Methodenartikel

Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

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DOI:

10.3791/57558

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25. Mai 2018

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1Departments of Surgery, C.S Mott Children's and Women's Hospital, The University of Michigan Medical School, 2Departments of Pathology, C.S Mott Children's and Women's Hospital, The University of Michigan Medical School, 3Unit for Laboratory Animal Medicine, The University of Michigan Medical School, 4Departments of Radiology, C.S Mott Children's and Women's Hospital, The University of Michigan Medical School, 5Departments of Pediatrics, C.S Mott Children's and Women's Hospital, The University of Michigan Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Ultraschall-gesteuerte Injektion von Neuroblastom (NB) und Ewing Sarkom (ES) Zellen zu nutzen (gegründet Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen) an biologisch relevanten Standorten erstellen zuverlässigere präklinische Modellen für Krebs Forschung.

Zusammenfassung

Präklinische Tests von Anti-Krebs-Therapien setzt auf relevante Xenograft-Modelle, die die angeborenen Tendenzen des Krebses zu imitieren. Vorteile des standard subkutane Flanke Modelle sind prozedurale Leichtigkeit und die Fähigkeit, Monitor Tumorprogression und Antwort ohne invasive Bildgebung. Solche Modelle sind oft widersprüchlich in translationalen klinischen Studien und eingeschränkten biologisch relevante Merkmale mit geringer Neigung, Metastasen, zu produzieren wie eine native Mikroumgebung fehlt. Im Vergleich dazu zeigten orthotopen Xenograft Modelle an native Tumor Standorten zu imitieren den Tumor Mikroumgebung und wichtige Erkrankung Merkmale wie Ferne Metastasierung zu replizieren. Diese Modelle erfordern oft mühsame Operationsverfahren mit Narkose längere Zeit und Erholung. Um dieses Problem anzugehen, haben Krebsforscher kürzlich Ultraschall-geführte Injektionstechniken zu Krebs Xenograft Modelle für präklinische Experimente, ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Einrichtung unter der Regie von Gewebe murinen Modellen genutzt. Ultraschall-Visualisierung ermöglicht auch eine nicht-invasive Methode zur longitudinalen Beurteilung der Tumor Engraftment und Wachstum. Hier beschreiben wir die Methode für die Ultraschall-gesteuerte Injektion von Krebszellen, unter Verwendung der Nebenniere für NB und renale Sub Kapsel für ES. Diese minimal-invasive Ansatz überwindet mühsam offene Operation Implantation von Krebszellen im Gewebe-spezifische Standorte für Wachstum und Metastasierung und morbide Erholungsphasen nachlässt. Wir beschreiben die Verwendung von etablierten Zelllinien und Patienten abgeleitete Zellinien zur orthotopen Injektion. Vorgefertigte kommerziellen Kits sind erhältlich für Tumor Dissoziation und Luciferase tagging von Zellen. Injektion von Zellsuspension mit Bildführung bietet eine minimalinvasive und reproduzierbare Plattform für die Erstellung von präklinischen Modellen. Diese Methode wird genutzt, um zuverlässige präklinischen Modellen für andere Krebsarten wie Blase, Leber und Bauchspeicheldrüse Veranschaulichung seiner ungenutzte Potenzial für zahlreiche Krebs-Modelle zu erstellen.

Einleitung

Tierische Xenograft Modelle sind unverzichtbare Werkzeuge für präklinische Studien neuartiger Anti-Krebs-Therapien. Standard murinen Xenotransplantate setzen auf subkutane Flanke Implantation von Zellen, die vorsieht, dass einer effiziente und leicht zugänglichen Website Überwachung Tumorwachstum. Der Nachteil der subkutanen Modelle ist ihr Mangel an Tumor-spezifische biologische Merkmale, die ihr Potenzial metastasize1eingeschränkt werden kann. Solche Einschränkungen sind durch den Einsatz von orthotopen Xenotransplantate in welchem, die Tumor Zellen bei nativen Gewebe, die relevanten Mikroumgebung mit metastasierendem potenzielle2aufgeprägt sind. Orthotopen Xenograft Modelle erhalten ursprüngliche biologischen Eigenschaften und bieten zuverlässige Modelle für präklinische Drug Discovery3,4. Die Krebszellen genutzt für die Implantation unter der Regie von Gewebe sind etablierte Zelllinien oder Patienten gewonnenen Zellen von Patienten Tumoren. Gegründet von Krebszelllinien Xenotransplantate können hohe genetische Abweichung von den primären Tumor im Vergleich zu Patienten abgeleiteten Xenotransplantate5aufweisen. Angesichts dieser Tatsache ist die Einrichtung des Patienten abgeleitet orthotopen Xenotransplantate bevorzugter Standard für das Testen neuen Therapeutika in der Drogeentdeckung Krebs geworden.

