Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Два метода для Decellularization растительных тканей для приложений, инженерия тканей

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57586
Automatic Translation
1, 2, 4, 4, 1, 2,3
1Department of Surgery, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin College of Engineering, 4Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Здесь мы представляем, и контраст двух протоколов используется для decellularize растительных тканей: подход на основе моющих средств и моющих средств свободный подход. Оба метода оставить позади внеклеточного матрикса в тканях растений используется, который затем может быть использован как строительные леса для ткани инженерных приложений.

Abstract

Аутологичные, синтетические и животных, полученных графтов, в настоящее время используется как строительные леса для замены тканей имеют ограничения из-за низкой доступности, плохое биосовместимость и стоимость. Ткани растений имеют благоприятные характеристики, которые делают их уникально подходит для использования в качестве лесов, таких как большую площадь поверхности, отличный водный транспорт и удержания, взаимосвязанных пористость, существующий сосудистой сети и широкий спектр механических Свойства. Здесь описываются две успешные методы decellularization завод для ткани инженерных приложений. Первый метод основан на стиральный порошок ванны для удаления клеточной материи, которая похожа на ранее установленные методы, используемые для очистки тканей млекопитающих. Вторая — это моющее средство бесплатно метод, адаптированный вариант протокола, который изолирует листьев сосудистую и предполагает использование подогревом отбеливателя и солевая ванна для очистки листья и стебли. Оба метода дают подмости с сопоставимыми механическими свойствами и низкой сотовой метаболические последствия, таким образом позволяя пользователю выбрать протокол, который лучше подходит для их предполагаемого применения.

Introduction

Тканевая инженерия появилась в 80-х годов для создания живых тканей заменителей и потенциально адрес существенных органов и тканей нехватки1. Одна из стратегий использовала подмостей стимулировать и направлять тела, чтобы регенерировать недостающие тканей или органов. Хотя производство подходы, такие, как 3-D печати дали подмости с уникальными физическими свойствами, способность производить строительные леса с разнообразными достижимых физических и биологических свойств остается задача2 , 3. Кроме того, из-за отсутствия функциональной сосудистой сети, эти методы были ограничены в регенерации 3-мерных тканей. Использование decellularized тканей животных и человека как строительные леса помог в обход этой проблемы4,5,6,7. Однако, высокая стоимость, партии партии изменчивость и ограниченная доступность может ограничить широкое использование decellularized животное помостами8. Есть также опасения по поводу потенциальной передачи болезни пациентов и иммунологические реакции на некоторые decellularized тканей млекопитающих9.

Целлюлоза, полученных из растений и бактериального происхождения, широко использовался для создания биоматериалов для широкого круга приложений в регенеративной медицине. Некоторые примеры включают: кости10,11, хряща12,13,14 и15ранозаживляющее. Строительные леса, которые состоят из целлюлозы имеют дополнительное преимущество в том, что они являются прочными и устойчивыми к разбивке mammalian клеток. Это связано с тем, что клетки млекопитающих не вырабатывают ферменты, необходимые для сломать молекулы целлюлозы. В сравнении подмости изготавливаются с использованием макромолекул из внеклеточного матрикса, таких как коллаген, легко разбиваются16 и не может быть хорошо подходит для долгосрочного применения. Коллаген строительные леса могут быть стабилизированы по химической сшивки. Однако существует компромисс из-за присущего токсичность сшивок, которые влияют на биосовместимость подмостей17. И наоборот целлюлоза имеет потенциал, чтобы оставаться на месте имплантации для длительных периодов времени, потому что он непроницаем для энзимной деградации клеток млекопитающих18,19,20. Это может быть изменено путем настройки скорость деградации через гидролиз предварительной обработки и Сопредседатель доставки леса с целлюлазы21. Биосовместимость decellularized завод производные целлюлозы леса в естественных условиях также было продемонстрировано в исследовании, проведенном на мышах22.

