Summary
Здесь мы продемонстрировать производительность модели минимальный спинного мозга травмы в взрослой мыши, что запчасти Центральный канал нишу жилья эндогенного нервных стволовых клеток (NSCs). Мы покажем, как нейросферы assay может использоваться для количественного определения активации и миграции окончательного и примитивных NSCs, после травмы.
Abstract
Нервные стволовые клетки (NSCs) в спинном мозге взрослых млекопитающих являются относительно mitotically покоя населения перивентрикулярной клеток, которые могут быть изучены в пробирке с помощью нейросферы assay. Этот assay, образуя колонии является мощным инструментом для изучения реакции NSCs экзогенных факторов в блюдо; Однако это может также использоваться для изучения эффекта в естественных условиях манипуляций с правильное понимание преимуществ и ограничений assay. Один манипуляции клинический интерес является эффект травмы на эндогенные НСК активации. Текущие модели спинного мозга обеспечивают вызов для изучения это как выраженность общих моделей ушиба, сжатия и перерезка вызывают разрушение НСК нишу на месте травмы, где находятся стволовые клетки. Здесь мы описываем минимальной травмы модель, которая вызывает локализованные повреждения на поверхности поверхностных Дорсолатеральное нижнего уровня (T7/8) грудного отдела спинного мозга взрослого мыши. Эта модель травмы запчасти Центральный канал на уровне травмы и позволяет анализ NSCs, которые находятся на уровне поражения в различные моменты времени после травмы. Здесь, мы покажем, как assay нейросферы могут быть использованы для изучения активации двух отдельных, линейный связанных, популяций NSCs, которые находятся в регионе перивентрикулярной спинного мозга-примитивных и окончательного NSCs (pNSCs и dNSCs, соответственно). Мы продемонстрируем изолировать и культуры эти NSCs от перивентрикулярной региона на уровне травмы и травмы сайт белого вещества. Наши послеоперационные спинного вскрытия показывают увеличение числа ПНШК и dNSC производные neurospheres из региона перивентрикулярной раненых по сравнению с элементами управления, выступая для их активации через травмы связок. Кроме того, после травмы, neurospheres, dNSC производные могут быть изолированы от места повреждения, демонстрируя способность NSCs мигрировать из их перивентрикулярной нишу сайты травмы.
Introduction
Центральной нервной системы содержит субпопуляции самостоятельного обновления, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые способны привести к возникновению всех различных Зрелые нейронных клеток типы1,2,3,4. Эти нервные стволовые клетки (NSCs) проживают в специализированных нишах в мозг и спинной мозг и может быть активирован после травмы размножаться, мигрировать и дифференцироваться в зрелых нервные клетки. Было показано, что NSCs и их потомства мигрируют к месту травмы в кортикальной травмы модели5,6. В головном мозге NSCs показали мигрировать из боковых желудочков на сайт травмы, где они дифференцируют в астроциты, которые способствуют глиальных шрам формирования7. В спинном мозге однако, было сделано несколько исследований спросить, если эти же эндогенных NSCs может быть использована для поощрения восстановления после травмы спинного мозга. Действительно в настоящее время дискуссии относительно того, требует ли активации стволовых клеток пула в спинном прямого физического ущерба перивентрикулярной ниши, накладки Центральный канал8 или если повреждения спинного шнур паренхимы (оставляя ствола клетки ниши нетронутыми) достаточно для того активировать эндогенного NSCs9.
Ряд моделей спинного травме (ТСТ) были использованы для изучения патофизиологии острые и хронические травмы. Эти модели также использовались для проверки потенциальных терапии для лечения SCI через нейропротекции, иммуномодулирующие и развивающихся клеток Трансплантация/замена стратегии10,11,13. Текущие модели включают в себя сжатие или ушиба травм, которые вызывают крупномасштабных функциональных дефицита, а также обширные поражения и кавитаций в шнур14,15. Результирующая глиальных шрамы могут охватывать несколько сегментов спинного мозга наряду с большинством ширина/окружности спинного16. Таким образом хотя эти модели являются клинически значимых, они могут позволить значительные проблемы для изучения реакции эндогенного NSCs после травмы. Существуют химические модели повреждений, которые могут быть адаптированы к привести к мягкой форм вреда, который может избавить Центральный канал17. Однако эти типы травм сосредоточить внимание на связанных с SCI демиелинизации и не являются клинически значимые модели для физические или механические повреждения, связанных с травматическим SCI.
Чтобы устранить ограничения текущей травмы моделей, мы адаптировали иглы трек минимальный SCI модель, первоначально разработанная в крыса9, для применения в модели взрослых мыши. Наша модель адаптирована травмы может создать последовательную поражением Дорсолатеральное региона спинного мозга мыши и запасных Центральный канал на Этажность травма. Преимуществом этой модели является, что она позволяет исследование кинетики НСК после травмы и их потенциальных радиальных миграции на сайт травмы. Использование мыши модели также допускает использование трансгенных мышей, которые позволяют линии отслеживания эндогенного NSCs и их потомства после травмы. Свойства NSCs, далее может оцениваться с использованием модифицированных формы в vitro нейросферы assay, который вводится в настоящем Протоколе.