In der pädiatrischen Krebs Neuroblastom (NB) orthotopen Xenograft Modelle rekapitulieren Primärtumor Biologie und Metastasen zu typischen Sehenswürdigkeiten der NB verteilt6,7zu entwickeln. NB entwickelt in der Nebenniere oder entlang der paravertebralen Grenzstrang. Die am häufigsten verwendeten Methoden der orthotopen Implantation erfordern offene Trans abdominale chirurgische Eingriffe. Solche Methoden sind oft langweilig, haben hohe Tier Morbidität und komplexe Erholungsphasen. Hochauflösende Ultraschall wurde vor kurzem für Gewebe gerichtet Implantation von Tumorzellen in der Entwicklung von mehreren murinen Modellen für Krebs Forschung8,9genutzt. Die Technik ist zuverlässige, reproduzierbare, effizient und sicher für die Einrichtung von entsprechenden metastasiertem Tumor Xenografts10,11.

Die Einrichtung der pädiatrischen Krebs Xenotransplantate durch Ultraschall-geführte Ziel Orgel Lokalisierung und Nadel Implantation von Zelllinien und Patienten abgeleitet Tumorzellen ist nachgewiesene11. Die Technik war für NB gezielt an der murinen Nebenniere genutzt. Ewing Sarkom (ES) ist überwiegend ein knöcherner Krebs, häufig in den langen Röhrenknochen wie Femur und Beckenknochen12zu sehen. Fallberichte haben gezeigt, dass um festzustellen, ob eine überwiegend knöcherner Krebswachstum in renal Gewebe machbar ist, eine renale Sub Kapsel Lage für orthotopen Implantation13gewählt wurde. Renal Sub Kapsel Zelle Implantation von Tumorzellen ist als ein zukunftsträchtiges Modell, spontane Metastasen für ES14zu studieren verwendet worden.

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Protokoll

Alle Arbeit erfolgte in Übereinstimmung mit der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) und entspricht den Verfahren, die von der Universität Ausschuss für Gebrauch und Pflege von Tieren (UCUCA) genehmigt. Die Einheit für Labor von Tier Medizin (ULAM) beaufsichtigte Tierpflege.

Alle Arbeit wurde mit Genehmigung von der University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) getan und alle Humanforschung Ethik Komitee Vorschriften entspricht. Menschliche Zellen gelten als potenziell biogefährliches Material sein, also folgen alle Vorsichtsmaßnahmen und entsprechende Biosafety-Praktiken, die von Ihrer Institution erforderlich sind. NSG-Mäuse sind stark immungeschwächten und anfällig für Krankheiten, verursacht durch Bakterien in der Umwelt weit verbreitet.
Verwenden Sie immer strengen sterilen Technik, bei der Vorbereitung der Materialien für die Implantation und die Injektionen durchführen.

(1) Zellkultur

  1. Etablierten menschlichen NB Zelllinien (SH-SY5Y, SK-N-BE2 und IMR32) in minimaler wesentliches Medium wachsen mit 10 % fötalen Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin ergänzt. IMR32 Zellen weiter mit 1 mM Pyruvat und 0.075 % Nahco33zu ergänzen. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 und 70-80 % Zusammenfluss.
  2. Wachsen Sie menschliche ES Zelllinien (TC32, A673 CHLA-25 und A4573) in RPMI Medium mit 10 % fötalen Rinderserum und 6 mM L-Glutamin ergänzt. Halten Sie alle Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2 auf 70-80 %.
  3. Senden Sie alle Zelllinien für die Authentifizierung.
    Hinweis: Zelle Authentifizierung erfolgt bei einer Außenanlage, verweisen wir auf Bestätigungen.