Через сотни миллионов лет эволюции растения имеют изысканный их структуры и состава для повышения эффективности жидкости транспорта и хранения. Завод сосудистой судов минимизировать гидравлическое сопротивление, ветвится на более мелкие суда, похож на млекопитающих сосудистую согласно Мюррея закон23. После decellularization поддерживается завода сложную сеть сосудов и взаимосвязанных поры. Учитывая огромное количество видов различных растений, которые легко доступны растительного леса имеют потенциал для преодоления ограничений разработки в настоящее время затрагивающих леса в ткани, инженерных24,25. Например Modulevsky et al. продемонстрировал, что ангиогенез и клеток миграции произошла decellularized яблоко ткани был имплантирован подкожно на задней части мыши22. Аналогично Gershlak et al. показал, что эндотелиальные клетки могут быть выращены в сосудистую decellularized листья24. В отдельном эксперименте Gershlak et al. также смогли показать, что cardiomyocytes можно выращивать на поверхности листьев и смогли контракта24.

Растения также включают сложную организацию от сотовой макроскопических масштабе, который трудно добиться даже с самых передовых методов производства, разработанных до сих пор. Сложных иерархических дизайн тканей растений делает их сильнее, чем сумма их избирателей26. Растения обладают множеством различных механических свойств, начиная от жесткой и жесткой компонентов, таких как стебли, гораздо более гибким и податливой, такие как листья27. Листья различаются в зависимости от вида с точки зрения размера, форма, нарушить прочность, степень васкуляризации и может иметь различные степени гидрофильность. В целом эти свойства растений показывают, что decellularized растения может служить уникальным и весьма функциональный медицинских устройств, включая как ткани, инженерные строительные леса.

Этот протокол фокусируется на два метода, decellularize растительных тканей, таких как листья и стебли, для использования в качестве строительных лесов в тканевой инженерии. Первый метод является методом на основе моющих средств, использующий серия ванн для удаления ДНК и клеточного материи, которая была адаптирована из широко используемый метод decellularize млекопитающих и растительных тканей6,22,25 ,28,29,30. Второй метод моющих средств-свободно и адаптирован из протокола «skeletonization», обычно используется для удаления мягких тканей листья31. Предыдущие работы показал, что кипячения листьев в растворе отбеливателя и бикарбонат натрия облегчает разделение сосудистую от окружающих мягких тканей31. Этот метод можно привести обратно к экспериментов, проведенных 17-й и18 веках, например работу Seba Альбертус32 и33Эдвард Пэрриш . Эти эксперименты, вокруг оставляя растительной массы, например, листья и плоды, погруженной в воду в течение длительного периода времени (недель до месяцев) и позволяя мягкие ткани разрушаться от естественно. Здесь «skeletonization» подход адаптирован для использования более мягких условиях, например, длиннее время инкубации при более низких температурах, чтобы удалить остатки клеточных и избежать значительно нарушить структуру мягких тканей. Для экспериментов, изложенных в настоящем документе, были использованы три вида растений: фикус hispida, Пахира водная и видов Гарциния. Описаны результаты количественной оценки ДНК, механических испытаний и влияние на клеточном метаболической активности от обоих методов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. decellularization растительной ткани, используя подход на основе моющих средств