Assay нейросферы является в vitro колонии формируя assay который позволяет изоляции NSCs присутствии митогенов. На клоновых обшивка плотности отдельных NSCs размножаться привести к свободно плавающего сферические колонии клеток, которые состоят из небольшой субпопуляции NSCs и подавляющее большинство прародителями18,19. В нашем протокол, мы демонстрируем изоляции двух отдельных, линейный, связанных с NSCs из региона перивентрикулярной спинного мозга — в исходных условиях и после нашей минимальной SCI модели. Окончательным нервных стволовых клеток (dNSCs) Экспресс Нестин и глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) и выращиваются в присутствии эпидермального фактора роста (EGF), фактор роста фибробластов (ФБП) и гепарина (совместно называемых EFH)20. Эти dNSCs являются редкими в наивно спинного мозга, что приводит к очень мало neurospheres в пробирке. Тем не менее мы показывают, что dNSCs активируются после минимальной SCI, расширение числа neurospheres, изолированных от региона перивентрикулярной21. Примитивные нервные стволовые клетки (pNSCs) вверх по течению от dNSCs в линии нервных стволовых клеток. pNSCs являются чрезвычайно редки, Ускоренная низкий уровень плюрипотентности маркера Oct4 и лейкемия ингибирующего фактора (LiF) реагировать22. pNSCs не образуют neurospheres при изоляции от спинного мозга взрослого мыши вследствие наличия основного белка миелина (MBP) в первичных культур; Однако, ПНШК neurospheres могут быть изолированы от MBP несовершенным мышей и их численность расширенного следующие травмы — похож на dNSCs21. Наконец мы покажем, что dNSC производные neurospheres могут быть изолированы от сайта травмы в начале раз после минимальной SCI. Эти результаты демонстрируют, что наша модель травмы и анализов можно оценить характеристики активации перивентрикулярной NSCs как их способность размножаться и мигрируют в ответ на травмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол был одобрен Комитетом уход животных в университете Торонто и в соответствии с «руководство для ухода и использования экспериментальных животных» (2nd издание, Канадский совет по лечению животных, 2017).
1. Минимальный спинного мозга Хирургия травмы
Примечание: До операции убедитесь, что все хирургические инструменты и материалы подвергаются стерилизации соответствующими методами (Рисунок 1A).
- Постройте грудной поддержки арка, засучив 4 – 5 квадратов марлей и лентой их вместе в середине, чтобы получить фиксированный рулон марли.
- Поместите указатель мыши в камере индукции и инициировать анестезии с 5% изофлюрановая. Подтвердите отсутствие мыс щепотку рефлекс прежде, а также на протяжении всей процедуры. Как операция может занять свыше 30 мин, оптимизируйте для минимальной изофлюрановая воздействия (5 мин на 5%) и оставшееся время на 2 – 3%.
- Передать мыши носовой конус, приложенный к анестезии машине в 2-3% изофлюрановая поддерживающей дозы. Использование машинки для стрижки волос для удаления меха из спинку животного от середины спины до шеи/уши, чтобы разоблачить широкой прямоугольной области кожи для хирургии.
- Передать стереотаксического инструмента мышь, поместив его нос в прилагаемый носовой конус и стабилизации черепа с уха баров. Сохранить изофлюрановая на 5% во время размещения уха баров и нижней обратно в 2-3% закрепив стереотаксического устройства мыши.
- Администрировать предоперационной болеутоляющие лекарства внутрибрюшинно — мелоксикам (2,0 мг/кг). Щедро примените смазывание глаз на открытых мыши глаза, чтобы предотвратить истощение роговицы под наркозом.
- Место грудной поддержки арки под живот мыши во время выпрямления мыши тело и позвоночника, слегка потянув на основании хвоста. Для защиты хвост и все расширенные конечностей в положении звезда как используйте лабораторной маркировки ленты. После того, как безопасные, нажимаем арку грудной поддержки рострально, от живота мыши к верхней грудной клетки — чтобы подпирать грудного отдела позвоночника (рис. 1B).
- Подготовьте стерильные хирургические поле, дезинфекция меха обрезан кожи области, подготовленные в шаге 1.3 с 70% этиловом спирте, следуют повидон йод. Повторите дважды. Примените стерильные хирургические Пелерина сохранить широкий стерильные поле.
- С помощью лезвие скальпеля #10, сделать вертикальный разрез параллельно продольной оси животного от медианы обеих лопаток кривизны грудного отдела позвоночника. Втягивать кожу, чтобы разоблачить мягких тканей и контур позвоночника (рис. 1 c).
