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Bioengineering

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

Abstract

헌, 합성, 및 동물 파생 된 이식 조직 교체에 대 한 건설 기계로 현재 사용 되는 낮은 가용성, 불 쌍 한 생체 적합성 및 비용 제한이 있습니다. 식물 조직 그들이 유일 하 게 적합 상호 다공성, 기존 혈관 네트워크, 그리고 다양 한 기계 건설 기계, 높은 표면적, 우수한 물 수송 및 보존, 등으로 사용 하는 유리한 특성이 있다 속성입니다. 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 식물 decellularization의 2 개의 성공적인 방법이 여기 설명 되어 있습니다. 첫 번째 방법은 포유류 조직 취소 하는 데 사용 하는 이전 설립된 방법과 비슷합니다 세포 물질을 제거 하는 세제 목욕을 기반으로 합니다. 두 번째 잎 맥 관 구조를 격리 하 고 온수 표 백제 및 잎과 줄기를 소금 목욕의 사용을 포함 하는 프로토콜에서 적응 하는 세제 무료 방법입니다. 두 방법 모두 유사한 기계적 특성 및 낮은 세포 대사 충격, 따라서 더 나은 그들의 의도 된 응용 프로그램을 적합 한 프로토콜을 선택 하려면 사용자를 허용 건설 기계를 얻을.

Introduction

조직 생활을 만드는 1980 년대에 등장 하는 조직 공학 대체, 그리고 잠재적으로 주소 중요 한 장기 및 조직 부족1. 한 전략은 자극 하 고 누락 된 조직이 나 장기를 재생성 하기 위해 시체를 안내 건설 기계를 사용 하 고. 첨단 3 차원 인쇄 생산 독특한 물리적 특성으로 건설 기계와 같은 접근을 제조, 비록 달성 물리적 및 생물학적 속성의 다양 한 범위와 건설 기계를 제조 하는 능력 유지 도전2 , 3. 또한, 기능 혈관 네트워크의 부족으로 이러한 기술을 제한 되어 3 차원 조직 재생에. Decellularized 인간과 동물 조직으로 건설 기계를 사용 하 여가 문제4,5,,67우회 주 었 있다. 그러나, 높은 비용, 일괄 배치 변화, 및 제한 된 가용성의 광범위 한 사용을 제한할 수 있습니다 decellularized 동물 투어8. 또한 환자에 게 잠재적인 질병 전송 및 일부 decellularized 포유류 조직9면역학 반응에 대 한 우려가 있다.

셀 루 로스, 식물 및 세균성 소스에서 파생 된 다양 한 응용 프로그램에 대 한 바이오 재생 의학에서 생성 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다:10,11, 연골12,,1314 및 상처 치유15뼈. 그들은 내 구성과 저항 포유류 세포에 의해 분해 되 고 하는 룰의 구성 되어 건설 기계 추가 혜택이 있다. 이것이 사실은 포유류 세포는 셀 룰 로스 분자를 분해 하는 데 필요한 효소를 생산 하지 않습니다. 비교에서는, 건설 기계는 세포 외 기질, 콜라겐 등에서 고분자를 사용 하 여, 쉽게16 를 세분화 생산과 장기 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 콜라겐 건설 기계 화학 cross-linking에 의해 안정 될 수 있다. 그러나, 건설 기계17의 생체 적합성에 영향을 주는 cross-linkers의 고유한 독성 때문 교환이 이다. 반대로, 셀 루 로스 통하지 포유류 세포18,,1920효소 저하 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 이식의 사이트에 남아 있을 가능성이 있다. 이 가수분해 전처리를 통해 저하의 속도 cellulases21장비의 공동 배달을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. Decellularized 플랜트-파생 셀 룰 로스 건설 기계에서 vivo에서 의 생체 적합성도 쥐22연구에서 입증 되었습니다.