  1. Используйте свежие или замороженные F. hispida, образцы листьев. Заморозить неиспользованный свежих образцов в морозильник-20 ° C и хранить для будущего использования (до года).
    Примечание: Использование стволовых или листовой ткани практически любого желаемого завода. Длительного хранения раз может привести к повреждению тканей.
    1. Определить размер и форма образцов для обработки на основе предполагаемого использования образца (т.е. образцы, порезать на полоски хорошо подходят для механического тестирования приложений, тем временем 8 мм диск образцы полезны в нескольких хорошо культивирования приложений ). Разрезать лист на 8 мм диски с биопсией острый, чистый удар в то время как под водой при комнатной температуре (20-25 ° C) деионизированная H2O.
      Примечание: Этот протокол может использоваться на весь листья и стебли. Однако небольшие образцы будут decellularize быстрее.
    2. Проинкубируйте образцы для 5-10 мин при комнатной температуре (20-25 ° C) деионизированная H2O на трясти плита набор для низкой скорости мойте или растопить их. Используйте достаточно дейонизированной H2O чтобы убедиться, что все образцы тщательно смоченные.
  2. Подготовить раствор 10% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS) в дейонизированной H2O. место образцы в подходящую емкость (стеклянные или пластиковые блюдо идеально) и добавить SDS решение полностью покрывают образцы. Проинкубируйте образцы на 5 дней при комнатной температуре (20-25 ° C) на множестве пластины трясти на низкой скорости для предотвращения повреждения образцов.
    Примечание: Не переполнять контейнера, как это может замедлить процесс decellularization и привести к неравномерным лечение ИКБ. Во время этого шага образцы следует приобретать коричневый оттенок.
    1. После 5 дней замените решение SDS с дейонизированной H2O. инкубировать образцы для дополнительных 10-15 мин на пластину встряска для тщательно смойте любого остаточного решения SDS.
  3. Подготовьте 1% (v/v) неионных ПАВ в раствор отбеливателя 10% (v/v). Чтобы сделать 500 мл раствора, смешать 5 мл неионных ПАВ с 50 мл отбеливателя, а затем добавить 445 мл дейонизированной H2O. Submerge образцы в свежеприготовленный раствор.
    Примечание: Неионных ПАВ/Блич решения не имеют длительный срок хранения, поэтому, должны быть использованы в течение 48 часов подготовки.
  4. Заменить неионных ПАВ/отбеливатель решение каждые 24 ч до тех пор, пока образцы полностью очищен (см рис. 1A для визуального сравнения). Затем инкубации образца в дейонизированной воде на плите трясти за 2 мин чтобы смыть излишки неионных ПАВ/отбеливатель решение. Установите пластину трясти низкое значение для предотвращения повреждения образцов.
    Примечание: Время, необходимое для очистки образцов, используемых варьируется, в зависимости от типа и вида растений. Полное обесцвечивание образцов свидетельствует о полной decellularization (выполнять ДНК количественной оценки для обеспечения тщательной очистки).
    1. Lyophilize образцы для их хранения до одного года (flash, замораживания, с использованием жидкого азота является предпочтительным, замораживание образцов в-80 ° C приемлемо) и хранить их при комнатной температуре (20-25 ° C) в условиях низкой влажности.
    2. Восстановить образцы в Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) с использованием достаточно пальто образцы. Промывайте образцы 2 - 3 раза в сыворотке свободных СМИ, аккуратно с помощью микропипеткой перед использованием (т.е. использование 150-300 мкл на полоскание, в стандартных 24 хорошо пластины).
      Примечание: Буфер Tris-HCl и сыворотки свободных средств массовой информации (т.е. DMEM, но любой основной клеточной культуры, которую средства массовой информации может быть заменен) являются более эффективными в снижении воздействия на жизнеспособность клеток SDS лечение образцов, чем те, которые относились с дейонизированной H2O только.

2. подготовка проб с использованием моющих средств бесплатная Decellularization подход

Примечание: Первые шаги этой процедуры совпадают с шаги 1.1-1.1.2 (см. выше).