- Определите нижнюю границу suprascapular жировой ткани (это разграничивает позвоночного уровня Т4/5). С же лезвие #10 тщательно, но с силой, разрезать вдоль обеих сторон позвоночной кости T5-T8/9 для отсоединения обратно мышечных сухожилий из столбца.
- Вставьте зубы ретракторы в разрез сайтов по обе стороны от позвоночника. Коррекцию экспозиции, развернув ретракторы достаточно поднять позвоночника не ставя слишком много напряжения в задвинутом мышечных слоях (рис. 1 d).
- Под микроскопом хирургические тщательно очистите остаточного мышцы и других мягких тканей, обволакивающие позвоночника подвергать позвоночной кости (Рисунок 1E). Идентифицировать позвонков, которые будут удалены clasping остистого отростка позвонка с зубчатым щипцами и переместив ее слегка вверх и вниз.
Примечание: Это должно разрешить идентификацию межпозвонковых суставов и подвергать небольшие отверстия (межпозвонковых отверстий) под позвонков интерес. - Вставьте обе стороны подвергаются межпозвонковых отверстий, хвостовой позвоночной пластинки к подакцизным, одна голова изогнутые ножницы притупляются и отрезать соединительный межпозвонковых суставов на двусторонней основе.
- Поднимите вверх пластинки и отрезать верхний вложение пластинки изолировать и удалить кости.
Примечание: Это будет подвергать нетронутой дурального мешка, содержащие спинного мозга (Рисунок 1F). Там может быть чрезмерное кровотечение, которые могут контролироваться путем размещения precut марлевый 1 см x 1 см на пострадавших районах и/или промыть стерильной PBS. - С спинной срединной вен, выступающей в качестве ориентира вставьте Дорсолатеральное поверхности спинного мозга (около 1 мм в глубину) на приблизительно 0,5 мм бокового по обе стороны от средней линии 45° коленчатого вала кончика иглой 30 G (с иглы наклона вверх).
- Перенести иглы ~ 2 мм из хвостового ростральной (параллельно средней) таким образом, чтобы по всей длине скос иглы вставляется шнур питания. Извлеките иглу, повторяя через путь входа (рис. 1 g).
Примечание: Там должно быть без кровотечения, но опухоль ткани спинного мозга может рассматриваться на данном этапе. - Чтобы закрыть рану, удалите втягивающего устройства и шов мышцы спины на обе стороны вместе в средней линии, с помощью 6-0 рассасывающиеся шовные травмы. Использование 4-0 шовный материал стерильный шелковые впоследствии закрыть вышележащих кожи.
- Применять мазь с антибиотиком в верхней части поверхностно зашивается кожи для профилактики послеоперационной инфекции, используя кончик ватным тампоном. Администрировать послеоперационные анальгетик 0,1 мг/кг бупренорфина подкожно наряду с жидкостями (1 мл раствора Рингер лактат).
- Выключите изофлюрановая испарителем и кислорода. Удалите мышь из стереотаксического устройства и место в чистой клетке не постельными принадлежностями.
- Поместите указатель мыши в клетке около 30 см от тепла лампы для восстановления от анестезии и контролировать поведение после пробуждения. Мыши должен проснуться в течение 5-10 мин и имеют функцию задние конечности с возможным парез или хвост слабость после пробуждения.
- Контролировать поведение мыши в течение следующих нескольких дней и обеспечить надлежащий послеоперационный уход и анальгетиков (т.е., маш, лактат Рингера раствор жидкости подкожной, 0,1 мг/кг бупренорфин 2 x в день подкожно за 2-3 дней и мониторинг надлежащего веса ) в соответствии правилам Фонд местных животных и на индивидуальной основе как восстановления могут отличаться.
2. нейросферы Assay рассечение
Примечание: Выполните процедуры надлежащего стерильные тканевой культуры во всем.
- Ферментативный раствора препарата
- Добавьте 32 мл из Эрл сбалансированный соли раствора (EBSS) альбумина ингибитор ovomucoid содержащий стеклянная бутылка и аккуратно водоворот до растворения.
- Добавьте 5 мл EBSS стекла флакона предварительно порционные папаин и место в ванну воды 37 ° C распустить. Решение станет ясно (решение 1).
- Возьмите 500 мкл EBSS и добавить предварительно порционные DNase что я стеклянный флакон для получения концентрации 1 мг/мл (решение 2). Очень осторожно перемешать, Наклонив флакон взад и вперед и 250 мкл этой смеси для решения 1.
Примечание: Все решения (решения 1 и 2) являются достаточно для обработки двух кусков ткани. Если обработка более кусочки ткани, размещения с более решения преп.
- Подготовка тканей и рассечение
- Лаборатория очистки пропитанной изофлюрановая в клетку мыши и разрешить 2-3 мин для паров для полностью анестезировать мыши. Следующие нокаут, удалите мышь из клетки и подтвердите отсутствие мыс щепотка рефлекс.