진화의 년의 수백만의 수백을 통해 식물의 구조와 구성의 유체 수송 및 유지의 효율성을 증가 하 정제는. 공장 혈관 혈관은 작은 혈관, 머 레이 법23에 따르면 포유류 맥 관 구조에 유사한으로 분기 하 여 유압 저항을 최소화 합니다. Decellularization, 후 식물의 용기 및 상호 연결 된 숨 구멍의 복잡 한 네트워크 유지 됩니다. 쉽게 사용할 수 있는 고유 식물 종의 수많은 고려 건설 기계 공장에서 파생 된 현재 조직 공학24,25건설 기계에 영향을 미치는 디자인 한계를 극복 하기 위해 가능성이 있다. 예를 들어, Modulevsky 그 외 여러분 시연 신생 및 셀 마이그레이션 decellularized 애플 조직 마우스22의 뒤에 피하 이식 했다 때 발생. 마찬가지로, Gershlak 외. 내 피 세포 decellularized 잎24의 맥 관 구조 내에서 성장 될 수 있었다 보여주었다. 별도 실험에서 Gershlak 그 외 여러분 또한 cardiomyocytes 잎의 표면에 성장 수와24계약 수를 보여줄 수 있었다.

식물은 또한 현재까지 개발 된 가장 진보 된 제조 기법으로도 달성 하기 어려운 거시적인 규모에 복잡 한 조직 세포에서 포함 됩니다. 식물 조직의 복잡 한 계층 구조 디자인은 그들이 그들의 성분26의 합계 보다 더 강한 합니다. 식물 줄기 등 견고 하 고 힘든 구성에서 배열 하는 다른 기계적 특성의 과다 보유와 같은 훨씬 더 유연 하 고 유연한 것27를 나뭇잎. 잎 크기 면에서 종에 따라 다릅니다, 그리고 모양, 강도, vascularization, 정도 휴식 및 화란의 다른 학위를가지고 있습니다. 전반적으로, 이러한 식물 속성 decellularized 식물 독특하고 대단히 기능적인 의료 기기, 건설 기계 엔지니어링 조직 등으로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.

이 프로토콜 decellularize 식물 조직에 두 가지 방법에 초점을 맞추고와 같은 고 조직 공학에서 공중 발판으로 사용 하기 위해 유래한 다. 첫 번째 방법은 DNA와 포유류 decellularize 조직6,22,25 식물에 널리 사용 되는 기술에서 적응 되어 세포 물질을 제거 하는 일련의를 사용 하는 세제 기반 기술 ,,2829,30. 두 번째 방법은 세제 무료 이며 일반적으로 나뭇잎31의 부드러운 조직을 제거 하는 데 사용 하는 "skeletonization" 프로토콜에서 적응 됩니다. 이전 작업 그 주변의 부드러운 조직31는 맥 관 구조 분리를 촉진 표 백제와 나트륨 중 탄산염 해결책에서 잎을 끓인 것을 보여주었다. 이 기술은 17번째 및 18번째 세기 Albertus Seba32 및33에드워드 패 리 쉬 작품 등에서 실시 하는 실험을 다시 인용 될 수 있다. 이러한 실험을 중심으로 잎과 과일, 같은 공장 문제를 떠나 장기간 물에 잠긴 (달 주) 시간과 수 있도록 자연스럽 게 멀리 부패 부드러운 조직. 여기 "skeletonization" 접근은 셀룰러 잔류물을 제거 하 고 부드러운 조직 구조를 크게 방해 하지 않도록 낮은 온도에서 더 이상 보육 시간 등 온화한 조건, 사용에 적응 됩니다. 여기 자세한 실험에 대 한 3 개의 식물 종류 사용 되었다: 무화과나무 hispida, Pachira aquatica 및 필리핀의 종. DNA 정량화, 기계적 테스트, 그리고 두 방법 모두에서 세포 대사 활동에 미치는 영향의 결과 설명 합니다.

