Diese Arbeit stellt eine Methode für die Herstellung von mikrofluidischen Droplet-basierten Plattformen und die Anwendung von Polyacrylamid Mikrosphären für Mikrosphären-PCR Verstärkung. Die Mikrosphären-PCR-Methode ermöglicht es, einzelsträngigen DNA-Amplifikate ohne Trennung doppelsträngige DNA zu erhalten.
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Methodenartikel
Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tröpfchen-basierte Mikrofluidik ermöglichen die zuverlässige Herstellung von homogenen Mikrosphären in den mikrofluidischen Kanal, Bereitstellung von kontrollierten Größe und Morphologie der erhaltenen Mikrosphären. Eine Mikrosphären copolymerisiert mit einer Acrydite-DNA-Sonde wurde erfolgreich hergestellt. Verschiedene Methoden wie asymmetrische PCR Exonuclease Verdauung und Isolation auf magnetische Beads Streptavidin beschichteten einsetzbar, einzelsträngiger DNA (SsDNA) zu synthetisieren. Jedoch verwenden nicht diese Methoden effizient große Mengen an hochgereinigtes SsDNA. Hier beschreiben wir eine Mikrosphären-PCR-Protokoll Details wie SsDNA effizient verstärkt und einfach durch Pipettieren von einer PCR-Reaktion-Röhre von DsDNA getrennt werden kann. Die Verstärkung der SsDNA kann als potenzielle Reagenzien für die DNA-Microarray und DNA-SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Prozesse angewendet werden.
Einleitung
Einzelsträngiger DNA (SsDNA) wurde ausgiebig als molekulare Erkennung Element (MRE) aufgrund seiner intrinsischen Eigenschaften für DNA-DNA Hybridisierung1,2berücksichtigt. Die Entwicklung von SsDNA synthetischer Systeme führt zu biologischen Anwendungen wie DNA-Microarrays3, Oligotherapeutics, Diagnostik und integrierte molekulare Erkennung basiert auf komplementäre Interaktionen4,5.
Bisher wurden erfolgreich Mikrometer-Skala Polymerpartikel mit mikrofluidischen Geräten demonstriert. Verschiedene Tec....
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Protokoll
(1) Herstellung einer PDMS mikrofluidischen Plattform
- Bereiten Sie 20 mL flüssige PDMS Prepolymer durch Mischen Basispolymer und Katalysator in einem Volumen-Verhältnis von 10:1. Gießen Sie 10 mL Flüssigkeit PDMS auf eine vorbereitete SU-8-Form auf einem Silizium-Wafer für den oberen Teil des Netzes mikrofluidischen. Gießen Sie für den unteren flachen Teil die gleiche Menge an flüssigem PDMS auf dem Siliziumwafer ohne Schimmel Struktur.
Hinweis: Das mikrofluidischen Netzwerk ist in einem CAD-Programm entwickelt und dann in einer Fotomaske umgewandelt, um ein Meister mit dem typischen Photolithographie-Prozess (siehe Ergänzende Zahlen) zu ....
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Ergebnisse
Die vorgefertigten Polymeren Droplet-basierte mikrofluidischen Plattform besteht aus zwei Schichten in PDMS (Abbildung 1a). Drei Arten von mikrofluidischen Channel-Netzwerke sind für die Erzeugung von Mikrosphären verwendet: (1) Flow-mit Schwerpunkt Geometrie wie in Abbildung 1 b, 2) eine serpentine Kanal für mixing-Lösung I und Lösung II und (3) eine Polymerisation Kanal für Mikrosphären gezeigt Erstarrung. Die Höhe aller Kanäle.......
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Diskussion
Verunreinigungen der DsDNA sind ein wichtiges Thema in SsDNA Verstärkung. Es bleibt schwierig, DsDNA Verstärkung in herkömmlichen asymmetrischen PCR Verstärkung15zu minimieren. Obwohl technische Verbesserungen für die Erzeugung von SsDNA uns zur Steigerung der Effizienz der Probendurchsatz aktiviert haben, ist darüber hinaus SsDNA Isolation aufgrund seiner hohen Kosten und unvollständige Reinigung Erträge nach wie vor problematisch.
Asymmetrische PCR ist eine der anspru.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Danksagungen
Diese Studie stützt sich auf ein Projekt mit dem Titel "kooperatives Forschungsprogramm für Agrarwissenschaft und Technologieentwicklung (Projekt Nr. PJ0011642) "finanziert durch die ländliche Entwicklung Verwaltung, Republik Korea. Diese Forschung wurde auch zum Teil durch einen Zuschuss (NRF-2017R1A2B4012253) des Basic Science Research Program durch die National Research Foundation (NRF) finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Zukunft planen, Republik Korea unterstützt. Diese Forschung wurde auch durch einen Zuschuss (N0000717) des Bildungsprogramm für kreative und industrielle Konvergenz gefördert durch das Ministerium für Handel, Industrie und Ene....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| flüssiges Polydimethylsiloxan, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Bestandteile des Chips |
| 40% Acrylamid:bis-Lösung (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Bestandteile aus copolymerisierbarer Oligo-Mikrosphäre |
| Ammoniumpersulfat, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Härter aus Acrylamid:bis-Lösung |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Katalysator von Ammoniumpersulfat |
| Mineralöl | Sigma Aldrich | M5904 | Tabelle 1. Lösung III. Bestandteil von Mikrosphärenreagenzien |
| Cy3-markierte komplementäre Oligonukleotidsonden | Bioneer | synthetisierte | Tabelle 3. Informationen zur Sequenz |
| ssDNA-Acrydit-markierte Sonde | Bioneer | synthetisierte | Tabelle 1. Lösung I. Bestandteil der Mikrosphärenreagenzien |
| Tris | Biosesang | T1016 | Bestandteile des TE-Puffers, pH-Pufferlösung |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Bestandteile des TE-Puffers, Entfernung von Ionen (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA-Amplifikation |
| Konfokalmikroskop | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifizierung der Oligonukleotid-Exposition von Mikrosphären-Oberflächenlichtmikroskop |
| Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Berechnung der Anzahl von Mikrosphären | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA-Amplifikation |
| Handheld Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Labor Corona Treater | Hydrophile Oberflächenbehandlung |
| Heizplatte | As eine | HI-1000 | Heizplatte zum Aushärten von flüssigem PDMS |
| Spritzenpumpe | kd Scientific | 78-1100 | Gleichmäßiger Fluss von Lösung I und Lösung II |
| Kompressor Kohands | KC-250A | Durchflussregelung von Lösung III | |
| Bright-Line Hämazytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Berechnung der Anzahl von Mikrosphären |
Referenzen
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatop....
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Nachdrucke und Genehmigungen
