Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

Kumar Perinbam; Albert Siryaporn

doi:10.3791/57844

Methodenartikel

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

DOI:

10.3791/57844

⸱

27. Juni 2018

Kumar Perinbam¹ , Albert Siryaporn¹^,²

¹Department of Physics and Astronomy, University of California, ²Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Virulenz von planktonischen oder Oberfläche befestigt Bakterien mit D. Discoideum (Amöben) als Host zu messen. Virulenz wird gemessen über einen Zeitraum von 1 h und Host töten wird quantifiziert mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse. Wir zeigen dieses Protokoll mit dem Bakterium p. Aeruginosa.

Zusammenfassung

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Traditionelle bakteriellen Virulenz Tests beinhalten über längere Zeit Bakterien im Laufe von mehreren Stunden auf Wirtszellen. Während dieser Zeit können Bakterien in der Physiologie aufgrund der Exposition gegenüber Hostumgebung Wachstum und das Vorhandensein von Wirtszellen verändern. Wir entwickelten einen Test um den Zustand der Virulenz der Bakterien schnell zu messen, die das Ausmaß zu minimieren, um das Bakterien in Gegenwart von Wirtszellen wachsen. Bakterien und Amöben sind miteinander vermischt und auf einen einzigen Abbildungsebene mit einer Agar-Pad immobilisiert. Das Verfahren nutzt einzellige Fluoreszenz-Bildgebung mit Calcein-Acetoxymethyl Ester (Calcein-AM) als Indikator für Host Zellgesundheit. Die Fluoreszenz von Wirtszellen ist nach 1 h von Wirtszellen Bakterien ausgesetzt zu sein mit Epifluoreszenz mikroskopie analysiert. Bildanalyse-Software wird verwendet, um einen Host-Tötung-Index zu berechnen. Diese Methode wurde verwendet, um die Virulenz innerhalb von planktonischen und Oberfläche befestigt Pseudomonas Aeruginosa Messen Sub-Populationen in der Anfangsphase der Biofilmbildung und andere Bakterien und andere Wachstumsstadien Biofilm angepasst werden kann. Dieses Protokoll bietet eine schnelle und robuste Methode zur Messung der Virulenz und vermeidet viele der komplexen Zusammenhang mit Wachstum und Erhalt von Säugetieren Zelllinien. Virulenz Phänotypen mit Amöben hier gemessen wurden auch mit Maus Makrophagen validiert. Insbesondere wurde dieser Assay verwendet, um die Oberfläche Anlage reguliert Virulenz in p. Aeruginosazu etablieren.

Einleitung

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Bakterielle Infektion gehört zu den führenden Todesursachen in Mensch und Tier¹^,². Die Fähigkeit, Virulenz der Bakterien in Kulturen oder Biofilme zu messen ist wichtig in Medizin und Forschung Einstellungen. Hier beschreiben wir eine vielseitige, schnelle und relativ einfache Methode, um bakterielle Virulenz zu quantifizieren. Die Eukaryotische Organismus Dictyostelium Discoideum (Amöben) dient als Modell Wirtsorganismus. D. Discoideum wurde als Host verwendet, um Virulenzfaktoren in Pseudomonas Aeruginosa (p. Aeruginosa)³^,

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Protokoll

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Alle experimentelle Verfahren erfolgten an der University of California, Irvine.

1. Puffer und Lösungen

Bereiten Sie Lysogeny Brühe (LB) in einer 1 L Glasflasche durch Zugabe von LB-Miller-Mischung 25 g in 1 L bidestilliertem Wasser (DdH₂O vor). Fügen Sie für Petrischalen eine zusätzliche 20 g Agar. Autoklav zu sterilisieren. Gießen Sie 25 mL des flüssigen Agar Medium in 10 cm-Durchmesser-Petrischalen und bei Zimmertemperatur erstarren lassen. Speichern von flüssigen Medien bei Raumtemperatur und Agarplatten bei 4 ° C.
Bereiten Sie Glukose Hefe Pepton (Gips) Platten in eine 1 L-Glas-Flasche durch das Mischen v....