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Protocol

1. 식물 조직 세제 기반 접근을 사용 하 여 decellularization

  1. 신선 또는 냉동 F. hispida, 잎 샘플을 사용 합니다. -20 ° C 냉동 고 (최대 1 년) 나중에 사용에 대 한 저장소에서 사용 되지 않는 신선한 샘플을 동결.
    참고: 거의 모든 원하는 식물의 줄기 나 잎 조직을 사용 합니다. 확장된 저장 시간은 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.
    1. 샘플의 용도 기준으로 하 여 처리 하는 샘플의 형태와 크기를 결정 (즉, 샘플 스트립으로 잘라 기계적 테스트 응용 프로그램에 대 한 적합, 한편 8 m m 디스크 샘플 다 잘 자란 응용 프로그램에 유용 ). 잘라 잎 8 m m 디스크 날카로운, 깨끗 한 생 검 펀치 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2o. 잠수 하는 동안
      참고: 전체 잎과 줄기에는이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나, 작은 샘플은 빨리 decellularize 것입니다.
    2. 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H2O 세척 및 그들을 녹여 낮은 속도 설정 흔들 플레이트 세트에 5-10 분에 대 한 샘플을 품 어. 충분히 이온된 h 조2O를 사용 하 여 모든 샘플은 철저 하 게 침수 되도록.
  2. 10% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이온된 H2o. 장소에서에서의 솔루션 (유리 또는 플라스틱 접시 이상적 이다) 적합 한 컨테이너에 샘플을 준비 하 고 SDS 솔루션 샘플 표지를 추가. 손상을 방지 하기 위해 샘플에 낮은 속도를 흔들 플레이트 세트에 실내 온도 (20-25 ° C)에서 5 일에 대 한 샘플을 품 어.
    참고:이 decellularization 과정을 감속 하 고 SDS에 의해 고르지 치료 이어질 수 컨테이너를 혼잡 하지 않습니다. 이 단계 동안 샘플 갈색 색조를 취득 해야 합니다.
    1. 5 일 후 바꿉니다 SDS 솔루션 이온된 H2o. 품 어떤 잔여 SDS 솔루션을 철저 하 게 씻어을 흔들어 접시에 추가 10-15 분에 대 한 샘플을.
  3. 10% (v/v) 표 백제 솔루션에서 1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제를 준비 합니다. 500 mL 솔루션, 백제의 50 mL와 5 mL의 비 이온 계면 활성 제를 혼합 후 이온 H2o. Submerge 445 mL을 추가 갓된 솔루션에서 샘플링 합니다.
    참고: 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 없는 긴 수명, 따라서, 준비의 48 h 사용할 수 있습니다.
  4. 샘플은 완전히 지워질 때까지 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 마다 24 h를 교체 (시각적 비교를 위해 그림 1A 참조). 다음 씻어 초과 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션을 2 분 동안 흔들어 접시에 이온된 수에 샘플을 품 어. 흔들어 접시 샘플을 손상을 방지 하기 위해 낮은 설정으로 설정 합니다.
    참고: 샘플 사용의 선택을 취소 하는 데 필요한 시간 따라 달라 집니다, 유형 및 식물의 종. 전체 decellularization의이 샘플의 완전 한 변색 (철저 한 청소를 보장 하기 위해 DNA 정량화를 수행).
    1. 년까지 그들을 저장 하는 샘플을 lyophilize (플래시 동결 액체 질소를 사용 하 여 선호,-80 ° C에서 샘플을 동결 하 셔도 됩니다) 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 하 고.
    2. Tris HCl (10 m m, pH 8.5)에서 샘플을 다시 구성 하기 충분히 코트 샘플을 사용 하 여. 혈 청 무료 미디어 사용 (린스, 표준 24 잘 접시에서 당즉 사용 150-300 µ L) 하기 전에 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 2-3 번 샘플 린스.
      참고: Tris HCl 버퍼 및 혈 청 무료 미디어 (즉 DMEM, 그러나 어떤 기본적인 세포 배양 매체를 대체할 수) 낮추는 이온 H2O 혼자 치료 보다 SDS 처리 샘플의 세포 생존 능력에 대 한 영향에 더 효과적입니다.

2. 세제 무료 Decellularization 접근을 사용 하 여 샘플의 준비

참고:이 절차의 초기 단계 일치 단계 1.1-1.1.2 (위 참조).