- Выполняйте шейки матки дислокации с тупым металлические предметы (например, металлической клетке card) чтобы усыпить животных. Спрей Усыпленных животных от своей шеи до середины спины, щедро с 70% этиловом спирте.
- В основании черепа используйте ножницы, чтобы отрезать голову и выбросите в сумку био. Сделайте срединной разрез в коже по всей длине спины подвергать мышц и позвоночной кости контур (рисунок 2A).
- Поднимите медиальной аспект каждой лопатки (т.е., лопатки — выявленные вышележащих жировой ткани) и используйте ножницы, чтобы вырезать мягких тканей (между лопатку и позвонков). Отдельные полностью предоставлять основные позвоночника.
- После искривления позвоночника вставьте же пару ножниц в верхней апертуры грудной и изолировать позвоночного столба, убирания прилагаемый ребра, мышц и внутренних органов (рис. 2B).
- Вставьте хвостового позвонков отверстия/открытие ножницы и вырезать межпозвонковых суставов по обе стороны пластинки (спинной поверхности). Возьмите особую осторожность, чтобы не повредить шнур нетронутыми. Продолжать этот процесс до желаемого уровня и/или подвергаются длина сетевого шнура.
- Аккуратно вырежьте spinal nerve(s) простирается латерально от шнур до передачи ткани спинного мозга в чашке Петри с регулярной искусственных спинномозговой жидкости. Держите образец на льду (рис. 2 c).
- Под микроскопом, рассечение сократить ткани спинного включить мм ~ 2 ростральной и каудально к месту травмы. Использовать две пары щипцами осторожно отделить шнур на 2 половинки продольно вдоль спинной и брюшной трещины (рис. 2 c').
- С microscissors вырежьте из раненых Дорсолатеральное белого вещества. Поместите кусок в 15 мл Конические трубки.
- Проведение одной половины спинного мозга вниз с щипцами, дразнить и удалить белого вещества, с помощью другой пары тонкой щипцов вдоль rostrocaudal степени спинного изолировать желаемого перивентрикулярной региона. Повторите для другой половины спинного мозга.
- Место кусков ткани перивентрикулярной в отдельном 15 мл конические трубы. Использование microscissors и мягко фарш ткани против стены конические трубы.
Примечание: Изменения ткани диссоциации являются папаин диссоциации системы протокол23 и ранее описанных ткани подготовки процедуры24. - Добавьте 2.5 мл нового решения 1 (шаг 2.1.3) образца ткани и поместите на рокер при 37 ° C за 30 мин.
- Аккуратно нарезанных ткань в растворе с кончиком пипетки 1000 мкл. Центрифуга суспензию облачно клеток на 300 x g 5 мин на RT.
- Подготовить раствор 3 с 2,7 мл Эрл сбалансированного солевого раствора, 300 мкл раствора ингибитор ovomucoid (шаг 2.1.1) и 150 мкл DNase I решения (шаг 2.1.3).
- Отменить супернатант от шаг (шаг 2.2.13) и Ресуспензируйте в 1,5 мл раствора 3 на предыдущем шаге (шаг 2.2.14).
- Слой этой новой суспензию клеток (шаг 2.2.15) на вершине 5 мл раствора ovoimucoid ингибитор (шаг 2.1.1) в новой 15 мл Конические трубки для создания градиента разрывными плотности. Центрифуга на 300 x g 5 мин на RT.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 2 мл neurobasal СМИ. Центрифуга на 300 x g 3 мин на RT.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл neurobasal средств массовой информации. Фильтр подвеска с помощью стрейнер ячейки 20 мкм, следуют 4 мл средств массовой информации для общего объема 5 мл.
- Покрытие
- Подготовить культуры СМИ для роста нейросферы, дополняя neurobasal СМИ с эпидермального фактора роста (20 нг/мл) / фактора роста фибробластов (20 нг/мл) / гепарина (2 мкг/мл) [для окончательного NSCs] или leukemina тормозящий фактор (10 нг/мл) [для примитивных NSCs]. Добавьте 10 мл либо СМИ в колбу 25 мл культуры ткани.
- Используйте Горяева и Трипановый синий краситель для вычисления числа клеток в суспензии (шаг 2.2.18)25. После вычисления, добавить клетки культуры ткани колбы в (шаг 2.3.1) подготовлен к клоновых плотность 10 клеток/мкл и место культуры ткани колбу с добавил клеток в инкубатор для 24 h (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2).
Примечание: Пример метода подсчета является следующим: принять 10 мкл суспензии клеток и перемешать с 10 мкл Трипановый синий краситель. Добавьте 10 мкл этой смеси в Горяева. В разделе 10 X световой микроскоп подсчитать количество живых клеток и сумма всех клеток, учитываются в пределах 4 4 x 4 квадрантах. Использовать формулу: 100000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1000] дать объем суспензии клеток, покрываемые в колбе тканевой культуры каждой 25 мл для обеспечения клоновых плотность (10 клеток/мкл). - После 24 часов аккуратно водоворот колбу и вылить содержимое в 15 мл Конические трубки. Центрифуга на 300 x g 5 мин на RT.
