Methodenartikel

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

DOI:

10.3791/57765

⸱

24. Mai 2018

 , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K+] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Einleitung

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Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen1verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken2. Diese Bläschen dock an der präsynaptischen Membran Fusion Website aktive Zonen (AZs), wo Exozytose die Glutamat-Neurotransmitter-Freigabe für Trans vermittelt-synaptische Kommunikation. Anschließend werden die SVs für wiederholte Exo/Endozytose Zyklen aus der Plasmamembran über recycling-Kiss-and-Run oder Clathrin-vermittelte Endozytose (CME) abgerufen. Die Drosophila NMJ ist leicht zugänglich und gut geeignet für Isolierung und Charakterisierung von SV Zyklus Mutanten. Mit vorwärts genetischer Bildschirme, führten neue Mutationen zur Identifizierung neuer Gene entscheidend für die SV-Zyklus3. Darüber hinaus haben reverse gentechnische Ansätze beginnend mit bereits bekannten Genen, die Aufklärung des neuen SV-Zyklus-Mechanismen durch die sorgfältige Beschreibung der Mutant Radfahren Phänotypen4geführt. Die Drosophila NMJ ist nahezu ideal als experimentelle synaptischen Vorbereitung für SV Endozytose und Exozytose Mechanismen über Methoden, um optisch Track Vesikel Radfahren während Neurotransmission sezieren.

Eine Reihe von fluoreszierenden Marker ermöglichen visuelle Verfolgung von Vesikeln während des Radfahrens Dynamik, aber das vielseitigste sind FM-Farbstoff-Analoga, die zuerst von Mao, F., Et al.synthetisiert wird. 5. strukturell FM Farbstoffe enthalten einen hydrophilen Kopf und einen lipophilen Schweif, verbunden durch einen aromatischen Ring mit einem Mittelbereich spektrale Eigenschaften verleihen. Diese Styryl Farbstoffe in Membranen reversibel zu partitionieren, nicht "flip-flop" zwischen Membran Flugblätter und so sind nie frei in das Zytosol, und sind weit mehr fluoreszierend in Membranen als Wasser5. Reversible Einfügung in ein Lipid Bilayer bewirkt eine 40-fold Fluoreszenz-6. Bei neuronalen Synapsen bestehen classic FM Farbstoff Kennzeichnung Experimente aus Baden die synaptische Vorbereitung mit dem Farbstoff während depolarisierende Stimulation Farbstoff über SV Endozytose geladen. Externen Farbstoff ist dann weggespült und der SV-Zyklus ist ein Kalzium-freien Ringer-Lösung geladen Synapsen7Image verhaftet. Eine zweite Runde der Stimulation in einem Farbstoff-frei Bad löst FM durch Exozytose, ein Prozess, der verfolgt werden kann, durch die Messung der Fluoreszenz Intensität verringern. SV-Populationen aus einem einzigen vesikels zu Pools mit Hunderten von Vesikeln können quantitativ überwachten6,7sein. FM-Farbstoffe wurden aktivitätsabhängige Mobilisierung von funktionell unterschiedliche SV-Pools zu sezieren, und Kiss-and-Run vs. Radfahren8,9CME vergleichen verwendet. Die Methode wurde geändert, um separat Assay hervorgerufen, spontane und Miniatur synaptischen Zyklus Aktivitäten (mit hochsensiblen Geräten sehr kleine Fluoreszenz Veränderungen erkennen und reduzieren Immunofluoreszenz)10. Assays der Ultrastrukturforschung Ebene durch Photoconverting das Fluoreszenzsignal FM in ein Elektron-Dichte Label für Transmission Electron Microscopy11,12,13,14 erweiterbar auf .