  1. Подготовьте 5% (v/v) bleach (NaClO) и 3% (w/v) раствор бикарбоната натрия (3NaHCO). Теплый раствор в вытяжного шкафа до 60-70 ° C для образцов листьев F. hispida , разрезать на 8 мм диски помешивая на горячей плите.
    Примечание: Бикарбонат натрия может быть заменен с карбонатом натрия (Na2CO3), или гидроокиси натрия (NaOH). Желаемая температура колеблется значительно (от комнатной температуры до 90 ° C) и должны быть скорректированы с учетом свойств образцов, используемых.
  2. Как только решение достигает желаемой температуры, опускайте образцы и уменьшить перемешивания скорость, чтобы избежать их повреждения. После того, как образцы заметно очищаются (см. рис. 1B для визуального сравнения), осторожно извлеките из ванны. Проинкубируйте образцы раз в дейонизированной H2O для 1-2 мин удалить избыток отбеливатель решение.
    Примечание: Время, необходимое для очистки образцы могут широко варьироваться. Например вырезать петрушки может быть очищен в 10-15 мин, пока толще и/или больших образцов, таких, как целом листья или стебли могут принять часы в высокой температуры ванны, чтобы полностью очистить.
  3. Lyophilize образцы и хранить их при комнатной температуре (20-25 ° C) в условиях низкой влажности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оба метода принесли лесов, которые были пригодны для культуры клеток и тканей, инженерных приложений. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс decellularization, используя нетронутыми лист для метода на основе моющих средств и вырезать образцы (диаметром 8 мм) для моющего средства, свободной метод. Успешное decellularization фикус hispida тканей после обоих методов дали четкие и сохранности проб (рис. 1A и 1B). Можно было decellularize всего растительных тканей (рис. 1A); Однако небольшие образцы, как представляется, быстрее и более эффективно. Потенциальная проблема с подходом на основе моющих средств участвует гетерогенных decellularization результате преждевременное удаление из ванны неионных ПАВ (рис. 1 c). Недостатком моющего средства, свободной метод является, что повреждения могут произойти из-за длительного инкубации в водяная баня (рис. 1 d).

Механические свойства decellularized леса, подготовлен с использованием обоих методов были исследованы с помощью однонаправленного испытания на растяжение, как это было сделано в других исследованиях24,34. Это тестирование принесли максимальную касательной модуль (MTM) (рисунок 2A), напряжение на провал (СВС) (рис. 2B) и предел прочности на растяжение (UTS) (рис. 2 c) для образцов F. hispida и Пахира водная . P. aquatica образцов, приготовленных обоих протоколов decellularization отображается аналогичные механические свойства во всех трех измеряемых параметров. F. hispida образцов показал аналогичная тенденция во всех случаях за исключением ОТС испытания. В частности образцы, подготовлен с использованием моющих средств-протокол на основе (SDS) были выше средний ОТС результаты чем те, которые подготовлены с моющим средством бесплатно (Bleach) подход. Эти результаты показывают, что образцы, собранные из различных видов растений может производить собственный decellularized леску свойства при подготовке через два decellularization протоколы.

Чтобы измерить удаления ДНК, образцы были очищены с помощью либо метода и их геномной ДНК был изолирован с помощью ранее установленного протокола35. Оба decellularization методы (на основе моющих средств и моющих средств бесплатно) значительно сократилось содержание геномной ДНК образцов 2,47 нг ДНК/мг (n = 3, s = 0,18) и 2.71 нг ДНК/мг ткани (n = 3, s = 1,60) соответственно (Рисунок 2D). Non-decellularized образцы имели 104.67 нг ДНК/мг ткани (n = 3, s = 26.21) (Рисунок 2D). Значительное уменьшение содержания ДНК после decellularization указывается эффективное удаление растительной клетки вопрос.

