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Methodenartikel

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

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DOI:

10.3791/57769

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15. September 2018

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1Department of Bioengineering, University of California Los Angeles, 2Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington, 3School of Optical and Electronic Information, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Biomedical Engineering, OSHU

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Zusammenfassung

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie hat seit schnelle Bildakquisition mit eine hohe axiale Auflösung von Mikrometer, Millimeter-Skala weit verbreitet. Traditionelle Licht-Blatt Techniken beinhalten die Verwendung von einem einzigen Beleuchtung Strahl orthogonal auf Probe Gewebe gerichtet. Bilder von großen Proben, die mit einem einzigen Beleuchtung Balken hergestellt werden Streifen oder Artefakte enthalten und leiden unter einer reduzierten Auflösung aufgrund der Streuung und Absorption von Licht durch das Gewebe. Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Strahl und eine vereinfachte Klarheit optische clearing-Technik für das murine Herz. Diese Techniken ermöglichen tiefere Bildgebung durch Lipide aus dem Herzen entfernen und produzieren einen großen Bereich der Bildgebung, größer als 10 x 10 x 10 mm3. Als ein Ergebnis dieser Strategie ermöglicht es uns, quantifizieren die ventrikulären Dimensionen, die kardiale Abstammung zu verfolgen und die räumliche Verteilung der Herz-Kreislauf-spezifische Proteine und Ionenkanäle aus der postnatalen zu Erwachsenen Mäuseherzen mit ausreichendem Kontrast zu lokalisieren und Auflösung.

Einleitung

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war eine Technik, die erstmals im Jahre 1903 entwickelt und dient heute als eine Methode, Genexpression zu studieren und auch 3-d- oder 4-D-Modelle von Gewebe Proben1,2,3zu produzieren. Dieses bildgebende Verfahren verwendet eine dünne Folie aus Licht um zu eine einzige Ebene einer Probe zu beleuchten, so dass nur das Flugzeug vom Detektor erfasst wird. Die Probe kann dann in axialer Richtung auf jeweils erfassen verschoben werden Schicht, einen Abschnitt in einer Zeit, und machen Sie ein 3-d-Modell nach der Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder4. Allerdings hat aufgrund der Absorption und Streuung von Photonen, LSFM Proben beschränkt, die entweder wenige Mikrometer dick sind oder optisch transparenten1.

Die Grenzen der LSFM führten zu umfangreichen Studien von Organismen, die Gewebe, die optisch transparent, wie dem Zebrafisch. Studien mit kardialen Entwicklung und Differenzierung werden häufig auf Zebrafisch durchgeführt, da gibt es konservierte Gene zwischen Mensch und Zebrafisch5,6. Obwohl diese Studien zu Fortschritten in der kardiologischen Forschung in Bezug auf Kardiomyopathien6,7geführt haben, muss es noch eine ähnliche forschen auf höherer Ebene Organismen wie Säugetiere.

Säugetier-Herzgewebe Herausforderung eine durch die Dicke und die Deckkraft des Gewebes, die Absorption durch Hämoglobin in den roten Blutkörperchen und das Striping, das durch einseitige Beleuchtung der Probe unter traditionellen LSFM Methoden1 auftritt , 8. um diese Einschränkungen zu kompensieren, haben wir vorgeschlagen, beidseitige Beleuchtung und eine vereinfachte Version der Klarheit Technik9 kombiniert mit einem Brechungsindex passende Lösung (Felgen) zu verwenden. Daher ermöglicht dieses System für die Darstellung einer Probe, die größer als 10 x 10 x 10 mm3 während Aufrechterhaltung eine gute Auflösung in den axialen und lateralen8Flugzeuge.

Dieses System wurde zunächst kalibriert mit fluoreszierenden Perlen in verschiedenen Konfigurationen innerhalb der Glasröhren angeordnet. Dann wurde das System verwendet, um nach der Geburt und Erwachsenen murinen Herzen Bild. Erstens war das postnatale Maus Herz 7 Tage (P7), offenbaren die ventrikuläre Hohlraum, die Dicke der Ventrikelwand, die Ventil-Strukturen und das Vorhandensein von Trabeculation abgebildet. Zweitens wurde eine Studie durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die in Kardiomyozyten differenzieren würde mithilfe einer postnatalen Maus Herz am 1 Tag (P1) mit Cre-Label Kardiomyozyten und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP). Zu guter Letzt wurden Erwachsener Mäuse mit 7,5 Monaten abgebildet, um das Vorhandensein von renal äußeren medulläre Kalium (ROMK) Kanäle nach Gen Therapie8beobachten.

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Protokoll

Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren wurden durch institutionelle Review Komitees (IACUC) an der University of California, Los Angeles, Kalifornien genehmigt.