Historisch, Baden synaptischen Vorbereitungen in einer hohen Konzentration von Kalium (nachstehend als "hoch [K+]" genannt) wurde die Methode der Wahl für depolarisierende Stimulation um SV Radfahren induzieren; von der Frosch cholinerge NMJ-5, bis hin zu kultiviert Nagetier Gehirn hippocampal Neuronen15, bis die Drosophila glutamatergen NMJ Modell16,17. Dieser hohe [K+] Ansatz ist einfach, erfordert keine spezielle Ausrüstung und ist daher für die meisten Labors zugänglich, aber hat Einschränkungen für die Anwendung und Interpretation der Daten. Eine viel mehr physiologisch angemessene Methode ist mit Saug-Elektrode elektrische Stimulation des Nervs4,5,12. Dieser Ansatz treibt Aktionspotential Vermehrung zur direkten Stimulation des Nervus präsynaptischen terminal und Ergebnisse können direkt gegenüber elektrophysiologische Tests der Neurotransmission Funktion13,14, 15, sondern erfordert spezialisierte Ausrüstung und ist technisch wesentlich schwieriger. Mit dem Aufkommen der optogenetik hat die Verwendung von Channelrhodopsin neuronale Stimulation zusätzliche Vorteile, einschließlich enge räumlich-zeitliche Begrenzung der Kanal-Ausdruck mit Hilfe der binären Gal4/UAS-System20. Dieser Ansatz ist technisch einfacher als Saug-Elektrode Stimulation und erfordert nichts weiter als eine sehr billige LED-Lichtquelle. Hier beschäftigen wir Bildgebung FM1 / 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridiniumdichromat Dibromide) zu sowohl vergleichen und diese drei verschiedenen stimulationsmethoden bei Drosophila NMJ: einfach hoch [K+ ], anspruchsvolle Elektro- und neue Channelrhodopsin Ansätze.

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Protokoll

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1. Larvenstadium Kleber Dissektion

  1. Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials).
  2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten.
  3. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1, unten), in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
  4. Bereiten Sie die Kleber-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillare mit einem standard Mikroelektrode Abzieher zu erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
  5. Sanft brechen Sie die Mikropipette Spitze und am anderen Ende, fügen Sie 2 ft von flexiblen Kunststoffschlauch (1/32" Innendurchmesser, ID 3/32" Außendurchmesser OD; 1/32" Wand; Tabelle der Materialien) mit Mund passend (P2-PIPETTENSPITZE).
  6. Füllen Sie einen kleinen Behälter (0,6 mL Eppendorf Tube GAP) mit einem kleinen Volumen (~ 20 µL) des Klebers (Table of Materials) in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
  7. Füllen Sie die Kammer mit Kochsalzlösung (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl21 CaCl2, 70 Saccharose und 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic Säure (HEPES) pH 7,2.
  8. Fügen Sie Anti-Meerrettich Peroxidase (HRP) Antikörper konjugiert, Alexa Fluor 647 (Anti-HRP:647; verdünnter 01:10 aus einem Bestand von 1 mg/mL) für die Kennzeichnung der NMJ präsynaptischen Terminal während Dissektion21,22.
  9. Mit einem feinen Pinsel (Größe 2), entfernen Sie eine wandernde dritte Instar aus der Lebensmittel Durchstechflasche und setzen auf das Deckglas Elastomer beschichtet.
  10. Füllen Sie den Glas Mikropipette Tipp mit einem kleinen Volumen des Leims mit Unterdruck erzeugt, durch den Mund mit Anhang (Schritt 1.5).
  11. Stellung Larve dorsalen Seite nach oben mit Zange und Leim, den Kopf auf die Elastomer-Beschichtung Deckglas mit einem kleinen Tropfen Kleber mit positiver Luftdruck durch den Mund.
  12. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende des die Larve, die dafür sorgen, dass das Tier gestreckt wird straff zwischen die zwei Kleber-Anlagen.
  13. Mit einer Schere (Messer 3 mm; Tabelle der Materialien), machen Sie einen horizontalen Schnitt (~ 1 mm) am Hinterteil und einem vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie.
  14. Mit feinen Pinzette (#5, Tabelle der Materialien), sanft entfernen dorsalen Luftröhre, Darm, dicken Körper und andere innere Organe für die Muskulatur.
  15. Wiederholen Sie für die vier Körperwand Klappen, und achten Sie auf sanft die Körperwand sowohl horizontal als auch vertikal dehnen kleben.
  16. Heben Sie den ventralen Nervenstrang (VNC) mit Pinzette, schneiden Sie die motorischen Nerven vorsichtig mit der Schere aus und dann entfernen Sie vollständig zu die VNC.
  17. Ersetzen Sie die Dissektion Kochsalzlösung mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (identisch mit der oben genannten Dissektion Kochsalzlösung ohne CaCl2), SV stoppen Radfahren.

