Methodenartikel

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

DOI:

10.3791/57765

24. Mai 2018

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Zusammenfassung

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FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K+] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Einleitung

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Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen1verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken2. Diese Bläschen dock an der präsynaptis....

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Protokoll

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1. Larvenstadium Kleber Dissektion

  1. Mischen Sie 10 Teile des Silikon-Elastomer-Basis mit 1 Teil des Silikon-Elastomer Härtemittel aus Elastomer-Kit (Table of Materials).
  2. 22 x 22 mm Glasdeckgläser mit Elastomer und Heilung auf einer heißen Platte bei 75 ° c für mehrere Stunden (bis nicht mehr klebrig anfühlen) zu beschichten.
  3. Legen Sie ein einziges Elastomer-beschichtete Glas-Deckglas in maßgeschneiderte Plexi Glas Dissektion Kammer (Abbildung 1, unten), in Vorbereitung auf die Larven Dissektion.
  4. Bereiten Sie die Kleber-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillare mit einem standard Mikroel....

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Ergebnisse

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Abbildung 1 zeigt den Arbeitsablauf für die aktivitätsabhängige FM Farbstoff imaging-Protokoll. Das Experiment beginnt immer mit der gleichen Larven Kleber Dissektion, unabhängig von der Stimulation Methode anschließend verwendet. Abbildung 1a zeigt eine schematische Darstellung des sezierten Larve, die ventrale Nerv Schnur (VNC), ausstrahlenden Nerven und wiederholte Hemisegmental Muskel Muster. Das VNC wird entfernt und die Vor.......

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Diskussion

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Hoch [K+] saline depolarisierende Stimulation ist bei weitem die einfachste der drei Optionen für aktivitätsabhängige FM Farbstoff Radfahren, aber wahrscheinlich die wenigsten physiologischen29. Diese einfache Methode erschüttert jeden zugänglich Zelle in das gesamte Tier und so erlaubt keine gezielte Studien. Es kann möglich sein, lokal hohe [K+] Kochsalzlösung mit einer Mikropipette gelten, aber dies wird noch depolarisieren Pre/postsynaptischen Zellen und wahrscheinlich Sy.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Wir danken Broadie Lab Mitgliedern für Beiträge zu diesem Artikel. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH R01s MH096832 und MH084989, k.b., und NIH predoctoral Fellowship F31 MH111144, D.L.K.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SylGard 184 Silikon-Elastomer-KitFisher ScientificNC9644388Zum Aufstecken von Deckglas zum Sezieren
Mikroskop-Deckglas 22x22-1Fisherbrand12-542-BZum Aufsetzen von SylGard zum Sezieren
Aluminium-Heizplatte Typ 2200ThermolyneHPA2235MZum Aushärten der SylGard
Plexiglas-PräparierkammerN/AN/AHandgefertigt
Borosilikatglas KapillarenWPI1B100F-4Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Laserbasierte MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-2000Zur Herstellung von Saug- und Klebemikropipetten
Tygon E-3603 Laboratory TubingComponent Supply Co.TET-031AFür Mund- und Saugpipette
P2 PipettenspitzeUSA Scientific1111-3700Für Mundpipette
0,6 mL Eppendorf RöhrchenkappeFisher Scientific05-408-120Wird zum Einbringen von Klebstoff zum Sezieren
verwendet Vetbond 3MWPIVetbondKleber zum Sezieren
KaliumchloridFisher ScientificP-217Forsalin
NatriumchloridMillipore SigmaS5886Für Kochsalzlösung
MagnesiumchloridFisherScientific M35-500Für Kochsalzlösung
Calciumchlorid DihydratMillipore Sigma C7902Für Kochsalzlösung
SaccharoseFisher ScientificS5-3Für Kochsalzlösung
HEPESMillipore SigmaH3375Für Kochsalzlösung
HRP: Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021Zur Markierung neuronaler Membranen
PinselWinsor & Newton94376864793Zur Manipulation der Larven
Dumont Dumostar Pinzette #5WPI500233Wird beim Sezieren
verwendet 7 cm McPherson-Vannas Mikroschere (Klingen 3 mm)WPI14177Wird beim Sezieren verwendet 
FM1-43Fisher ScientificT35356Fluoreszierender Styrylfarbstoff
Digitaler TimerVWR62344-641Zum Timing des Ladens/Entladens von FM-Farbstoffen 
LSM 510 META Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissZur Bildgebung von Fluoreszenzmarkern
Zen 2009 SP2 Version 6.0ZeissSoftware zur Bildgebung auf konfokalen
HeNe 633nm LaserLasosZur Anregung von HRP:647 während der
Bildgebung Argon 488nm LaserLasosZur Anregung des FM-Farbstoffs während der
Bildgebung Micro-ForgeWPIMF200Zum Brennen von Mikropipetten aus poliertem Glas
20 ml Spritzen-AufsteckspitzeBD301625Zum Aufsaugen des Axons für die elektrische Stimulation.
Mikromanipulator (Magnetfuß)NarishigeMMN-9Zur Steuerung der Saugelektrode für die elektrische Stimulation
StimulatorGrassS48Zur Steuerung der LED und der elektrischen
Stimulation Zeiss Axioskop MikroskopZeissWird während der elektrischen Stimulation verwendet.
40X Achroplan Wasser-ImmersionsobjektivZeissWird bei der Elektrostimulation und konfokalen Bildgebung
verwendet All-transRetinal Millipore SigmaR2500Essentieller Co-Faktor für ChR2
Zeiss Stemi Mikroskop mit KameraanschlussZeiss2000-CWird bei der Kanalrhodopsin-Stimulation
verwendet LED 470nmThorLabsM470L2Wird für die ChR-Aktivierung
T-Cube LED-TreiberThorLabsLEDD1BZur Steuerung des LED-LED-Netzteils
Cincon Electronics Co.TR15RA150Zur Stromversorgung der LED
Optisches Leistungs- und EnergiemessgerätThorLabsPM100DZur Messung der LED-Intensität
verwendet

Referenzen

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  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).

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Schlagwörter

Synaptischer VesikelzyklusNeuromuskul re Verbindungen von DrosophilaElektrische StimulationKonfokalmikroskopieTransmissionselektronenmikroskopieFM1 43 FarbstoffaufnahmeFM1 43 Farbstofffreisetzung

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