2. Vorbereitung des Patienten abgeleitet Primärtumor Zellen

  1. Mit Zustimmung des Patienten und Zustimmung verworfen Ernte menschlichen NB Tumorgewebe von Patienten, die eine chirurgische Resektion für lokale Kontrolle und Transport ins Labor in Gewebe Speicherlösung für Erhaltung.
    Hinweis: Alle Patientenproben de identifiziert und entsprechend den Institutional Review Board Richtlinien behandelt.
  2. Generieren Sie einen einzigen Patienten abgeleitet Krebs Zellsuspension (UMNBL001, UMNBL002) aus Tumorgewebe mit einem Tumor Dissoziation-Kit. Transfer ca. 0,5 g des Tumors zum einen 100 mm Zelle Kulturschale mit 5 mL RPMI Puffer, 200 µL Enzym H, 100 µL Enzym R und 25 µL Enzym A aus dem menschlichen Tumor-Dissoziation-Kit.
  3. Hacken den Tumor in kleine Stücke (2-4 mm) mit Schere und Zange Gewebe. Mischen Sie diese Fragmente mit den Lösungen im Schritt 2.2.
  4. Pipette die Tumor-Mischung in ein Dissociator Rohr und das Röhrchen verschließen. Invertieren der Röhre und auf der Hülle der Gewebe Dissociator befestigen. Führen Sie auf Programm h_tumor_01.
  5. Inkubieren Sie die Tumor-Zellsuspension oben erhaltenen bei 37 ° C für 1 h auf einem drehbaren Gestell mit intermittierenden Verreibung alle 15 min.
  6. Übertragen der Zellsuspension auf eine neue konische Rohr 50 mL und 10 mL RPMI. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 314 X g für 5 min.
  7. Den überstand zu entfernen und das Pellet in 5 mL RPMI auszusetzen. Diese Lösung durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren und die angespannte Lösung in ein frisches 50 mL konische Röhrchen sammeln. Waschen Sie dieses Sieb einmal mit 5 mL RPMI Medien und Zentrifugieren Sie die Mischung bei 314 X g für 5 min, ein Pellet zu sammeln.
  8. Messen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer15. Aussetzen der Pellets von oben erwarb RPMI, eine Endkonzentration von 4 × 105 Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL dieser Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.
    Hinweis: RPMI verwendet hängt die Zelle Dichtemessung. Beispielsweise wenn die gemessenen Zelldichte des erhaltenen Pellets 4 x 105 Zellen ist, aussetzen Sie, das Pellet in 10 µL RPMI.

(3) Luciferase Tagging von Krebszellen

  1. Machen Sie 10 mL der Transduktion Medien mit viralen überstand EF1a-Luc2-IRES-mCherry 5 mL und 5 mL Stammzell-Medien. Fügen Sie 7,5 µL 1 X Polybrene.
  2. Mix 5 × 106 Krebszellen in Transduktion Medien und Platte in 100 mm ultra-niedrigen Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 über Nacht.
    Hinweis: Da niedrige anbauplatten verwendet werden, werden Zellen nicht Platte eingehalten.
  3. Bringen Sie nach 24 h 100 mm Platte Zellen unter Gewebekultur Haube zu, und übertragen Sie die Mischung in ein 15 mL konische Röhrchen. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 314 X g für 5 min. zu Fuß die Zelle Pellet. Waschen Sie die Zelle Pellet einmal mit 1 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL HBSS, enthält 1 % fetalen bovine Serum (FBS).
    1. Sortieren Sie Luciferase Zellen basierend auf GFP-positiven Signal auf Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Analyse. Platte der sortierten Zellen auf 100 mm Gewebekultur behandelt-Speise- und pflegen auf 70-80 % Zusammenfluss, 37 ° C und 5 % CO2 bis erforderlich.
  4. Luciferase Signal mit Luciferase Assay Kit zu bestätigen. Platte 10 x 104 sortiert Zellen pro Bohrloch in ein Illuminometer kompatibel 96 gut Platte und inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach 24 h 96-well-Platte auf Raumtemperatur bringen und kultivierten Medien in Brunnen im Verhältnis 1:1 Steady-Glo Reagenz hinzuzufügen. Können Sie Zellen lysiert für 5 min und Lumineszenz im Spektralphotometer zu lesen.
  5. Bringen Sie die 100 mm Schale unter einer Gewebekultur Haube. Verwerfen Sie die überstand Medien. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 mL 1 X PBS.
  6. Fügen Sie 2 mL 0,25 % Trypsin und 100 Millimeter-Teller in den Inkubator für 2-3 min zurück. Nach 2-3 min verdrängt Zellen unter dem Mikroskop suchen Sie und 8 mL RPMI, Trypsin zu deaktivieren.
  7. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 314 X g für 5 min. zu Fuß ein Pellet. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zelle Pellet mit 1 mL 1 X PBS, auszusetzen Sie, das Pellet in 5 mL RPMI und bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hemacytometer15. Zentrifugieren Sie Yhe verbleibende Zelle Lösung bei 314 X g für 5 min um eine Kugel zu erhalten.
  8. Hängen Sie das Pellet in RPMI, eine Konzentration von 4 x 105 Zellen/10 µL zu erhalten. Nehmen Sie 5 µL Zellsuspension und 5 µL Matrigel 10 µL der Zelle Lösung für jede Injektion zu machen.

