FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Danielle L. Kopke; Kendal Broadie

doi:10.3791/57765

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Methodenartikel

FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

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DOI:

10.3791/57765

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24. Mai 2018

Danielle L. Kopke¹ , Kendal Broadie²

¹Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, ²Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Synaptischen Vesikel (SV) Radfahren ist der Kern-Mechanismus der interzellulären Kommunikation bei neuronalen Synapsen. FM-Farbstoff-Aufnahme und Veröffentlichung sind die Primärmittel des quantitativ prüfen SV Endo- und Exozytose. Hier vergleichen wir alle stimulationsmethoden FM1-43 Radfahren an der Drosophila neuromuskulären (NMJ) Modell Synapse zu fahren.

Zusammenfassung

FM-Farbstoffe werden verwendet, um die synaptischen Vesikel (SV)-Zyklus zu studieren. Diese amphipathische Sonden haben einen hydrophilen Kopf und hydrophoben Schweif, so dass sie mit der Fähigkeit, reversibel betreten und verlassen der Membran Lipid Bilayer wasserlöslich. Diese Styryl-Farbstoffe sind relativ nicht fluoreszierenden in wässrigen Medium, aber Einfügung in die äußeren Broschüre der Plasmamembran verursacht einen > 40 X Anstieg der Fluoreszenz. In neuronalen Synapsen sind FM Farbstoffe beim SV Endozytose, verschleppte sowohl innerhalb als auch zwischen SV Pools, und veröffentlichte mit SV Exozytose, bietet ein leistungsstarkes Tool zur Visualisierung der präsynaptischen Stadien der Neurotransmission verinnerlicht. Einen primären genetischen Modell von glutamatergen Synapsen Entwicklung und Funktion ist der Drosophila neuromuskulären Synapse (NMJ), wo FM färben Bildgebung weitgehend verwendet worden ist, SV Dynamik in einer Vielzahl von mutierten Bedingungen zu quantifizieren. NMJ synaptischen Terminals ist leicht zugänglich, mit einer schönen Auswahl an großen synaptischen Boutons ideal für imaging-Anwendungen. Hier, wir vergleichen und kontrastieren die drei Möglichkeiten zur Förderung der Drosophila NMJ aktivitätsabhängige FM1-43 Farbstoff Aufnahme/Entlassung zu fahren: (1) Bad Anwendung hoher [K⁺] zu depolarisieren neuromuskuläre Gewebe, 2) Saug-Elektrode motorischen Nerven Anregung zu depolarisieren den präsynaptischen Nerv Klemme, und 3) gezielte transgene Ausdruck Channelrhodopsin Varianten für Licht angeregt, räumliche Kontrolle der Depolarisation. Jede dieser Methoden hat vor- und Nachteile für die Untersuchung der genetischen Mutation Auswirkungen auf die SV-Zyklus bei Drosophila NMJ. Wir besprechen diese vor- und Nachteile, die Auswahl der Stimulation Ansatz, zusammen mit den Methoden, die spezifisch für jede Strategie zu unterstützen. Neben fluoreszierende Bildgebung können FM Farbstoffe Photoconverted Elektron-Dichte Signale mit Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um SV Zyklus Mechanismen Ultrastrukturforschung Ebene zu studieren visualisiert werden. Wir bieten die Vergleiche der konfokalen und Elektronenmikroskopie imaging aus den verschiedenen Methoden der Drosophila NMJ Stimulation zu helfen die Auswahl der zukünftigen experimentelle Paradigmen.

Einleitung

Die wunderschön gekennzeichnet Drosophila larvalen neuromuskulären (NMJ) glutamatergen Synapse Modell hat Untersuchung Synapse Bildung und Funktion mit einem weiten Spektrum von genetische Störungen¹verwendet. Das Motoneuron-Terminal besteht aus mehreren Axon Verzweigungen, jeweils mit vielen erweiterten synaptischen Boutons. Diese geräumigen Krampfadern (bis zu 5 µm im Durchmesser) enthalten alle die Neurotransmission Maschinen, einschließlich einheitliche glutamatergen synaptischen Vesikel (SVs; ~ 40 nm im Durchmesser) in cytosolischen Reserve und leicht lösbaren Becken². Diese Bläschen dock an der präsynaptis....