2. Option 1: High [K+] FM Farbstoff be-

  1. Fügen Sie aus einem FM1-43-Stammlösung (4 mM) 1 µL bis 1 mL 90 mm KCl-Lösung (hoch [K+] in Dissektion Kochsalzlösung) für eine Endkonzentration von 4 µM hinzu.
  2. Mit einer Pipette ersetzen die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung in der bildgebenden Kammer mit der hohen [K+] FM Farbstofflösung, SV Endozytose Farbstoff Aufnahme zu stimulieren.
  3. Starten Sie sofort eine digitale Zeitschaltuhr für die vorher festgelegten Dauer des hohen [K+] depolarisierende stimulationsdauer (zB., 5 min; ( Abbildung 2).
  4. Um eine gesunde Larven Vorbereitung bestätigen, beachten Sie die starke Kontraktionen der Muskulatur für die Dauer des hohen [K+] Depolarisation.
  5. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die hohe [K+] FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  6. Waschen in rascher Folge mit dem Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K+] FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  7. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.

(3) Imaging: Konfokale Mikroskopie

  1. Verwenden Sie eine aufrechte confocal Mikroskop mit einem 40 X Wasser eintauchen soll Bild NMJ Farbstoff Fluoreszenz (andere Mikroskope können verwendet werden).
  2. Bild Muskel 4 NMJ Abdominalsegmente 2-4 (andere NMJs können abgebildet werden) und sammeln Bilder mittels geeigneter Software (Table of Materials).
  3. Benutzen Sie einen HeNe 633 nm Laser HRP:647 (mit lang-Pass-Filter > 635 nm) sowie ein Argon 488 nm Laser FM1-43 (mit Bandpass Filter 530-600 nm) begeistern zu begeistern.
  4. Operativ bestimmen Sie optimale Gain und Offset für beide Kanäle.
    Hinweis: Diese Einstellungen bleibt konstant, während der Rest des Experiments.
  5. Nehmen Sie einen konfokalen Z-Stapel durch die gesamte ausgewählte NMJ von HRP markiert oben nach unten des synaptischen Terminals.
  6. Beachten Sie vorsichtig den NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskeln) um überschüssige, die exakt gleichen NMJ sicherzustellen, nachdem FM färben entladen.

4. High [K+] Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung mit hohen [K+] Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff), Laufwerk Depolarisation, SV Exozytose und Dye-Release.
  2. Sofort eine digitale Zeitschaltuhr für den vorab festgelegten Dauer der hohen [K+] Stimulation (zB., 2 min; ( Abbildung 2).
  3. Nach Ablauf die Timer-Zeit sofort die hohe [K+] Kochsalzlösung zu entfernen und ersetzen Sie durch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  4. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die hohe [K+] Kochsalzlösung wird vollständig entfernt.
  5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  6. Seien Sie sicher, die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

5. Option 2: Elektrische Stimulation FM Farbstoff be-

  1. Vorbereiten einer saugen Pipette mit der Mikroelektrode Abzieher (Table of Materials) erhalten die gewünschte Verjüngung und Düsengröße.
  2. Feuer-polnische Mikroelektrode Tipp mit einer Mikro-Schmiede bis ein einzelner motorischer Nerv mit einem festen Sitz abgesaugt werden kann.
  3. Eine defekte Saug Pipette auf den Elektrodenhalter aufschieben und legen auf den langen, flexiblen Kunststoffschlauch und eine Spritze.
  4. Stimulator Parameter einstellen (zB., 15 V, 20 Hz-Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 min (Abbildung 2) oder 1 min (Abbildung 3)).
  5. Ersetzen Sie die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl2; 4 µM) auf dem Prüfstand der Elektrophysiologie.
  6. Setzen Sie die Vorbereitung auf den Mikroskoptisch und erhöhen Sie die Stufe zu, bis die Larve und Saug Pipette im Fokus (Eintauchen in Wasser Objektiv 40 X) sind.
  7. Saugen Sie auf einer Schleife der Schnitt motorischen Nerven innervieren die ausgewählten Hemisegment mit Unterdruck durch die Spritze in die Absaugung Elektrode erzeugt.
  8. Testen Sie die Saug-Elektroden-Funktion mit einem kurzen Stoß der Stimulation während der visuell Überwachung für die Kontraktion der Muskeln in den ausgewählten Hemisegment.
  9. Fördern Sie die motorische Nerven mit ausgewählten Parametern (Schritt 5.4), SV Endozytose fahren und FM1-43 Farbstoff Aufnahme (Abbildung 2).
  10. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-frei Kochsalzlösung (5 X 1 min.), gewährleisten die FM1-43 Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  11. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen bildgebenden Protokoll von oben.
  12. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