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Ergebnisse

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Wir wuchsen Wild-Art p. Aeruginosa Belastung PA14¹⁹ oder eine ΔLasR ²⁰ im gleichen PA14 Hintergrund in 6 cm Durchmesser-Petrischalen belasten und die Virulenz von planktonischen und Oberfläche angebracht Zellen untersucht. Kulturen wurden aus einzelnen Kolonien in PS:DB Kulturen, gewachsen über Nacht in Kultur Röhren in eine Bandage bei 37 ° C, Sättigung geimpft, verdünnt 1: 100 in PS:DB, für 8 h in 6 cm Durchmesser Petrisc.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt eine rasche und quantitative Methode zur Virulenz in p. Aeruginosaassay. Dieses Protokoll kann mit anderen Bakterien getestet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass das Wachstumsmedium mit der Amöbe Wachstumsbedingungen kompatibel sein sollten. Insbesondere haben wir das Protokoll mit PS:DB als das Bakterienwachstum Medium optimiert. Wenn andere Medien verwendet werden, ist es möglicherweise erforderlich, Wachstumskontrolle Medien nur durchzuführen, bei denen gibt es keine ba.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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KP und AS schrieb und das Manuskript überarbeitet. KP durchgeführt die Experimente und die Analyse. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) Career Transition Award (K22AI112816), as unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ReagenzienBacto-Agar
, dehydriert	BD Difco	214010
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL und lagern bei -20 μg; C
Calcein-acetoxymethylester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calciumchlorid, wasserfrei	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D5879
Folsäure	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesiumchlorid	Sigma-Aldrich	M8266
Hefeextrakt	Oxoid	LP0021
Spezialpepton	Oxoid	LP0072
Kaliumhyroxid	Fisher Chemical	P250
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	P0662
Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Stämme
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Stamm AX3¹⁸
Escherichia coli	Siryaporn lab	Stamm B/r¹⁷
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 Stamm¹⁹
Pseudomonas aeruginosa & Delta; lasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-abgeleiteter Stamm²⁰
>Supplies
0.22 µ m Filter	Millipore	SCGPT01RE	Für die Filtersterilisation
Konisches Röhrchen, 15 mL	Corning	352097
Vorratsflaschen aus Glas	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petrischale, 6 cm Durchmesser	Corning	351007	60 x 15 mm Polystyrolplatten
Petrischale, 10 cm Durchmesser	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm Polystyrolplatten
Kunststoffbehälter mit Deckel	Ziploc	2.57E+09	Quadratische 3-Tassen-Behälter
Glasplatten	Bio-Rad	1653308	Zur Zubereitung von Agarpads. Andere Glasplatten können mit ähnlichen Abmessungen verwendet werden.
Holzstäbchen	Fisher	23-400-102
Ausrüstung
Eclipse Ti-E Mikroskop	Nikon	MEA53100	Mikroskop-Setup
10X Plan Fluor Ph1 Objektiv 0,3 NA	Nikon	MRH20101	Mikroskop-Setup
Fluoreszenzanregungsquelle	Lumencor	Sola Light Engine	Mikroskop-Setup
Fluoreszenzfilter-Set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Aufbau des Mikroskops
Orca Flash 4.0 V2 Kamera	Hamamatsu	77054098	Einrichtung des Mikroskops
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software für die Bildanalyse
MATLAB	Mathworks	R2013	Software für die Bildanalyse
Orbitalschüttler Inkubator	VWR	89032-092	Für das Wachstum von Bakterien bei 37 & Grad; C
Plattformschüttler	Fisher	13-687-700	Für das Wachstum von Amöben bei 22 > C
Spektralphotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Untertisch-Kühlbrutator	Fisher	97990E	Für das Wachstum von Amöben bei 22 > C
Isotemp Wasserbad	Fisher	15-462-21Q	Für die Kühlung von Medien bis 55 & Grad; C

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology<....

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Amoeb be Wirtszellen Calcein AM Fluoreszenz bildbasierte Analyse Pseudomonas aeruginosa oberfl chengebundene Bakterien planktonische Zellen Wirtszell Killing Index Epifluoreszenzmikroskopie Agar Pad Immobilisierung

Einen schnellen Image-basierte bakteriellen Virulenz-Assay mit Amöben

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