  1. 5% (v/v) 표 백제 (NaClO)와 3% (w/v) 나트륨 중 탄산염 (NaHCO3) 솔루션을 준비 합니다. F. hispida 잎 샘플 잘라 뜨거운 접시에 감동 하면서 8 m m 디스크에 대 한 60-70 ° C에 증기 두건에서 솔루션을 따뜻한.
    참고: 중 탄산 나트륨 탄산 나트륨 (Na2CO3), 또는 수산화 나트륨 (NaOH)로 교체하실 수 있습니다. 원하는 온도 크게 (90 ° C로 실 온)에서 변화 하 고 사용 하는 샘플의 속성에 따라 조정 되어야 한다.
  2. 솔루션에는 원하는 온도 도달 하면, 일단 샘플 잠수함 하 고 그들을 손상 되지 않도록 교 반 속도 줄일 수 있습니다. 후 샘플 지워집니다 가시 (참조 그림 1B 시각적 비교를 위해), 목욕에서 신중 하 게 제거. 이온된 H2O 초과 표 백제 솔루션을 제거 하려면 1-2 분에 한 번 샘플을 품 어.
    참고: 샘플을 취소 하는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 예를 들어 전체 잎 또는 줄기 완전히 취소 하 고 열 탕에 시간이 걸릴 수 있습니다와 같은 컷된 파 슬 리 10-15 분, 두꺼운 또는 더 큰 샘플 동안에 지울 수 있습니다.
  3. 샘플을 lyophilize 하 고 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 합니다.

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Representative Results

두 방법 모두 굴복 건설 기계 세포 배양 및 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 적합 했다. 그림 1 세제 기반 메서드와 세제 없는 메서드에 대 한 컷된 샘플 (8 m m 직경)에 그대로 잎을 사용 하 여 decellularization 프로세스의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 무화과나무 hispida 조직 두 방법 모두 다음의 성공적인 decellularization 나왔고 명확 하 고 그대로 샘플 (그림 1A 및 1B). 그것은 전체 식물 조직 (그림 1A); decellularize 수 그러나, 작은 샘플을 빠르고 효과적으로 취소 등장. 세제-기반 접근 방식으로 관찰 잠재적인 문제 참여 비 이온 계면 활성 제 탕 (그림 1C)에서 조기 제거 결과로 이기종 decellularization. 세제 없는 방법의 단점은 온수 욕조 (그림 1D)에 연장된 보육 인해 손상이 발생할 수 있습니다.

두 방법 모두를 사용 하 여 준비 decellularized 장비의 기계적 특성으로 다른 연구24,34에 단축 인장 시험을 사용 하 여 조사 되었다. 이 테스트는 최대 탄젠트 계수 (MTM) (그림 2A), 실패 (SAF) (그림 2B)와 궁극 장력 강도 (UTS) (그림 2C) F. hispida 와 Pachira aquatica 샘플에 대 한 스트레인 나왔고. P. aquatica 샘플 두 decellularization 프로토콜을 사용 하 여 준비 매개 변수 측정의 모든 3에 걸쳐 유사한 기계적 특성을 표시 합니다. F. hispida 샘플 테스트는 UTS 제외 하 고 모든 경우에 비슷한 추세를 보였다. 특히, 세제 기반 (SDS) 프로토콜을 사용 하 여 준비 샘플 세제 무료 (표 백제) 방식으로 준비 보다 더 높은 평균 UTS 결과 했다. 이러한 결과 다른 식물에서 수집 된 샘플 뚜렷한 decellularized 비 계 속성 두 decellularization 프로토콜을 통해 준비 하는 때 생성 될 수 있습니다 보여 줍니다.

측정 하려면 DNA 제거, 샘플 했다 방법 중 하나를 사용 하 여 지워지고 그들의 게놈 DNA가 이전 설립된 프로토콜35를 사용 하 여 격리 된. 두 decellularization 방법 (세제 및 세제 무료) 크게 감소 2.47 샘플의 게놈 DNA 콘텐츠 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 0.18)와 2.71 조직의 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 1.60) 각각 (그림 2D). 비 decellularized 샘플 했다 104.67 조직의 DNA/mg의 ng (n = 3, s = 26.21) (그림 2D). DNA 콘텐츠 decellularization 표시 식물 세포의 효과적인 제거 후에 상당한 감소 중요.