Влияние на жизнеспособность клеток двух методов decellularization оценивалась путем измерения метаболической активности дермального фибробластов (ХДФ) культивировали в течение 2 дней при наличии decellularized P. aquatica или Гарциния подмостей. hDFs был выше метаболической активности, когда культивированный присутствии подмостей, decellularized через моющего средства, свободной метод против тех, кто готов через метод на основе моющих средств (рис. 3A). Чтобы убедиться, что тщательное удаление реагентов, используемых во время decellularization, дополнительный набор экспериментов была выполнена, в котором подготовлены леса были широко промывают до культуры клеток. Два отдельных Стиральная методы были протестированы на образцах, подготовлен с использованием подхода на основе моющих средств: мыть в буфер Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) следуют мыть в сыворотке крови свободных средств массовой информации против 2 стирок в дейонизированной H2O. Оба подхода используется окончательной стирки шаги с ПБС. Воздействие на клетки млекопитающих, впоследствии подвергается decellularized завод подмости была измерена с помощью же assay метаболической активности как указано выше. Буфер Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) следуют сыворотки свободные средства массовой информации помогла уменьшить влияние на сотовой метаболической активности, по сравнению с дейонизированной H2O, делая образцы, получавших сопоставимы образцы из моющих средств свободный подход, основанный на моющего средства метод (рис. 3B).

Ранее было показано, что клетки млекопитающих может вырасти на подмостки, подготовлен с использованием подхода на основе моющих средств25; Поэтому было необходимо продемонстрировать это на образцах, подготовленный ранее непроверенных моющего средства, свободной метод. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) были посеяны на decellularized F. hispida лист образцов (8 мм диски) в 20 000 ячеек на эшафот и разрешено инкубировать в течение 24 ч. Эти леса были функционализированных до введения клеток с пероксидазой РГД-допамина для облегчения присоединения. Рисунок 4 иллюстрирует изображений, собранных из типичного образца. Светлые области изображения была собрана показать общую структуру раздела используется образец (рис. 4A). MSCs окрашивали с помощью Флуорексон и образы с флуоресцентным микроскопом (рис. 4В). Изображения были затем накладывается (рис. 4 c) для отображения местоположения растущих клеток на поверхности листа.

Figure 1
Рисунок 1 . Общий рабочий процесс для decellularization растительных тканей. Типичный рабочий процесс для decellularization растительных тканей (мытье и подготовительные шаги являются универсальными); (A) Топ пути предназначен для нижней метод на основе моющих средств (B) для метода моющих средств бесплатно. (C) неполный/сбой decellularization P. aquatica листа с помощью метода на основе моющих средств из-за преждевременное удаление от баня (D) A поврежден decellularization неионных ПАВ/Блич F. hispida листа из-за длительного инкубации в раствор с подогревом отбеливателя в методе моющих средств бесплатно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Сравнение механических свойств и эффективности decellularization между методами. Означает ± SD; Статистический анализ был проведен с использованием двухвыборочный t тест и p приведенные значения где статистически значимой (меньше или равно 0,05). Сравнение механических испытаний результаты между образцами F. hispida и P. aquatica (синие столбики для подхода на основе моющих средств, красный для моющих средств бесплатно и зеленый для необработанных образцов) (F. hispida моющих средств на основе n = 4, моющее бесплатно n = 2; P. aquatica моющих средств база n = 3, моющее средство бесплатно n = 4) (A) максимальная касательной модуль (MTM) (B) напряжение на провал (СВС) (C) и конечная прочность на растяжение (ОТС). (D) A dsDNA квантификация assay был запущен в трех экземплярах на трех образцах из каждой группы: неочищенные (свежие, n = 3), моющих средств, свободной метод (отбеливатель, n = 3) и метод на основе моющих средств (SDS, n = 3), p значений для метода decellularization Группа по сравнению с необработанными образца группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Метаболическая активность пробирного результаты, сравнивая влияние между этими двумя методами decellularization. Означать ± SD; Статистический анализ был проведен с использованием двухвыборочный t тест и перечисленные где статистически значимые значения p (меньше или равно 0,05). Клеточных метаболической активности измерялась при наличии образцы тканей как P. aquatica , так и видов гарцинии (нормализованное для контроля скважин с не образца добавлен) для отображения (A) сравнение метаболические влияния двух decellularization методы (n = 3 для каждой группы) и (B) Сравнение влияния для метаболической активности с использованием двух методов в протокол на основе моющих средств: буфер Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) в сочетании с сыворотка свободные средства массовой информации (n = 4) vs. деионизированная H 2 O (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Мезенхимальных стволовых клеток (МСК), растущие на поверхности decellularized лист фикуса hispida , функционализированных с РГД-допамина конъюгата. MSCs были выросли на листьях F. hispida , decellularized методом моющего средства бесплатно и функционализированных с РГД-допамина конъюгата (500 мкм шкала баров были добавлены для справки) изображение ярко поля (A) раздела decellularized листа (B ) Флуоресценции образ Флуорексон окрашенных MSCs, растущих на лист поверхности (C) Merged яркое поле и флуоресценции изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь описываются два метода, decellularize растительных тканей. Результаты, представленные здесь, в сочетании с результатами предыдущих исследований25, показывают, что протоколы выдвинули, вероятно, применимые к широкому спектру видов растений и может быть выполнена на стебли и листья. Эти процедуры просты и не требуют специального оборудования, поэтому decellularization завод может осуществляться в большинстве лабораторий. Примечательно, что после decellularization, подмостей должны быть функционализированных содействовать адгезии клеток млекопитающих. Различные функционализации методы позволяющие адгезии клеток млекопитающих и роста растений, тканей были описано в других разделах25 и не тема по текущей рукописи.