- Отменить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 – 2 мл свежего neurobasal СМИ.
- Повторите шаг 2.3.2 подсчитать количество ячеек в клетках подвеска и пластины на клоновых плотности в 24-ну культуры ткани пластины, содержащий 500 мкл их соответствующих Митоген дополнены СМИ (EFH для окончательного роста НСК) и ЛИФА для примитивных НСК роста.
Примечание: Используйте адаптированы формулу (5000 / [X клеток/4) x 2 x 10 x 1000) вычислить объем суспензии клеток, покрываемые в каждом хорошо содержащие 500 мкл средств массовой информации. - Поместите пластины, содержащие клетки в инкубатор (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2), чтобы расти в течение 7 дней.
- Подсчет
- После 7 дней в культуре удалите пластины и посмотреть под микроскопом света. Количественно neurospheres путем подсчета сферические колонии, которые > 80 мкм в диаметре для dNSCs культур и > 50 мкм в диаметре для pNSCs культур.
Примечание: При желании, neurospheres может быть далее пассированный26 или продифференцировано. Если клетки больше не нужны, распоряжаться путем добавления ускоренного перекиси водорода к скважинам (приблизительно 1 мл) для 20 мин так что цвет среды желтеет. Затем слейте.
- После 7 дней в культуре удалите пластины и посмотреть под микроскопом света. Количественно neurospheres путем подсчета сферические колонии, которые > 80 мкм в диаметре для dNSCs культур и > 50 мкм в диаметре для pNSCs культур.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После операции мышей должны испытывать минимальный моторного дефицита, которые могут включать хвост и возможных парез задних конечностей до 24 ч. После этого времени должны испытывать мышей не задних конечностей паралич и парез и минимальные изменения в походке.
Рисунок 3 показывает представитель результаты от нейросферы пробирного 5 дней после минимальной спинного мозга. Абсолютное число dNSC производные neurospheres (выращенных в EFH) больше, чем количество ПНШК производные neurospheres (выращенных в LIF) после травмы (Рисунок 3А и 3Б, соответственно). Изображения более высокого мощности окончательного нейросферы (рис. 3 c) и примитивных нейросферы (рис. 3D) выявить различия в появлении этих отдельных колоний с окончательным neurospheres, будучи больше в диаметре (≥80 мкм) и обычно Имея большой темный центр. Примитивные neurospheres меньше по размеру (≥50 мкм) и клетки более плотно упакованы. Представитель количество neurospheres, вытекающих из различных частей потерпевшего шнура видны в Рисунок 3E (стандартный) и 3F (примитивов). Рисунок 3E показывает, что минимальный SCI вызывает значительное увеличение в neurospheres, выращенных из центрального канала на уровне повреждения по сравнению с относительно незначительное увеличение в ростральной шнур ранены.
Интересно, что окончательное neurospheres могут быть сгенерированы из сайта поражения, региона, который не содержит нейросферы формируя клетки в одиночку мышей Ламинэктомия. 3F рисунок демонстрирует аналогичные увеличение pNSCs после травмы за исключением ПНШК neurospheres на месте поражения. Следовательно только dNSCs способны мигрировать на сайт травмы на этот раз курс после травмы.
Рисунок 1: хирургическая процедура. (A) макет все необходимые, пронумерованы для справки. (B) изображение указателя мыши в стереотаксического устройство с органа выпрямился, позвоночника и конечностей разложить и выявляется наряду с грудной поддержки арки помещен под. (C) A фотография мыши с вертикальный разрез, подвергая мышечный слой и контур позвоночника. (D) A картина тела мыши после мышечной разрезов и воздействия и изоляции позвоночника с втягивающими устройствами. Обратите внимание на тугой мышечные слои с отсутствием срывать. (E) A фотография изолированные мыши позвоночника с слоями мышц удалены, показаны костной поверхности позвонка (3 сегментов). Это также показывает остистого отростка и возможно межпозвонкового сустава и пластинки среднего позвонки удаляются. (F) A изображение после ламинэктомии видимой спинного мозга. Меткой является дорсальная срединной вен. (G) A фотография мыши с двусторонней иглой трек травм по обе стороны от дорсальной срединной вен. Существует макро Вставка 45° коленчатого вала иглой 30 G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: спинного диссекции. (A) A фотография обезглавленное мыши с разрезом кожи срединной подвергать мышц спины и позвоночной кости картина контурной (B) изолированные позвоночника, показаны ростральной и хвостовой ориентации. На втором снимке изоляции кабеля и третья показывает изолированных спинного мозга в чашке Петри. (C) A графическое представление тонкой рассечение спинного мозга, где удаляются и отделены для культивирования различных сегментов (лейкомаляция, травмы области). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель результаты от нейросферы пробирного после минимальной спинного. (A) количество dNSC производные neurospheres (выращенных в EFH) культивировали от потерпевшего спинного больше (B) количество ПНШК производные neurospheres (выращивают в LIF) когда покрытием в равной плотности. (C, D) Более высокие мощности образы «типичного» neurospheres в dNSC культур (C) и (D) ПНШК культур. (E) минимальный иглы тракта травмы приводит к значительному увеличению числа dNSC производные neurospheres от центрального канала на уровне травмы, а также центральный канал, Ростральные травмы и от места повреждения. ПНШК производные neurospheres (F) не может быть изолирована от ранен пуповины, но могут быть изолированы после травмы из центрального канала (на уровне повреждения и от ростральной центрального канала). Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В ходе хирургической процедуры есть несколько важных шагов, где исследователь должен уделять особое внимание для того, чтобы получить оптимальные результаты и минимизировать изменчивость между животными. Необходимо проявлять осторожность при ингаляционной анестезии (изофлюрановая) во время операции как анестетик было показано, что нейропротекторной эффекты с длительной экспозиции27. Соответственно при изучении регенеративной способностью спинного мозга после травмы, приложить усилия, чтобы выполнить операцию, как быстро и эффективно, насколько возможно, чтобы предотвратить смешанных переменных. Сохранение же время экспозиции изофлюрановая на мышь позволит снизить изменчивость. Частота дыхания мыши должны контролироваться на протяжении операции и не должно быть слишком медленно (менее 1 дыхание каждые 2-3 s) или сильно трудился (т.е., затрудненное дыхание). Доза поддержание анестезии может быть снижена от 2-3% для предотвращения смерти из-за длительной анестезии с запиской мышей, которые получил нижней дозирования.
Во время операции Проявляйте особую осторожность при выполнении мышечной разрезов по обе стороны от позвоночника. Убедитесь, что глубокие разрезы, и лезвие под углом медиально, таким образом, чтобы край лезвия упирается костлявые позвонков при мышечной разрез. Если лезвие под углом наружу, есть возможность чрезмерного кровотечения из сосудов сокращений. Исследователь должен также обратить особое внимание при выполнении Ламинэктомия избежать глубокой рыбалка ножницы, которая будет повреждения спинного мозга, вызывая повреждение нежелательных тканей и функциональные дефициты. Соответствующий элемент управления для этих экспериментов — «Ламинэктомия только» группа (никаких повреждений), которая позволит сравнение активации NSCs, приписываемые трек травмы иглы противоположность, которая может быть результатом только Ламинэктомия. Мы показали, что Ламинэктомия одиночку может привести к небольшой, хотя и незначительное увеличение НСК активации, как свидетельствуют увеличение числа нейросфера из перивентрикулярной региона на уровне поражения21. Ламинэктомия только не приводить к увеличению нейросферы чисел из региона перивентрикулярной ростральной или хвостовой для ламинэктомии и не neurospheres находятся в культурах белого вещества, изолированы на уровне Ламинэктомия. Кроме того при выполнении ламинэктомии, позаботьтесь, чтобы удалить спинной пластинки в один кусок для разрешения широкого воздействия шнура. Это будет (1) позволяют выполнять минимальные иглы трек травмы спинного мозга Дорсолатеральное достаточного доступа и (2) сегменты кости предотвратить остались позади и вторичного ущерба после закрытия и после восстановления движения мыши. Если весь пластинки не воспринимается как один кусок, или сегменты острые кости выступающих по обе стороны Ламинэктомия наблюдаются, используйте инструменты (например, зубчатый щипцы и изогнутые ножницы) чтобы удалить эти фрагменты до сшивания.
Исследователь должен быть очень осторожны при применении швы в мышечный слой во время хирургического закрытия. Одним швом (двойной узловатые) должны располагаться каудально к уровню Ламинэктомия/травмы таким образом, чтобы шов лежит на вершине нетронутыми позвоночной кости. Это необходимо для предотвращения любых вторичных повреждений, которые могут возникнуть в результате мышечный шов, находясь в контакте с подвергаются сетевой шнур, когда указатель мыши перемещается после восстановления. Кроме того мышечный шов хвостового Ламинэктомия/травмы действует как ориентир для где SCI была выполнена при изоляции спинного мозга для анализа. Следует позаботиться при рассекает вне области пострадавшим спинного избежать ущерба структуре пострадавшего региона, так что она может оставаться узнаваемым во время тонкой диссекция под микроскопом рассечения. Что касается нейросферы assay важно для выполнения механических Тритурация клеток окатышей осторожно, чтобы избежать производства воздушных пузырьков, которые могут увеличить гибель клеток. ПНШК производные neurospheres даже более чувствительны к тяжелой, условий роста мусора — чрезмерное Тритурация и длительное воздействие в ферментативных решения — по отношению к dNSC культур. ПНШК производные сферах более компактной и меньше, чем dNSCs. Учитывая редкость pNSCs, мы рекомендуем, изоляции по крайней мере 240 000 ячеек на сэмпл.