두 개의 decellularization 방법의 세포 생존 능력에 미치는 영향 인간 피부 섬유 아 세포 (hDF) decellularized P. aquatica 필리핀 건설 기계 면 전에 서 2 일에 대 한 교양된의 신진 대사 활동을 측정 하 여 평가 되었다. hDFs 건설 기계 세제 기반 메서드 (그림 3A)를 통해 준비 대 세제 무료 메서드를 통해 decellularized의 경작 하는 때 더 높은 신진 대사 활동을 했다. 에 decellularization, 실험의 추가 설정 하는 동안 사용 하는 시 약의 철저 한 제거는 준비 된 건설 기계 씻 겨 광범위 하 게 세포 배양 전에 수행한 확인 합니다. 두 개의 별도 세척 방법 샘플 세제 기반 방식을 사용 하 여 준비에 시험 되었다: Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5)에서 세척 뒤 대 혈 청 무료 미디어에서 세척 2 세척 이온 H2o. 두 방법 모두 1 x PBS 최종 세척 단계 사용합니다. 이후 decellularized 공장 건설 기계에 노출 하는 포유류 세포에 미치는 영향 위와 같은 대사 활동 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 혈 청 무료 미디어 다음 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 이온된 H2O, 세제 무료에서 샘플에 비해 세제 기반 방식으로 처리 하는 샘플을 만들기에 비해 세포 대사 활동에 미치는 영향을 줄이기 위해 도움이 방법 (그림 3B)입니다.

그것은 이전 포유류 세포 세제 기반 접근25;를 사용 하 여 준비 하는 건설 기계에 성장할 수 있는 표시 했다 따라서, 그것은 이전 안 된 세제 무료 방법으로 준비 하는 샘플에 이것을 설명 하는 데 필요한 했다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) 시드 했다 비 계 당 20000 셀에서 F. hispida 잎 샘플 (8 m m 디스크) decellularized 고 24 h에 대 한 품 어 수. 이러한 건설 기계 했다 공업화 준수 촉진에 RGD 도파민 켤레와 셀 소개 하기 전에. 그림 4 는 전형적인 샘플에서 수집 된 이미지를 보여 줍니다. 밝은 분야 이미지 샘플 사용 (그림 4A)의 섹션의 전체 구조를 표시 하도록 수집 되었다. MSCs는 calcein를 사용 하 여 및 형광 현미경 (그림 4B) 몇 군데 얼룩이 했다. 이미지 (그림 4C)는 잎의 표면에 성장 하 고 있는 셀의 위치를 표시 하기를 중첩 후 했다.

Figure 1
그림 1 . Decellularization 식물 조직에 대 한 일반적인 워크플로입니다. 식물 조직 (세탁기 및 준비 단계는 유니버설);의 decellularization에 대 한 일반적인 워크플로 (A) 상위 경로 세제 무료 방법에 대 한 세제 기반 방법 (B) 하단입니다. F. hispida 잎의 비 이온 계면 활성 제/표 백제 목욕 (D) A 손상 decellularization에서 조기 제거로 인해 세제 기반 메서드를 사용 하 여 피 aquatica 잎의 (C)는 불완전/실패 decellularization 온수에서 장기간된 외피 때문 세제 무료 방법에서 솔루션을 표 백제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 기계적 성질 및 방법 사이 decellularization의 효과의 비교. ± SD; 의미 통계 분석 수행 했다 두 표본 t-검정 및 p 나열 된 값 어디 통계적 (작거나 보다 0.05)를 사용 하 여. F. hispida 의 샘플 및 P. aquatica (세제-기반 접근, 세제 무료, 대 한 빨강과 녹색 치료 샘플에 사용 되는 파란색 막대) 사이 기계적인 테스트의 비교 결과 (F. hispida 세제 기반 n = 4, 세제 없는 n = 2; P. aquatica 세제 자료 n = 3, 세제 무료 n = 4) (A) 최대 탄젠트 계수 (MTM) (B) 스트레인 실패 (SAF) (C)와 궁극 장력 강도 (UTS)에서. (D) A dsDNA 정량화 분석 결과 각 그룹에서 3 개의 샘플에 3 중에서 실행 되었다: 치료 (신선한, n = 3), 세제 무료 방법 (표 백제, n = 3) 및 세제 기반 방법 (SDS, n = 3), p 값은 decellularization 메서드 그룹 치료 샘플 그룹에 비해입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 두 개의 decellularization 메서드 간에 미치는 영향을 비교 하는 신진 대사 활동 분석 결과 결과. 의미 ± SD; 통계 분석 수행 했다 2-표본 t-검정을 사용 하 여 및 (작거나 보다 0.05) 통계적으로 중요 한 곳을 나열 된 p 값. 세포 대사 활동 P. aquatica 와 필리핀 (아무 샘플 추가 제어 웰 스도 정규화)의 종의 조직 샘플의 측정 했다 두의 대사 영향의 (A) 비교 표시 decellularization 메서드 (n = 3 각 그룹에 대 한) 및 (B) 비교 두 가지를 사용 하 여 신진 대사 활동에 대 한 영향의 세척 방법 세제 기반 프로토콜에서: Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5) 혈 청 자유로운 미디어와 결합 (n = 4) 대 이온 H 2 O (n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)의 표면에 성장 무화과나무 hispida 잎, RGD 도파민 켤레와 기능성된 decellularized. MSCs F. hispida 잎에 성장, 세제 무료 메서드에서 decellularized 되었고 RGD 도파민 공액 (바 참조에 대 한 추가 500 µ m 규모)와 기능성 decellularized 리프 (B의 섹션의 (A) 밝은 필드 이미지 ) Calcein의 형광 이미지 스테인드 MSCs 잎 표면 (C) 결합 된 밝은 분야 및 형광 이미지에 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기, decellularize 식물 조직에 두 가지 방법은 설명 합니다. 여기, 결과 나온 프로토콜 가능성이 있다는 제안25, 이전 연구 결과 함께 결합의 광범위에 적용 가능한 종 식물, 줄기와 잎에서 수행할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 공장 decellularization 대부분 실험실에서 실행 될 수 있다 그래서 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 그것은 주목할 만한 그 decellularization, 후에 건설 기계 해야 합니다 수 functionalized 포유류 세포 접착을 촉진 하기 위하여입니다. 포유류 세포 접착 및 조직 되어 식물에 성장 수 있도록 다른 기능화 기술 설명 다른25 현재 원고는 아닙니다 주제.