(1) Imaging-System-Setup

Hinweis: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2.

  1. Einen kontinuierliche Welle (CW)-Laser mit 3 Wellenlängen abrufen: 405 nm, 473 nm und 532 nm. Platz 2 Spiegel (M1 und M2) 150 mm auseinander und richten Sie sie mit ihren Spiegelebenen um 45° zum Strahl.
    Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Laser entfernt das beidseitige Beleuchtung Setup umleiten. Der resultierende Strahl wird in die gleiche Richtung wie der erste Strahl sein.
  2. Übergeben Sie den Strahl durch ein 25-mm-Durchmesser Irisblende/Lochkamera (PH), einen Durchmesser von 50 mm Graufilter (NDF) mit einer optischen Dichte-Bereich von 0 - 4.0, ein Strahl-Expander (BE), 30 mm Schlitz (S) mit der Breite von ~ 0 - 6 mm und einem Spiegel (M3) , alle 150 mm voneinander positioniert. Platzieren Sie den Spiegel mit der Spiegelebene auf 45° zum Balken.
  3. Übergeben Sie den Strahl durch ein 50: 50 Strahlteiler platziert 150 mm vom M3. Setzen Sie einen Spiegel (M6) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in Vorwärtsrichtung ausgegeben wird. Verwenden Sie den reflektierten Strahl, um der Dual-Beleuchtung-Licht-Blatt zu bilden.
  4. Setzen Sie einen Spiegel (M4) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in einem 90 °-Winkel von der Strahlteiler emittiert wurde. Setzen Sie einen zweiten Spiegel (M5) 150 mm von der M4 und richten Sie es so aus, dass die Spiegelebene auf 45° zu den Strahl von M6 reflektiert wird. Verwenden Sie den Strahl emittiert von M5 auf der zweiten Seite des Dual-Beleuchtung Licht Bogens bilden.
  5. Die beidseitige Beleuchtungssystem in einer symmetrischen Weise einrichten (siehe Abbildung 1). Legen Sie eine Zylinderlinse (CL1) [Durchmesser (d) = 1; Brennweite (f) = 50 mm] 150 mm im Einklang mit den Strahl emittiert von M5 einerseits mit einer anderen identisch Zylinderlinse (CL2) 150 mm im Einklang mit der Strahl von M6 auf der anderen Seite des Dual-Beleuchtung Setu emittiert p. Platz 2 Spiegel (M7 und M8) jeweils im Einklang mit der Zylinderlinsen im Abstand von 50 mm bis den Strahl im 90 °-Winkel zu reflektieren.
  6. Bilden Sie eine achromatische Wams aus einem Paar von Linsen. Legen Sie das erste Objektiv, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm von M7 und die zweite Linse L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm von L1. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite der Dual-Beleuchtung mit identischen Linsen (L3, L4) den gleichen Abstand von M8 platziert.
  7. Statt Spiegel, M9 und M10, 60 mm von Linsen L2 und L4, bzw., und im Einklang mit den Strahl. Legen Sie die Beleuchtung Ziele, OL1 und OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm M9 und M10 und im Einklang mit den Strahl. Der Strahl emittiert von den Zielen bildet das leichte Blatt für die Proben-Bildgebung.
  8. Verwenden Sie einen 3-d-Drucker zum Drucken der Probenhalter aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS). Eine Stück Deckglas einbetten [Brechungsindex (RI) = 1.4745] auf jeder Seite der Kammer, senkrecht zur Beleuchtung Strahl, Brechungsindex Fehlanpassungen zu minimieren. Platzieren Sie gleichmäßig die Kammer zwischen die Balken von der Objektivlinsen emittiert.
  9. Installieren Sie ein Stereo-Mikroskop mit 1 X Vergrößerung Objektive und eine wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera senkrecht bis hin zur Beleuchtung Flugzeug (siehe Abbildung 2).

