FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Zusammenfassung

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Zusammenfassung

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K⁺] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Einleitung

Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen¹verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken². Diese Bläschen dock an der präsynaptis....

Protokoll

1. Larvenstadium Kleber Dissektion

1. Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials).
2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten.
3. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1, unten), in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
4. Bereiten Sie die Kleber-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillare mit einem standard Mikroel....

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und die Vor.......

Diskussion

Hoch [K⁺] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen²⁹. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K⁺] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrscheinlich Sy.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-Kit	Fisher Scientific	NC9644388	Zum Aufstecken von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1	Fisherbrand	12-542-B	Zum Aufsetzen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Heizplatte Typ 2200	Thermolyne	HPA2235M	Zum Aushärten der SylGard
Plexiglas-Präparierkammer	N/A	N/A	Handgefertigt
Borosilikatglas Kapillaren	WPI	1B100F-4	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierte Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-2000	Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 Laboratory Tubing	Component Supply Co.	TET-031A	Für Mund- und Saugpipette
P2 Pipettenspitze	USA Scientific	1111-3700	Für Mundpipette
0,6 mL Eppendorf Röhrchenkappe	Fisher Scientific	05-408-120	Wird zum Einbringen von Klebstoff zum Sezieren
verwendet Vetbond 3M	WPI	Vetbond	Kleber zum Sezieren
Kaliumchlorid	Fisher Scientific	P-217	Forsalin
Natriumchlorid	Millipore Sigma	S5886	Für Kochsalzlösung
Magnesiumchlorid	Fisher	Scientific M35-500	Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid Dihydrat	Millipore Sigma C7902		Für Kochsalzlösung
Saccharose	Fisher Scientific	S5-3	Für Kochsalzlösung
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	123-605-021	Zur Markierung neuronaler Membranen
Pinsel	Winsor & Newton	94376864793	Zur Manipulation der Larven
Dumont Dumostar Pinzette #5	WPI	500233	Wird beim Sezieren
verwendet 7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)	WPI	14177	Wird beim Sezieren verwendet
FM1-43	Fisher Scientific	T35356	Fluoreszierender Styrylfarbstoff
Digitaler Timer	VWR	62344-641	Zum Timing des Ladens/Entladens von FM-Farbstoffen
LSM 510 META Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss		Zur Bildgebung von Fluoreszenzmarkern
Zen 2009 SP2 Version 6.0	Zeiss		Software zur Bildgebung auf konfokalen
HeNe 633nm Laser	Lasos		Zur Anregung von HRP:647 während der
Bildgebung Argon 488nm Laser	Lasos		Zur Anregung des FM-Farbstoffs während der
Bildgebung Micro-Forge	WPI	MF200	Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
20 ml Spritzen-Aufsteckspitze	BD	301625	Zum Aufsaugen des Axons für die elektrische Stimulation.
Mikromanipulator (Magnetfuß)	Narishige	MMN-9	Zur Steuerung der Saugelektrode für die elektrische Stimulation
Stimulator	Grass	S48	Zur Steuerung der LED und der elektrischen
Stimulation Zeiss Axioskop Mikroskop	Zeiss		Wird während der elektrischen Stimulation verwendet.
40X Achroplan Wasser-Immersionsobjektiv	Zeiss		Wird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung
verwendet All-trans	Retinal Millipore Sigma	R2500	Essentieller Co-Faktor für ChR2
Zeiss Stemi Mikroskop mit Kameraanschluss	Zeiss	2000-C	Wird bei der Kanalrhodopsin-Stimulation
verwendet LED 470nm	ThorLabs	M470L2	Wird für die ChR-Aktivierung
T-Cube LED-Treiber	ThorLabs	LEDD1B	Zur Steuerung des LED-LED-Netzteils
	Cincon Electronics Co.	TR15RA150	Zur Stromversorgung der LED
Optisches Leistungs- und Energiemessgerät	ThorLabs	PM100D	Zur Messung der LED-Intensität