4. Ultraschall geführte Nebenniere (NB) oder renale Sub-Kapsel (ES)-Implantation

Hinweis: Alle Ultraschall-Verfahren werden mit einer hohen Auflösung in Vivo imaging-System durchgeführt. Für die beschriebenen Verfahren wurde die Wandler, hat eine Mittenfrequenz von 40 MHz und eine Bandbreite von 22-55 MHz verwendet.

  1. 6-8-Woche-alten immundefiziente NSG Mäuse für alle Injektionsverfahren zu nutzen.
  2. Chill Matrigel und autoklaviert Hamilton Spritzen ausgestattet mit einer 27G Nadel (1,25") und 22G Katheter (0,9 mm Außendurchmesser, Länge 25 mm) über Nacht bei 4 ° c
  3. Legen Sie die Zelle Lösung in Schritt 3 auf Eis zubereitet.
  4. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktion Kammer mit 2 % Isofluran O2 bei 2 L/min geliefert.
    Hinweis: Ausreichende Anästhesie wird mit der Mangel an Bewegung und die Erhaltung der Spontanatmung bestimmt.
  5. Sobald betäubt, enthaaren Sie den Rücken und die Flanken der Tiere mit Haarwasser entfernen (z. B. Nair) und einen Rasierer.
  6. Das Tier zum Übertragen der imaging Plattform mit Bauch Seite nach unten, wo die Nase des Tieres in eine Nosecone platziert und sicherte sich beim Einatmen Isofluran
  7. Setzen Sie optische Salbe in das Tier Augen Austrocknen zu verhindern. Kleben Sie die Maus um eine unbeabsichtigte Bewegung zu verhindern.
  8. Identifizieren der murinen Leber, Vena Cava, Milz, linke Niere und angrenzenden linke Nebenniere mit Ultraschall Visualisierung.
  9. Sterile Handschuhe, Maske und Mütze für persönlichen Schutz und Pflege der sterilen Bedingungen zu verwenden. Unter Ultraschallkontrolle sanft legen Sie 22G Katheter durch die Haut und sichern Sie Muskel direkt in der linken Nebenniere für zelluläre Injektion einen Kanal zu. Entfernen Sie die Nadel und verlassen Sie den Katheter im Ort zu.
  10. Last einer gekühlten Hamilton-Spritze mit einer KK Nadel mit 10 µL der Zelle-Lösung ausgestattet, dann führen Sie die Spritze hierbei durch den Katheter positioniert in der Mitte der Nebenniere.
  11. Injizieren Sie die Zellen in den Nebennieren Zielgewebe. Belassen der Nadelöhrs für 1-2 min erlauben die Matrigel festlegen. Langsam ziehen Sie die Nadel, gefolgt von der Entfernung des Katheters.
  12. Setzen Sie die Mäuse wieder in ihren Käfig und sicherstellen Sie, dass die Maus ausreichend zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wieder zu sich kommt.
    Hinweis: aufgrund des minimal-invasiven Charakters dieser Technik, post prozeduralen Schmerz ist minimal, aber immer noch überwacht auf einer täglichen Basis mit Mäusen Gesundheit Kontrollen. "befolgt werden mit einem Satz:" Wenn unerwartete Zeichen von Schmerz oder Stress im Verlauf gekennzeichnet sind ein Experiment wenden Sie sich bitte mit Ihrem institutionellen tierärztliche Unterstützung Gerät Informationen zur Analgesie oder andere medizinische Versorgung.

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Ergebnisse

Mit den beschriebenen Verfahren vorgestellt, erfolgte Ultraschall-geführte Implantation von NB-Zellen in der Nebenniere in einem speziellen Verfahren Raum verfügt über eine beheizte OP-Tisch. Arm und Fuß-Pads stellte für die Überwachung der murinen Herztätigkeit (Abbildung 1A). Das Tier blieb unter kegelkonus Inhalation mit Isofluran betäubt. Mit einer hochauflösenden Ultraschallsonde, wurde die linke Niere mit Nebenniere nur cranial der Niere (

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Diskussion

Ultraschall-geführte Implantation von NB und ES Zellen ist eine effiziente und sichere Methode, um zuverlässige murinen Xenotransplantate für präklinische Studien in der Krebsbiologie zu etablieren. Entscheidend für den Erfolg des Ultraschall-geführte Gewebe gezielt Implantation ist die Präsenz und Verfügbarkeit von geschultem Personal mit Fachwissen in anatomisch Lokalisierung der Orgel von Interesse und Stereotaktische Injektion von Tumorzellen.

