Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Follikel in kultivierten Eierstöcken von jungen Mäusen ohne seriellen Schnitt zu quantifizieren. Mit ganzen Organs Immunfluoreszenz und Gewebe löschen, wird körperliche Schneiden mit optischer Schnitt ersetzt. Diese Methode der Probenvorbereitung und Visualisierung Orgel Integrität bewahrt und automatisierte Quantifizierung bestimmter Zellen erleichtert.
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Methodenartikel
Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Forschung auf dem Gebiet der Säugetier-Reproduktionsbiologie umfasst oft die Auswertung des Gesamtzustand der Eierstöcke und Hoden. Insbesondere bei Frauen, Eierstöcke Fitness oft bemisst sich durch Visualisierung und Quantifizierung der Follikel und Eizellen. Da der Eierstock eine undurchsichtige dreidimensionale Gewebe ist, erfordern traditionelle Ansätze mühsam Schneiden des Gewebes in zahlreichen Schnittserien um Zellen im ganzen das ganze Organ sichtbar zu machen. Darüber hinaus da Quantifizierung von dieser Methode in der Regel nur eine Teilmenge der in den Abschnitten, die getrennt von der ungefähre Durchmesser eine Eizelle erzielte umfasst, ist es anfällig für Ungenauigkeit. Hier wird ein Protokoll beschrieben, die stattdessen nutzt ganze Organ Gewebe Clearing und Immunfluoreszenz-Färbung der Maus Eierstöcke Follikel und Eizellen zu visualisieren. Im Vergleich zu traditionellen Ansätzen, dieses Protokoll ist vorteilhaft für die Visualisierung von Zellen innerhalb des Eierstocks aus vielerlei Gründen: 1) der Eierstock bleibt im gesamten Probenvorbereitung und Verarbeitung; (2) kleine Eierstöcke, die schwer zu Abschnitt sind, können mit Leichtigkeit untersucht werden; (3) zellulären Quantifizierung wird leichter und genauer erreicht; und 4) das gesamte Organ abgebildet.
Einleitung
Um die zelluläre Zusammensetzung und morphologischen Merkmale von Säugetieren Eierstöcke zu studieren, setzen Wissenschaftler oft auf in Vivo Experimente gefolgt von immunohistologische Anfärbung der Eierstöcke Paraffin eingebettet. Vor kurzem, obwohl ganze Eierstock Orgel Kultur erwiesen hat eine effektive Alternative zu eierstockfunktion1,2,3,4 zu studieren, weil die Technik mit besseren Visualisierung gekoppelt werden kann und Quantifizierung Werkzeuge. Traditionell, hängt Analyse der Eierstöcke Morphologie von Rekonstruktion dre....
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Protokoll
Cornell University institutionelle Animal Care and Verwendung Committee (IACUC) hat alle Methoden, die hier beschrieben wird, in 2004-0038-Protokoll zu JCS zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien
- Wischen Sie der Arbeitsbereich mit 10 % Bleichmittel reinigen und lassen Sie das Bleichmittel auf die Arbeitsfläche Bereich mindestens 5 min lang zu bleiben. Entfernen Sie nach 5 min das überschüssige Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 % Ethanol (EtOH). Reinigen der sezierenden Mikroskop gründlich mit 70 % EtOH.
Hinweis: Es ist wichtig, dass der Arbeitsbereich mindestens Semi-zur Vermeidung von Kontamin....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll enthält 6 große Schritte folgen Dissektion der Eierstöcke, wie in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 , Abbildung 3 , Abbildung 4 markieren Sie die neuen Features dieses Protokolls, die Optimierung des Gewebes clearing für Eierstöcke und ganze Gewebe Eizelle Quantifizierung mit Fidschi-ImageJ enthalte.......
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Diskussion
Das Studium der Säugetier-Wiedergabe erfordert verwenden und Quantifizierung von spezialisierten Zellen, die nicht routinemäßig Zellkultur zugänglich sind. Ex-Vivo -Kultur-Systeme sind jedoch wirksam am Eierstock und Follikel Lebensfähigkeit1,15beibehalten. Während der Eierstock Kultur erfordert das Gewebe eine größere Fläche für den Austausch von Nährstoffen durch Diffusion. Also, 5 - Tage alten Maus Eierstöcke eignen sich in Größe und Form für Orgel-Ku.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken Rebecca Williams und Johanna Dela Cruz von der Cornell-BRC-Imaging und Andrew Recknagel für Anregungen und technische Hilfe. Diese Arbeit wurde auf der National Institutes of Health Zuschuss unterstützt S10-OD018516 (an Cornells Imaging Facility), T32HD057854, J.C.B und R01-GM45415, J.C.S.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mikro-Präparierschere 4,5", gerade, scharfe Spitzen | Roboz | RS-5912 | Mikro-Präparierschere |
| Juwelier-Pinzette 4-3/8", Stil 5 | Integra Miltex | 17-305X | Zange mit feiner Spitze |
| Mikro-Irisschere 4", gerade, scharfe Spitzen | Integra Miltex | 18-1618 | Mikro-Präparier-Irisschere oder Mikro-Präparierfederschere |
| 1X Minimal Essential Media (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11090-081 | |
| Fötales Rinder-Serium | Corning | 35011CV | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum (100X) | Gibco | 15240062 | verwendet in Schritt 1.3.1 |
| 35 mm Gewebekultur behandelte Schale | Corning | 430165 | |
| Nunc&Handel; 24-Well-Trägerplatte für Zellkultureinsätze | ThermoFisher Scientific | 141006 | Porengröße: 8 μm; m |
| Paraformaldehyd (PFA) | Elektronenmikroskopie Sciences | 15710 | 16%ige Lösung |
| 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 10010023 | |
| Nutatormischer GyroTwister™ | Labnet | S1000-A-B | dreidimensionaler Shaker |
| Normales Ziegenserum | VWR | 103219-578 | |
| Rinderserumalbumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| Natriumazid (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002-25G | |
| Natriumborhydridlösung (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452904-25ML | Verwenden Sie die Lösung anstelle der Tabletten- oder Pulverform |
| Polyvinylalkohol (PVA) | Sigma-Aldrich | P8136-250G | Kaltwasserlösliches |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | Polyethylenglykol tert-octylphenylether |
| Spritzenvorsatzfilter | ThermoFisher Scientific | 725-2520 | 25mm |
| 10mL Spritzen | BD | 309695 | |
| Maus Anti-p63 Antikörper (4A4) | Biocare Medical | CM 163A | Verdünnung 1:500 |
| Kaninchen Anti-MVH Antikörper | Abcam | ab13840 | Verdünnung 1:600 |
| Alexa Fluor® Ziegen-Anti-Maus 594 | ThermoFisher Scientific | A-11032 | Verdünnung 1:1000 |
| Alexa Fluor® Ziegen-Anti-Kaninchen 488 | ThermoFisher Scientific | A-11034 | Verdünnung 1:1000 |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| D-(-)Sorbitol | Sigma-Aldrich | 240850-100G | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012-100ML | |
| Harnstoff | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-5X10ML | |
| FIJI-ImageJ | Bildverarbeitungssoftware | ||
| Einweg-Transferpipetten aus Kunststoff | VWR | 414044-034 |
Referenzen
- O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence. Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).
- Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