Минимальный SCI модель идеально подходит для изучения клеточных события после травмы (например, активации эндогенного NSCs), но он не разрешает исследования функциональными нарушениями. Как отмечалось ранее, мышей, которые оправиться от травмы трек иглы опыт не заметные поведенческих дефициты, которые сохраняются и как таковой, не может оцениваться мышей для эффективности терапевтических мероприятий, предназначенных для улучшения функциональных результатов. Одним из важных аспектов регенеративной медицины является, что лечение следует не только содействовать репарации тканей, (которые могут быть оценены с помощью этой модели, в сочетании с assay нейросферы, линии трассировки и иммуногистохимия/иммунофлюоресценции), но должны также продемонстрировать соответствующие функциональные улучшения с помощью поведенческих парадигмы, там, где это применимо. Ряд поведенческих задач, используемых для тестирования функциональных результатов в грудной модели травмы ног вине тест и Бассо, Битти, Breshnan (BBB) открытые поля опорно масштаба28, не являются достаточно чувствительным, чтобы обнаружить измеримые дефицита в наши минимальные SCI модель. Чтобы преодолеть этот недостаток, можно сделать использование более чувствительные цифровые скоринговых систем (например, дефиле), который измеряет несколько параметров грубой и тонкой задние конечности локомоции параметров, включая анализ походки, которые может обнаружить минимальный Дефицит результате минимальной травмы модель29.
Этот метод также может быть адаптирована к изучению эндогенных НСК активации как потенциальные терапии в моделях травмы шейного отдела спинного. Шейки матки SCI является наиболее клинически значимых модель и мы предлагаем, что адаптации этой травмы модели для высших позвоночных сегментов обеспечит понимание ли существуют региональные различия в ответе NSCs и их потомства (кинетика, миграции, дифференциация) и ли поражения приведет к более глубоким и измеримые функциональные дефициты. В настоящее время используется мышиных шейки матки травмы модели (например, перерезка, клип сжатия или ушиб) требуют интенсивного послеоперационного ухода, включая необходимость вручную Экспресс пузыри и постоянно контролировать дыхание мыши. Адаптация модели минимальной травмы шейного отдела спинного может снижения смертности, заболеваемости и послеоперационный уход, связанные с другими моделями шейки матки SCI, а также позволяют проанализировать эффективность препаратов и малых молекул и/или реабилитации результаты на нейронных восстановления. Наша модель травмы также может быть адаптирована для создания минимальной травмы в различных частях шнур (т.е., дорсального или боковой колонки) и/или больше травм с глубокого проникновения и/или использование большего размера иглы (меньший калибр). Это позволяет исследователю управления/манипулировать тип и размер поражения и таким образом оценить сотовой и функциональные/поведенческих восстановления соответственно.
Минимальной травмы модели мышей разрешает использование трансгенных животных моделей. Мышь модели позволяют маркировки эндогенного стволовых клеток и/или прародителями до травмы. Это может позволить исследователь отслеживать судьбу этих предварительно помечены клеток после травмы и оценивать пролиферации клеток нейронной прекурсоров, миграции и дифференциации, после травмы — потенциально способствует нейронных ремонт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансируется Фондом Krembil (эксплуатационные Грант CMM). WX был удостоен премии Студенческая Carlton Маргерит Смит. NL получил стипендию аспирантов Онтарио.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agricola Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved) | Fine Science Tools | 15370-50 | Customize when ordering to get blunted tips |
| Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth) | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated) | Fine Science Tools | 11152-10 | Or any other forceps for suturing |
| Hartman Hemostats (Straight) | Fine Science Tools | 13002-10 | Or any other appropriate for suturing |
| Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Or any other appropriate |
| Hair clippers | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA | or any other appropriate |
| Stereotaxic instrument | Stoeling | 51500 | or any other appropriate |
| Buprenorphine | or any appropirate sanctioned my animal care facility | ||
| Meloxicam | or any appropriate sanctioned by animal care facility | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE | or any other appropriate |
| Isoflurane | Baxter International Inc | DIN 02225875 | or any other appropriate for anesthesia |
| Q-tips Cottom Swabs | amazon.ca | https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS | |
| Cotton Gauze | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| 30 G Needles | Becton Dickinson | 305106 | For Injury |
| 25 G Needles | Becton Dickinson | 305122 | For Drug injections |
| 1 mL Syringes | Becton Dickinson | 3090659 | for drug injections |
| 3 mL Syringes | Becton Dickinson | 309657 | for fluid injections |
| 4-0 Suture | uoftmedstore.com | 2297-VS881 | for skin suturing |
| 6-0 Suture | uoftmedstore.com | VS889 | for muscle suturing |
| Polysporin ointment | amazon.ca | 102051 | |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 901806 | |
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Petri Dishes | ThermoFisher | any appropriate | |
| Trypan Blue | ThermoFisher | Any | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Centrifuge | ThermoFisher | Any appropriate | |
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||
| Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Counting Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Neural Basal-A Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| B27 | Invitrogen | 17404-044 | |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| L- Glutamine | Gibco | 25030 | |
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |
| F12 | Invitrogen | 12700075 | |
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | 1 M, 9.01 g in 100 mL dH2O |
| 1 M Glucose | |||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | 155 mM, 1.30 g in 100 mL dH2O |
| 155 mM NaHCO3 | |||
| 1 M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g in 100 mL dH2O |
| Apo-Transferrin | R&D Systems | 3188-AT | |
| Putrescine | Sigma | P7505 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| Selenium | Sigma | S9133 | |
| Progesterone | Sigma | P6149 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | 1 vial of papain can be used for 2 samples |
| Epidermal Growth Factor | Invitrogen | PMG8041 | Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer |
| Fibroblast Growth Factor | Invitrogen | PHG0226 | Powder reconstituted with 0.5 mL Hormone Mix and aliquoted into 20 μL vials to be stored in freezer |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | In House | ||
| Trypan Blue | |||
| Hemocytometer | |||
| 24 well Plates | NUNC | ||
| 2 M NaCl | Sigma | S5886 | 11.69 g in 100 mL dH2O |
| 1 M KCL | Sigma | P5405 | 7.46 g in 100 mL dH2O |
| 1 M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g in 100 mL dH2O |
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g in 100 mL dH2O |
References
- Johansson, C. B., et al. Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system. Cell. 96 (1), 25-34 (1999).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276 (5309), 66-71 (1997).
- Gage, F. H.
- Temple, S., Alvarez-Buylla, A. Stem cells in the adult mammalian central nervous system. Current Opinion in Neurology. 9 (1), 135-141 (1999).
- Zhang, R., et al. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. Journal Of Cerebral Blood Flow And Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
- Komitova, M., Mattsson, B., Johansson, B. B., Eriksson, P. S. Enriched environment increases neural stem/progenitor cell proliferation and neurogenesis in the subventricular zone of stroke-lesioned adult rats. Stroke. 36 (6), 1278-1282 (2005).
- Faiz, M., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone give rise to reactive astrocytes in the cortex after stroke. Cell Stem Cell. 17 (5), 624-634 (2015).
- Ren, Y., et al. Ependymal cell contribution to scar formation after spinal cord injury is minimal, local and dependent on direct ependymal injury. Science Reports - UK. 7, (2017).
- Mothe, A. J., Tator, C. H. Proliferation, migration, and differentiation of endogenous ependymal region stem/progenitor cells following minimal spinal cord injury in the adult rat. Neuroscience. 131 (1), 177-187 (2005).
- Thuret, S., Moon, L. D., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nature Reviews Neuroscience. 7 (8), 628-643 (2006).
- Bethea, J. R., et al. Systemically administered interleukin-10 reduces tumor necrosis factor-alpha production and significantly improves functional recovery following traumatic spinal cord injury in rats. Journal of Neurotrauma. 16 (10), 851-863 (1999).
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 209 (2), 378-388 (2008).
- Cummings, B. J., et al. Human neural stem cells differentiate and promote locomotor recovery in spinal cord-injured mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (39), 14069-14074 (2005).
- Beattie, M. S., Hermann, G. E., Rogers, R. C., Bresnahan, J. C. Cell death in models of spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 37-47 (2002).
- Metz, G. A., et al. Validation of the weight-drop contusion model in rats: a comparative study of human spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 17 (1), 1-17 (2000).
- Faulkner, J. R., et al. Reactive astrocytes protect tissue and preserve function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 24 (9), 2143-2155 (2004).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay. Neural Cell Transplantation: Methods and Protocols. , 91-101 (2009).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nature Methods. 3 (10), (2006).
- Mignone, J. L., Kukekov, V., Chiang, A. S., Steindler, D., Enikolopov, G. Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 469 (3), 311-324 (2004).
- Xu, W., et al. Myelin basic protein regulates primitive and definitive neural stem cell proliferation from the adult spinal cord. Stem Cells. 35 (2), 485-496 (2017).
- Sachewsky, N., et al. Primitive neural stem cells in the adult mammalian brain give rise to GFAP-expressing neural stem cells. Stem Cell Reports. 2 (6), 810-824 (2014).
- Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , Available from: http://www.worthington-biochem.com/PDS/default.html (2018).
- Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of neural stem/progenitor cells from the periventricular region of the adult rat and human spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Absher, M. Hemocytometer counting. Tissue Culture. , 395-397 (1973).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
- Xiong, L., et al. Preconditioning with isoflurane produces dose-dependent neuroprotection via activation of adenosine triphosphate-regulated potassium channels after focal cerebral ischemia in rats. Anesthesia and Analgesia. 96 (1), 233-237 (2003).
- Metz, G. A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats. Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).
- Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