Die Dissoziation des Tumorgewebes erwies sich ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Robert Wood Johnson Foundation/Amos medizinische Fakultät Entwicklung Programm, Taubman Research Institute, und die Sektion für Kinderchirurgie, der University of Michigan unterstützt. Die Autoren möchten Kimber Converso-Baran und Dr. Marcus Jarboe danken für die Unterstützung bei der Ultraschall-Injektionsverfahren und imaging Plattform. Wir danken Paul Trombley für seine Unterstützung bei der Abbildung Grafiken. Gewähren Sie wir danken auch die Abteilung für Radiologie an der University of Michigan für den Einsatz des Center für Molekulare Bildgebung und der Tumor-Imaging-Kern, die teilweise durch umfassende Cancer Center NIH unterstützt werden, P30 CA046592. Der University of Michigan Physiologie Phänotypisierung Kern, der teilweise durch Zuschüsse von der NIH (OD016502) und Frankel Cardiovascular Center unterstützt wird. Zelle Zeile Authentifizierung erfolgte bei IDEXX RADIEN Bioresearch Einrichtungen, Columbia, MO. Wir danken Tammy Stoll, Dr. Rajen Mody und Mott solide Tumor-Onkologie-Programm. Unsere Patienten und Angehörigen sind dankbar für ihre Inspiration, Mut und kontinuierliche Unterstützung unserer Forschung anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mäuse
NOD-SCIDCharles River394
NSGThe Jackson Laboratory5557
Cell Line  <
strong>NB
IMR-32ATCCCCL-127Etablierte humane Neuroblastom-Zelllinie
SH-SY5YATCCCRL-2266Etablierte humane Neuroblastom-Zelllinie
SK-N-Be2ATCCCRL-2271Etablierte humane Neuroblastom-Zelllinie
ES
TC32 Etablierte humane Ewing-Sarkom-Zelllinie
A673COGcell.ORGEtablierte humane Ewing-Sarkom-Zelllinie
CHLA-25COGcell.ORGEtablierte humane Ewing-Sarkom-Zelllinie
A4573COGcell.ORGEtablierte humane Ewing-Sarkom-Zelllinie
Zelllinie media
RPMILife Technologies11875-093
MatrigelBD BioSciences354234
Dissoziation
DissektionswerkzeugeKentScientificINSMOUSEKIT
Dissoziationskit für menschliche Tumore MACS Miltenyi Biotec130-095-929
gentleMACS DissoziatorMACS Miltenyi Biotec130-093-235
gentleMACS C RöhrchenMACS Miltenyi Biotec130-096-334
ZellsiebCorning431751
Luciferase Tagging
Lenti-GFP1 VirusUniversität of Michigan, Vector CoreLuciferase Virus
Steady Glo-Luciferase Assay KitPromegaE2510
Bioluminescence Imaging
Ivis Spectrum Imaging SystemPerkinElmer124262
D-LuciferinPromegaE160X
Anästhesie
Inhaliertes Isofluran Piramal Critical Care Inc66794-0017-25
Ultrasound Guided Injection
Vevo 2100 High Resolution ImagingVevo2100
Hamilton Spritzen (27 Gauge Nadel)Hamilton80000
22 Gauge AngiokatheterBD Biosciences381423
Optische SalbeGroße Pharmaunternehmen301909
NairChurch & Dwight CoHaarentfernungsmittel
Aquasonic 100 Ultraschall Transmission GelParkerUltraschall gel
Histology
CD99DAKOM3601Primärer Antikörper
Tyrosin HydroxylaseSigma-AldrichT2928Primärer Antikörper
Sekundärer HRP-Polymer AntikörperBiocareBRR4056KG
Miscelleneous
10 mL PipettenFisher Scientific13-676-10J
5 mL PipettenFisher Scientific13-676-10H
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenFisher Scientific05-408-129
P1000 PipetteEppendorf
P200 PipetteEppendorf3120000054
P1000 PipettenspitzenFisher Scientific21-375E
P200 PipettenspitzenFisher Scientific21-375D
Tragbare PipettierhilfeDrummond4-000-101
digitale TierwaageKentScientificSCL-1015
MessschieberFisher Scientific06-664-16
6well niedrige AufsatzplattenCorning07-200-601
10 cm Mit Gewebekulturen behandelte SchalenFisher ScientificFB012924
PolybreneSigma-AldrichTR-1003-G
COGcell.ORG 3120000062

Referenzen

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Schlagwörter

Ultraschallgesteuerte Injektionorthotopes Xenograft Modellpatienteneigene ZellenImplantation in die NebenniereTumor Dissoziations KitBiolumineszenz Imagingminimalinvasives VerfahrenNSG Mausmodell

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