Последним шагом в обоих decellularization протоколы представленные здесь (рис. 1) имеет решающее значение для их успеха. При выполнении либо метод не переполнять баня как это приведет к неравномерным очистки. Эти методы могут применяться к весь листья и стебли; Однако это увеличит продолжительность времени, необходимого для их очистки. Убедитесь, что образцы погружали полностью держать очистки последовательно на протяжении всей выборки. В идеале decellularization следует очистить растительных тканей самых клеточной материи при сведении к минимуму структурного повреждения. Вполне вероятно, что моющее средство, свободной метод может быть изменен при необходимости работать с желаемой образцов. Более высокие температуры ванна может привести к быстрее очистка раз однако может также привести к больший ущерб образцам, если они являются чрезмерно коммерсантам. Низких температурах может потребоваться более длительное время инкубации и целесообразно для более хрупких образцов. Концентрация отбеливателя в решении можно также изменить для ускорения или замедления процесса decellularization. При тестировании новых образцов для использования с методом моющих средств бесплатно, мы рекомендуем начать с ванны температура 50-60 ° c с частые проверки хода decellularization (в идеале каждые 15-20 минут) до тех пор, пока они будут надлежащим образом очищены. Этот диапазон температур хорошо переносится большинством видов растений, которые были опробованы во время оптимизации техники. После завершения образцы могут быть проверены визуально и вручную для обеспечения, чтобы они не были чрезмерно инкубировали и непоправимо повреждены как будет указываться срывать или дезинтеграции после удаления из ванны. Образцы, подготовлен с использованием этого подхода Показать уменьшению воздействия на рост клеток (см. рис. 3а) чем подход на основе моющих средств с только стирка в дейонизированной H2O. Однако рекомендуется дополнительно промыть трис-HCl (10 мм, рН 8,5) и сыворотки свободных средств массовой информации, особенно в чувствительных приложений.

Метод на основе моющих средств (SDS) вероятно применимы для большинства видов растений и особенно полезен для очистки весь лист и тонкие образцы, потому что он требует минимальной физической агитации. Как упоминалось выше, последний шаг имеет решающее значение для decellularization образцов. Образцы с различных физических свойств может быть очищен путем корректировки время инкубации в ваннах неионных ПАВ. Значительным недостатком этого процесса является, что decellularized тканей может содержать следы моющих средств используются, которые впоследствии могут влиять сотовой метаболической активности клеток млекопитающих. Таким образом шаги тщательно мыть рекомендуется перед использованием. Здесь было установлено, что образцы, промывают буфера Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) следуют сыворотки свободных СМИ был выше жизнеспособность клеток, чем те, промывают деионизированная H2O перед их использованием (рисунок 3B).