6. elektrische Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie die Ca2 +-frei Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne FM1-43 Farbstoff) und setzen Sie die Vorbereitung wieder auf die Elektrophysiologie-Rig-Bühne.
  2. Legen Sie die Parameter der Stimulator für die Entladung (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2) bzw. 20 s (Abbildung 3)).
  3. Saugen Sie die gleichen motorische Nerven in die gleichen Elektrode wie oben beschrieben, und dann zu stimulieren Sie, um SV Exozytose und FM1-43 Farbstoff Freigabe zu aktivieren.
  4. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
  5. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  6. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

7. Option 3: Channelrhodopsin Stimulation FM Farbstoff be-

  1. ChR2 exprimierenden Larven auf Lebensmittel, die die ChR2 Co-Faktor All-Trans Retinal (gelöst in Ethanol; 100 µM Endkonzentration) zu erhöhen.
  2. Legen Sie die Larven Vorbereitung in der Plexiglas-Kammer auf eine Dissektion Mikroskoptisch mit einem Kamera-Anschluss ausgestattet.
  3. Befestigen Sie eine blaue LED (470 nm; Tabelle der Materialien) ein programmierbarer Stimulator mit einem Koaxialkabel und die LED in den Kamera-Anschluss.
  4. Fokus der blaue LED Lichtstrahl auf die seziert Larven-Funktion mit der Mikroskop-Zoom-Funktion.
  5. Ersetzen Sie die Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung auf die Larven Vorbereitung mit oben FM1-43 Kochsalzlösung (1 mM CaCl2; 4 µM) auf der optogenetische Bühne.
  6. Legen Sie die LED-Parameter mit dem Stimulator (z. B.15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 5 Minuten (Abbildung 2)).
  7. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z.B., 5 min; ( Abbildung 2).
  8. Wenn der Timer stoppt, schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  9. Waschen in rascher Folge mit dem Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) um sicherzustellen, das FM Farbstofflösung wird vollständig entfernt.
  10. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop mit imaging-Protokoll von oben.
  11. Nehmen Sie zur Kenntnis der NMJ abgebildet (Segment, Seite und Muskel), um Zugang zu den exakt gleichen NMJ nach FM Farbstoff entladen.

8. Channelrhodopsin Stimulation: FM Farbstoff entladen

  1. Ersetzen Sie Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung mit regelmäßigen Kochsalzlösung (ohne Farbstoff FM1-43) auf die Dissektion Mikroskoptisch mit Kamera-Anschluss LED konzentrierte sich auf die Larve.
  2. Legen Sie den Stimulator Parameter für entladen (z. B. 15 V, 20 Hz Frequenz, 20 ms Dauer und Zeit von 2 min (Abbildung 2)).
  3. Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen mit einem Timer für den vorab festgelegten Dauer der optogenetische Stimulation (z. B. 2 min; ( Abbildung 2).
  4. Nach Ablauf die Timer-Zeit schnell die FM Farbstofflösung entfernen und ersetzen Sie mit Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung, SV stoppen Radfahren.
  5. Waschen in rascher Folge mit Ca2 +-freie Kochsalzlösung (5 X 1 min.) Sicherstellung der externen Farbstoff wird vollständig entfernt.
  6. Halten Sie die Larven Vorbereitung in frisch Ca2 +-kostenlose Kochsalzlösung für die unmittelbare Bildgebung mit der konfokalen Mikroskop.
  7. Sicherstellen Sie, dass die FM1-43 Farbstoff Fluoreszenz bei der gleichen NMJ erwähnt mit den gleichen Einstellungen konfokalen Bild.

9. Fluoreszenz Quantifizierung

  1. Laden Sie das Bild in Bild J (NIH-open-Source) und erstellen Sie eine maximale Intensität Projektion durch Klick auf Bild | Stapel | Z-Projekt.
  2. Mit der Anti-HRP:647-Kanal, gehe zu Bild | Anpassen | Schwelle und schieben Sie den oberen Symbolleiste bis nur der NMJ markiert ist.
  3. Klicken Sie mit dem Zauberstab-Werkzeug auf den NMJ. Wenn die NMJ diskontinuierlich ist, halten Sie die Shift-Taste und wählen Sie alle Teile.
  4. Die FM1-43-Farbstoff-Kanal als Hintergrundbild und gehen Sie zu analysieren | Messung die Fluoreszenzmessung zu erhalten.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 9.1-9.4 für das "entladen" Bild aus der gleichen NMJ (identifizierten Segment, Seite und Muskeln).
  6. Den Anteil des Farbstoffes zu erhalten, die entladen wurde, nehmen Sie das Verhältnis der Intensitäten/aufgeladen Fluoreszenz.
    Hinweis: Dieses Verfahren kann geändert werden, um Fluoreszenz auf Bouton-pro-Bouton Basis mit der "Oval" oder "Freihand" Auswahlwerkzeuge zu analysieren. Hintergrundfluoreszenz kann durch Abtasten der Muskel Fluoreszenz subtrahiert werden. Agenten können auch hinzugefügt werden, um diesen Hintergrund zu reduzieren.

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und die Vor...

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Diskussion

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Hoch [K+] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen29. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K+] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrscheinlich Sy...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Broadie Lab Mitgliedern für Beiträge zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01s MH096832 und MH084989, k.b., und NIH predoctoral Fellowship F31 MH111144, D.L.K.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-KitFisher ScientificNC9644388Zum Aufstecken von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1Fisherbrand12-542-BZum Aufsetzen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Heizplatte Typ 2200ThermolyneHPA2235MZum Aushärten der SylGard
Plexiglas-PräparierkammerN/AN/AHandgefertigt
Borosilikatglas KapillarenWPI1B100F-4Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierte MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-2000Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 Laboratory TubingComponent Supply Co.TET-031AFür Mund- und Saugpipette
P2 PipettenspitzeUSA Scientific1111-3700Für Mundpipette
0,6 mL Eppendorf RöhrchenkappeFisher Scientific05-408-120Wird zum Einbringen von Klebstoff zum Sezieren
verwendet Vetbond 3MWPIVetbondKleber zum Sezieren
KaliumchloridFisher ScientificP-217Forsalin
NatriumchloridMillipore SigmaS5886Für Kochsalzlösung
MagnesiumchloridFisherScientific M35-500Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid DihydratMillipore Sigma C7902Für Kochsalzlösung
SaccharoseFisher ScientificS5-3Für Kochsalzlösung
HEPESMillipore SigmaH3375Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021Zur Markierung neuronaler Membranen
PinselWinsor & Newton94376864793Zur Manipulation der Larven
Dumont Dumostar Pinzette #5WPI500233Wird beim Sezieren
verwendet 7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)WPI14177Wird beim Sezieren verwendet 
FM1-43Fisher ScientificT35356Fluoreszierender Styrylfarbstoff
Digitaler TimerVWR62344-641Zum Timing des Ladens/Entladens von FM-Farbstoffen 
LSM 510 META Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissZur Bildgebung von Fluoreszenzmarkern
Zen 2009 SP2 Version 6.0ZeissSoftware zur Bildgebung auf konfokalen
HeNe 633nm LaserLasosZur Anregung von HRP:647 während der
Bildgebung Argon 488nm LaserLasosZur Anregung des FM-Farbstoffs während der
Bildgebung Micro-ForgeWPIMF200Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
20 ml Spritzen-AufsteckspitzeBD301625Zum Aufsaugen des Axons für die elektrische Stimulation.
Mikromanipulator (Magnetfuß)NarishigeMMN-9Zur Steuerung der Saugelektrode für die elektrische Stimulation
StimulatorGrassS48Zur Steuerung der LED und der elektrischen
Stimulation Zeiss Axioskop MikroskopZeissWird während der elektrischen Stimulation verwendet.
40X Achroplan Wasser-ImmersionsobjektivZeissWird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung
verwendet All-transRetinal Millipore SigmaR2500Essentieller Co-Faktor für ChR2
Zeiss Stemi Mikroskop mit KameraanschlussZeiss2000-CWird bei der Kanalrhodopsin-Stimulation
verwendet LED 470nmThorLabsM470L2Wird für die ChR-Aktivierung
T-Cube LED-TreiberThorLabsLEDD1BZur Steuerung des LED-LED-Netzteils
Cincon Electronics Co.TR15RA150Zur Stromversorgung der LED
Optisches Leistungs- und EnergiemessgerätThorLabsPM100DZur Messung der LED-Intensität
verwendet

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790(2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133(2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135(2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

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Synaptischer VesikelzyklusNeuromuskul re Verbindungen von DrosophilaElektrische StimulationKonfokalmikroskopieTransmissionselektronenmikroskopieFM1 43 FarbstoffaufnahmeFM1 43 Farbstofffreisetzung

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