(2) Imaging System-Kalibrierung

  1. Abrufen von fluoreszierenden Polystyrol-Kügelchen, die 0,53 µm im Durchmesser sind.
  2. Bereiten Sie die fluoreszierende Bead Probe durch Verdünnung der Wulst-Lösung im Brechungsindex passende Lösung (Felgen vor) mit 1 % niedrig schmelzend zeigenden Agarose, 1: 150, 000. Schneiden Sie ein Stück von Borosilikatglas Schläuche mit einem Innendurchmesser von 12 mm und einem Außendurchmesser von 18 mm auf einer Länge von 30 mm.
    Hinweis: Borosilikat-Glasröhren wird verwendet, um den Brechungsindex (1,47) übereinstimmen.
  3. Mischen Sie die verdünnte Bead Probe mit 1 % Agarose und pipette die Perle/Agarose-Lösung in den Borosilikat-Schlauch. Lassen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.
  4. Füllen Sie die ABS-Kammer (aus Schritt 1,7) mit einer 99,5 % Glycerin-Lösung. Legen Sie die Borosilikatglas-Schläuche mit den Kügelchen im Inneren der Kammer. Legen Sie der ABS-Kammer in dem abbildenden System, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen.
  5. Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Steuerung der Bewegung und Ausrichtung der Probe in der ABS-Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).
  6. Bilder mit der Kamera sCMOS mit einer Rate von 30 Frames pro Sekunde (fps) zu erwerben. Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in seitlicher Richtung bewegen und Abrufen von Bildern bei jeweils 1 mm Inkrement sCMOS Kamera benutzen. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden.
  7. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die Point-spread-Funktion (PSF) des Systems über diese Perle Bilder. Verwenden Sie diese PSF für Dekonvolution während der Bildverarbeitung in späteren Schritten.

3. die Probenvorbereitung

  1. Sezieren Herzen aus einem Wild-Typ P1-Maus und eine doppelte heterozygot Sarcolipin-Cre knockin Maus mit dem Rosa26-YFP-gen (SlnCre / +; R26YFP Reporter / +) auf P7.
    Hinweis: Euthanasie erfolgte mittels Pentobarbital und die Technik von Robbins Et Al. beschrieben 10. die Präparation erfolgte nach der Technik von der National Heart, Lung und Blood Institute (NHLBI)10,11beschrieben.
  2. Führen Sie eine chemische Reinigung der murinen Herzen wie von Kevin Sung Et Al. beschrieben 12.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, da die verwendeten Chemikalien giftig sind.
    1. Spülen Sie die Herzen in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 3 X 10 min. lang. Nach dem Spülen, legen Sie die Herzen in einen 4 % Paraformaldehyd Lösung und inkubieren Sie diese Proben bei 4 ° C über Nacht.
    2. Legen Sie die Proben in einer 4 % Acrylamid-Lösung mit 0,5 % w/V von 2, 2'-Azobis Dihydrochloride. Lassen Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Entfernen Sie nach der Übernachtung Inkubation die Proben und inkubieren sie bei 37 ° C für ca. 2-3 h.
    3. Spülen Sie die Proben mit PBS und dann legen Sie sie in einer Lösung von 8 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat und 1,25 % w/V Borsäure. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C, bis sie klar sind. Dies kann je nach der Dicke der Probe mehrere Stunden dauern. Entfernen Sie nach der Reinigung die Proben zu und legen Sie sie in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung für 1 Tag.
    4. Bereiten Sie einen passende Lösung mit 40 g nichtionische Dichte Gradienten Medium Brechungsindex (siehe Tabelle der Materialien) in 30 mL 0,02 M Phosphatpuffer (PB), 0,1 % Tween-20 und 0,01 % Natriumazid. Bringen Sie die Lösung einen pH-Wert von 7,5 mit Natriumhydroxid.
  3. Legen Sie die gelöschte Probe in Felgen mit einem Brechungsindex von 1,46-1,48 und 1 % Agarose. Legen Sie die Probe in Borosilikat-Glasröhren und ermöglichen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.
  4. Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).

(4) Erwachsene Herz Imaging

  1. Injizieren Sie 8,7 x 1012 -Viren des Typs Adeno-assoziierten Virus Vektor 9 (AAV9) mit einem Promotor der Herz-Kreislauf-spezifische Troponin T (cTnT) und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in einem 100 μL Volumen in die Rute Vene Mausklick 2-monatigen Wildtyp (C57BL/6).
    Hinweis: Die AAV9 wurde nach der Technik von Yuan Et Al. beschrieben entwickelt. 13. dadurch GFP binden an die renale äußeren medulläre Kaliumkanal (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP Produktion (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Sezieren Sie die Erwachsenen Mäuseherzen 7,5 Monate alt nach der Technik von NHLBI11beschrieben. Bereiten Sie die Proben mit Schritten 3.1-3.3 vor.
  3. Verbinden Sie den motor Controller mit dem motorischen Antrieb. Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle den Aktor beimessen und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer.
  4. Positionieren Sie die Probe, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen. Abrufen von Bildern mit der sCMOS Kamera mit einer Rate von 100 fps.
  5. Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in axialer Richtung bewegen und Bilder bei jedem Inkrement 1 mm mit sCMOS Kamera erwerben. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden.
    Hinweis: Das System wird durch einen eigens entwickelten Instrument-Steuerungs-Software gesteuert.
  6. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). 3-d-Bilder mit diesen Bild-Stacks und die Visualisierung Software14zu entwickeln. Deconvolve die PSF aus Schritt 2.6 mit den erworbenen Bildstapel. Legen Sie einen Pixel Intensität Schwellenwert zu beobachten die Konturen des Herzens und Pseudo-Farbe hinzufügen, um die Bilder anhand dieser Grauwert-Intensität.