При хранении необработанных образцов для будущего использования в любом методе, важно контролировать их за ущерб для обеспечения, что не повлияет результирующий подмости. Ущерб может отображаться как обесцвечивание растительных тканей, а также трещин или чрезмерного хрупкости при обработке. Рекомендуется контролировать образцы на еженедельной основе, с тем чтобы использовать их, прежде чем они больше не являются полезными и должны быть удалены. Наступления ущерба варьируется между типами образца, с толще более надежные образцы длится дольше.

В целом растения очень перспективны как потенциальный источник биоматериалов. Это подкрепляется их естественно развитых сложные структуры и характеристик, которые помогают им расти в их родной среде. Успешное использование растительных тканей как ткани инженерные строительные леса предлагает потенциально дешевой альтернативой дорогостоящим и часто трудно разработать, биоматериалов. Топографии поверхности тканей растений, которые по своей сути варьируется от одного вида к другому, также могут быть использованы для прямой пространственно ориентированной клеточного роста25. Например предыдущее исследование показало, что клетки человека реагировать топографических сигналы на25decellularized растения, таким образом что эти леса может использоваться для культуры клеток в высоко организованных структур25. Еще одна особенность, которая является желательным в тканевой инженерии является perfusability de novo . Ткани растений развивались на протяжении сотен миллионов лет, чтобы быть чрезвычайно эффективным в жидкости транспорта, и их сосудистой сети могут быть эффективно перфузии24. Это свойство может потенциально использоваться для руководства клеточной миграции и ангиогенез с конечной целью создания замены тканей для клинического применения. Это подкрепляется результаты предыдущих исследований, которые продемонстрировали, что биоматериалов с большой площадью поверхности и пористости в взаимосвязанные способствует пролиферации клеток и когда имплантированные в естественных условиях, включить внутренней миграции клеток хозяина в имплантат36,37,,3839. Большую площадь поверхности и взаимосвязанных пористости также являются отличительной чертой растений тканей40,,4142, таким образом растительного леса имеют потенциал для интеграции с окружающих тканей в естественных условиях. Кроме того недавние исследования показали, что decellularized листья могут быть успешно увлажненную с клетки24 и что когда клетки человека были посеяны на decellularized растительных тканей, они соответствуют их топографические подсказки25. Когда приняты все вместе, растительного леса обладают необходимые свойства успешно применяться к ткани, инженерных приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Джона Wirth Ольбрих садов за любезное предоставление образцы, используемые в этом проекте. Эта работа частично поддерживается национальный сердца, легких и крови института (R01HL115282 G.R.G.) Национальный научный фонд (DGE1144804 J.R.G и G.R.G.) и университета штата Висконсин Департамент хирургии и выпускников фонда (H.D.L.). Эта работа также поддержали частично агентства по охране окружающей среды (Грант № 83573701 звезда), национальные институты здравоохранения (R01HL093282-01A1 и UH3TR000506) и Национальный научный фонд (IGERT DGE1144804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium dodecyl sulfate Sigma Life Science 75746-1KG
Triton X-100 MP Biomedicals, LLC 807426 Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) Clorox Item #: 31009 Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate Acros Organics 217120010 Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch HealthLink 15111-80 Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table Stovall Life Sciences BDRAA115S Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate Fisher Scientific Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker Any Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
DMEM Corning MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay Life Technologies P11496 Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Tags

Биоинженерия выпуск 135 Decellularized леса тканей растений листья стебли perfusable леса decellularization
Два метода для Decellularization растительных тканей для приложений, инженерия тканей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak,… More

Adamski, M., Fontana, G., Gershlak, J. R., Gaudette, G. R., Le, H. D., Murphy, W. L. Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications. J. Vis. Exp. (135), e57586, doi:10.3791/57586 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter