verktøy, containere og microinjection systemet før bruk, og prøver å holde tidsbruk microinjecting til et minimum siden muggsoppsporer er utbredt i mange laboratorium miljøer.
Konklusjoner
Denne protokollen er ment å aktivere flere forskere å ansette transgene teknologi i sin WCR forskning og vil forhåpentligvis hjelpe i utviklingen av ekstra transgenics-baserte teknologier for bruk i dette insektet. Sofistikert transgenics-baserte eksperimenter utført i Tribolium kan være tilpasset WCR, inkludert mutagenese33 og CRISPR-baserte genomet redigering34. Fordi disse teknikkene krever microinjection av precellular embryo, vil denne protokollen være nyttig ikke bare for transposon-baserte funksjonelle genomisk studier og/eller CRISPR/Cas9-mediert genomet redigering men også for genetikk-baserte pest management strategier 35 , 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Monsanto korn Rootworm kunnskap Research Program, gi nummer AG/1005 (å MDL og YC) og oppstart midler til MDL fra NCSU. FC ble støttet av tilskudd fra Monsanto korn Rootworm kunnskap Research Program (AG/1005) og National Science Foundation, gi nummer kalt MCB-1244772 (MDL). Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser. FC og MDL unnfanget og utformet eksperimenter; FC, PW og SP utført eksperimenter; FC og MDL analysert resultatene; og FC, NG og MDL skrev manuskriptet. Vi takker Teresa O'Leary, William Klobasa og Stephanie Gorski for deres eksperthjelp i screening WCR. Vi takker også Dr. Wade French (USDA-ARS, nord sentrale Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) for leveranser av egg å etablere lab kolonier og gir oppdrett protokoller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qualitative Filter Paper (Black) | Ahlstrom | 8613-0900 | For egg microinjection |
| 1 oz Containers | Anny's Plastic Tableware | ASET101 | Egg container |
| Drosophila Agar Type II | Apex | 66-103 | Substrate for WCR egg-laying dish |
| Featherweight Forceps | Bioquip | 4748 | Handling larvae and pupae |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Wash corn and dishes |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Corn for feeding WCR |
| Microinjection System (Homemade) | NA | Parts & instructions available upon request | Controls injection pressure (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Glue eggs on filter paper |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
| Falcon Tissue Culture Dishes | Falcon | 25383-103 | Sprouting corn /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper Circles | Fisher Scientific | S47576C | Making agar dish for egg-lay/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-549-3 | Holding filter paper and eggs for microinjection |
| Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR adult artificial diet |
| Cotton Balls, Large | Genesee Scientific | 51-101 | Close the flask |
| Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes | Globe Scientific | 137035 | Collect and transfer eggs |
| Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | WCR screening |
| DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope | Leica | DSR | Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm |
| EGFP filter | Leica | GFP2 | Excitation filter: 440–520 nm, emission filter: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage for adult colony |
| Miniature Paint Brush | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Joystick Micromanipulator | Narishige | MN-151 | Micromanipulator and needle holder |
| Microscope XY Stage | Olympus | 265515 | Microscope stage (adapted for use with stereoscope) |
| Grade 90 Cheesecloth | Online Fabric Store | CHEE90 | For egg-lay |
| Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft |
| Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | WCR growing chamber (insect rearing incubator) |
| Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks | VWR | 4980-300-PK | Water container for adult colony |
| Griffin Low Form Beakers | VWR | 1000-600-PK | For egg wash |
| Braided Cotton Rolls | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Use in water supply for adult colony |
| Petri Dishes (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | For diet plates |
| Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
| Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instrument | P-2000/G | Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Premium Topsoil | The Scotts Company | 71130758 | Soil for cron growing |
| Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags | United States Plastic Corporation | 48342 | Bag agar dish after microinjection/5x7 |
| Petri Dishes (100x15m) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm |
| 6 oz Containers | Webstaurantstore | 128E506 | WCR single pair mating chamber |
| 38 oz Containers | Webstaurantstore | 128NC888 | Larvae rearing box/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container | Webstaurantstore | 128HRD16 | Larvae rearing box/16 oz |
| Microinjection Scope | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Microinjection needles |
| Adult Western Corn Rootworms | North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory | Non-diapase strain | Request from Dr. Bryan Wade French's lab |
| Plasmid DNA Midi Kit | Qiagen | 12143 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
References
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).
- Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
- Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
- Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
- Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
- Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
- Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
- Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162 (2010).
- Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
- Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
- Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
- Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
- Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
- O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
- Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
- Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501 (2009).
- Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
- Jeggo, P. A.
- Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
- Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
- Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
- Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
- Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
- Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
- Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
- Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
- Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
- Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
- Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11 (2007).
- Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).