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Ergebnisse

Die beschriebene Technik verwendet hier einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich von Maus Herz Gewebeproben um zu einer tieferen bildgebenden Tiefe und ein größeres Volumen der Bildgebung mit ausreichender bildgebenden Auflösung (Abbildung 1) zu erreichen. Zur Kalibrierung des Systems wurden fluoreszierende Kügelchen im Inneren der Glasröhren und innerhalb des Systems der bildgebenden platziert. Die Perlen waren dann abgeb...

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Diskussion

Das LSFM System und die hier beschriebene Technik nutzt einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich Bild Maus Herzen postnatale und Erwachsenen Stadium seiner Entwicklung. Ein traditionelle einheitliche Beleuchtung Strahl leidet Photon Streuung und Absorption durch dicker und größer Gewebe Proben1,3. Die beidseitige Träger bieten eine gleichmäßigere Ausleuchtung der Probe, so dass die Wirkung von Striping und andere Artefakte, di...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Thao Nguyen und Atsushi Nakano von der UCLA danken für die Bereitstellung der Mäuse Probe Bild. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (um Tzung K. Hsiai), HL083015 (zu Tzung K. Hsiai), HD069305 (zu N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (zum Tzung K. Hsiai und N. C. Chi), HL129727 (zu Tzung K. Hsiai) und University of Texas System STARS Mittel (für Juhyun Lee).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CW LaserLaserglow TechnologiesLMM-GBV1-PF3-00300-05Anregung von Fluorophoren
NeutraldichtefilterThorlabsNDC-50C-4MSteuert die Lichtmenge des einfallenden Lichts
Achromatischer Strahlaufweiter ThorlabsGBE05-AErweitert den Lichtstrahl
Mechanischer SpaltThorlabsVA100CSteuert die
StrahlteilerThorlabsBS013Bildet einen Strahl mit doppelter Beleuchtung
Stereomikroskop mit 1X ObjektivOlympusMVX10Wird für die Beobachtung von Proben
verwendet ORCA-Flash4.0 LT sCMOS-KameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UWird für die Aufnahme von Bildern
verwendet Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)StratasysuPrintMaterial für den 3D-Druck eines Probenhalters
Fluoreszierende PolystyrolkügelchenSpherotech IncPP-05-10Wird für die Kalibrierung von Bildgebungssystemen verwendet
BorosilikatglasröhrenCorningPyrex 7740Schläuche für die Probeneinbettung
GlycerinFisher ScientificBP229-4Füllung für Probenkammer
Phosphatgepufferte KochsalzlösungFisher ScientificBP39920Spüllösung für Mäuseherzen
ParaformaldehydElektronenmikroskopie WissenschaftRT-15700Erste Inkubationslösung
AcrylamidWako ChemicalsAAL-107Gemischt mit 2,2'-Azobisdihydrochlorid für die zweite Inkubationslösung für Mausherzen
2,2'-Azobis DihydrochloridWako ChemicalsVA-044Gemischt mit Acrylamid für die zweite Inkubationslösung für Mausherzen
Natriumdodecylsulfat Sigma Aldrich71725Gemischt mit Borsäure für die dritte Inkubationslösung für Mausherzen
BorsäureFischer ScientificA74-1Gemischt mit Natriumdodecylsulfat für die dritte Inkubationslösung für Mäuseherzen
Sigma D2158Sigma AldrichD2158Gemischt mit PB, Tween-20 und Natriumazid als Brechungsindex-Matching-Lösung
Tween-20Sigma Aldrich11332465001Gemischt mit Sigma D2158, PB und Natriumazid als Brechungsindex-Matching-Lösung
NatriumazidSigma AldrichS2002Gemischt mit Sigma D2158, PB und Tween-20 als Brechungsindex-Matching-Lösung
Adeno-assoziierter Virusvektor 9 mit einem herzspezifischen Troponin-T-Promotor, markiert mit GFPVectorBiolabs VB2045Exprimiert GFP, wenn es an ROMK
DC Servo Motor ActuatorThorlabsZ825BWird für die Bewegung der Probe in axialer Richtung innerhalb des Lichtblechs
verwendet K-Cube Brushed DC Servomotor ControllerThorlabsKDC101Verbindet sich mit dem Motorantrieb und steuert die Bewegung des Aktuators
AmiraFEI SoftwareN/AVisualisierungssoftware zur Erstellung von 2D- und 3D-Bildern
Strahlbreite gebunden ist

Referenzen

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