두 decellularization 프로토콜 여기 (그림 1)에서 마지막 단계는 그들의 성공에 중요 했다. 때 두 메서드 중 하나를 수행 할 하지 혼잡이 목욕 하는 것은 고르지 못한 개간 귀 착될 것 이다. 이러한 메서드는 전체 잎과 줄기;에 적용할 수 있습니다 그러나, 이것은 그들을 취소 하는 데 필요한 시간의 길이 증가. 지우고 전체 샘플에 걸쳐 일관성을 유지 하는 샘플 완전히 잠긴 다는 것을 확인 하십시오. 이상적으로, decellularization 구조적 손상을 최소화 하면서 가장 세포 물질의 식물 조직을 선택을 취소 해야 합니다. 그것은 원하는 견본으로 작동 하는 데 필요한 세제 무료 메서드를 수정할 수 있습니다. 목욕 온도 시간을 빨리 맑게 될 수 있습니다 하지만 또한 손상 될 수 있습니다 더 많은 샘플에 그들은 지나치게 incubated 있다면. 낮은 온도 이상 보육 시간 필요할 수 있습니다 그리고 더 깨지기 쉬운 샘플에 대 한 적절 한 될 것 이다. 표 백제 솔루션에서의 농도 또한 가속 또는 감속 decellularization 프로세스를 변경할 수 있습니다. 세제 없는 방법으로 사용 하기 위해 새로운 샘플을 테스트 것이 좋습니다을 시작 decellularization (이상적으로 15-20 분 간격)의 진행 상황에 대 한 목욕 온도 50-60 ° C의 자주 검사 때까지 그들은 적절 하 게 지워집니다. 이 온도 범위는 기술의 최적화 하는 동안 테스트 식물 종의 대부분에 의해 잘 용납 되었다. 완료 되 면, 샘플을 시각적으로 검열 될 수 있다 하 고 수동으로 그들이 하지-incubated 되었고로 irreparably 손상 되도록 것 표시 될 찢는 또는 목욕에서 제거 시 해체. 샘플 준비 하는이 접근을 사용 하 여 세포 성장에 영향을 감소 표시 ( 그림 3A참조)만 이온 H2o. 세척과 세제 기반 방식 보다 그러나, Tris HCl (10 m m, pH 8.5)와 또한 세척 및 민감한 애플리케이션에서 특히 혈 청 무료 미디어, 하는 것이 좋습니다.

세제-기반 (SDS) 메서드는 가능성이 대부분 식물 종에 적용 가능한 최소한의 물리적 동요를 요구 하기 때문에 전체 잎과 섬세 한 샘플을 지우기 위한 특히 유용. 위에서 설명 했 듯이, 마지막 단계는 샘플의 decellularization에 대 한 중요 한. 고유한 물리적 특성을 가진 샘플 비 이온 계면 활성 제 목욕에 보육 시간을 조정 하 여 지울 수 있습니다. 이 과정의 중요 한 결점은, decellularized 조직 수 있습니다 이후에 포유류 세포의 세포 대사 활동에 영향을 미칠 수 있는 사용 하 고, 세제의 흔적입니다. 따라서, 사용 하기 전에 철저 한 세척 단계는 권장 됩니다. 여기 샘플 혈 청 자유로운 미디어 다음 Tris HCl 버퍼 (10 m m, pH 8.5)로 씻어 그 이온 H2O (그림 3B)그들의 사용 하기 전에 보다 더 높은 세포 생존 능력 있다고 밝혀졌다.

저장할 때 나중에 사용에 대 한 치료 샘플 메서드 중 하나에, 그것은 손상 결과 건설 기계 영향을 수 없습니다 것을 보장 하기 위해 모니터링 하는 것이 중요. 손상 또는 과도 한 취 처리 뿐만 아니라 식물 조직의 변색으로 나타날 수 있습니다. 그들은 더 이상 유용 하기 전에 그들을 활용 하기 위하여 매주 샘플 모니터링의 삭제 해야 하는 것이 좋습니다. 손상의 개시 더 이상 지속 두꺼운 더 강력한 샘플 견본 종류 사이 변화 한다.

일반적으로, 식물 바이오의 잠재 근원으로 많은 약속을 잡으십시오. 이것은 그들의 자연스럽 게 개발 된 복잡 한 구조에 의해 강화 하 고 특성 그들 있도록 그들의 네이티브 환경에서 성장. 조직 공학 공중 발판으로 성공적인 활용 식물 조직 어렵고 비용이 많이 드는, 자주 설계, 생체 재료에 대 한 잠재적으로 저렴 한 대안을 제시 한다. 본질적으로 다양 한 종에서 다른, 식물 조직의 표면 지형은 직접 공간적 지향된 세포 성장25또한 밝혀 수 있습니다. 예를 들어 이전 연구는 인간의 세포에 응답 지형 신호 decellularized 식물25에 따라서 매우 조직적인된 패턴25셀 문화이 건설 기계를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 조직 공학에는 또 다른 기능은 드 노 보 perfusability입니다. 식물 조직 유체 수송에 매우 효율적으로 년의 수백만의 수백을 통해 진화 하 고 그들의 혈관 네트워크 효율적으로 끼얹는다24를 수 있습니다. 이 속성은 셀룰러 마이그레이션 및 임상 응용 프로그램에 대 한 대체 조직 만들기의 궁극적인 목표와 신생 가이드를 잠재적으로 사용할 수 있습니다. 이 높은 표면적과 상호 다공성 생체 세포 증식 하 고 이식 때 도움이 되는 증명 이전 연구의 결과 의해 지지는 vivo에서, 호스트 세포의 사용 안으로 마이그레이션 에 임 플 란 트36,,3738,39. 높은 표면적과 상호 다공성 또한 식물 조직40,,4142의 특징, 따라서 식물 파생 된 건설 기계는 주변 조직 와 통합 가능성이 vivo에서. 또한, 최근 연구 발견 decellularized 잎 성공적으로 셀24 끼얹는다 될 수 있다 인간 세포는 decellularized 식물 조직에 시드 했다 때 그들은 그들의 지형의 단서25일치. 언제 촬영된 모두 함께, 식물에서 파생 된 건설 기계 조직 엔지니어링 응용 프로그램으로 성공적으로 적용 될 필요한 속성 보유.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이이 프로젝트에 사용 된 표본 공급 Olbrich 정원의 존 Wirth 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 부분에서 지원 (G.R.G.에 R01HL115282) 국립 과학 재단 (J.R.G와 G.R.G.를 DGE1144804), 위스콘신 대학 외과 및 동문 기금 (H.D.L.). 이 작품 또한 일부 환경 보호 기구 (스타 그랜트 no. 83573701)에서 건강의 국가 학회 (R01HL093282-01A1 및 UH3TR000506), 그리고 국립 과학 재단 (IGERT DGE1144804)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

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References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

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생명 공학 문제 135 Decellularized 건설 기계 식물 조직 잎 줄기 perfusable 건설 기계 decellularization
Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법
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Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

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