Summary
여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.
Abstract
세포종 님 (GBM), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암은 일반적으로 빈약한 예 지와 연결 하 고 지난 10 년간 부족 한 효율적인 치료 제안 되었습니다. 새로운 치료 전략을 디자인 하기 위한 유망한 후보자 중 세포 immunotherapies는 높게 침략 적 제거 하 표적이 되었습니다 및 항 암 치료-radioresistant 종양 세포, 가능성이이 암의 신속 하 고 치명적인 재발 있습니다. 따라서, 종양 주변 인간 Vϒ9Vδ2 T 림프 톨 같은 수용자 GBM 반응 면역 세포 이펙터의 administration(s) 것이 효율적 제공 하는 독특한 기회 나타내고 고도로 집중에 직접 치료제를 뇌 악성 사이트입니다. 여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 intrabrain 종양 침대에서 수용자 인간 림프 톨의 정위 적 주사에 의존 하는 이러한 세포 immunotherapies의 antitumor 효능에 대 한 전 임상 증거의 개념을 제공 합니다.
Introduction
GBM (누가 학년 4 astrocytoma), 성인에서 가장 자주 하 고 공격적인 주 뇌 암 이다. 수술과 라디오 화학 요법을 결합 하는 적극적인 치료에도 불구 하 고 GBM는 매우 빈약한 예 지 (14.6 개월 및 2 년 사망률 > 73%의 메디아 생존)1와 관련 남아 있습니다. 이 몇 가지 효율적인 치료 발전2지난 10 년 동안 검증 된 증거. 더 효과적인 치료 전략3,,45의 디자인에 대 한 후보자, 중 immunotherapies6 현재 탐험 추적 하 고 매우 침략과 라디오/항 암 치료-방지 종양 제거 셀, 신속 하 고 치명적인 종양 재발7에 그들의 주요 기여에 대 한 의심. 다양 한 잠재적인 면역 목표 식별 및 제안 immunotherapies, 자연 관련 된 또는 수정 된 αβ 또는 GBM 특정 종양 항 원 등 스트레스 유발 분자8,9, ϒδ T 림프 톨 했다 10. 선택한 GBM 반응 면역 세포 이펙터 관리 가능성 잔여 악성의 사이트에 직접 효과 기 림프 톨의 높은 금액을 제공 하는 독특한 기회를 나타냅니다. 이 전략을 지원 하기 위해 우리가 최근에 나타났습니다 orthotopic 기본 인간의 GBM xenografts를 충실 하 게 수행 하는 immunodeficient 마우스에 따라 모델 GBM 환자9,11에서 뇌 종양의 개발을 정리. 또한, 이러한 모델 adoptively 전송된 수용자 인간 Vϒ9Vδ2T 림프 톨의 강한 antitumor 효율을 보여 주기 위해 사용 되었다.
이 프로토콜 GBM, 수용자 T 림프 톨의 입양 이동에 따라 같은 뇌종양의 정위 적 immunotherapies를 달성 하기 위한 중요 한 실험 단계를 설명 합니다. 문서 쇼: (i) 인간 림프 톨 Vϒ9Vδ2T; 같은 치료 수용자 면역 효과 기 T 세포의 증폭 (ii) 분사;에 대 한 이러한 이펙터 T 림프 톨의 준비 (뇌 종양 근처에서 정위 적 관리를 위한 절차 iii). 이 문서는 또한 정위 적 주입 후 이러한 셀룰러 이펙터의 동작에 대 한 통찰력을 제공합니다.
여기에 제시 된 치료 방법은 20 x 106 effector 세포 당 복용량의 각 뇌 종양 베어링 immunodeficient 마우스에 대 한 주입을 기반으로 합니다. 초기 생체 외에서 확장 단계는 면역 세포의 대량 생산 해야 합니다. 따라서, 일반적인 셀 확장 phytohemagglutinin (PHA-L)를 사용 하 여 수행 됩니다 및 수용자 피더 세포 반구: 건강 한 기증자와 엡 스타인 바 바이러스 EBV 변형 B lymphoblastoid 셀에서 주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 라인 (BLCLs), 포함 하는 EBV 문화 비단 B95-8 셀 라인 1 µ g/mL cyclosporin A의 존재에서 표면에 뜨는 생체 외에서 감염에 의해 PBMCs에서 파생 된
GBM 반응 이펙터 면역 세포는 비교 하 고 분석 실험 체 외에 9에서 선택. 이러한 효과 기 세포 활성화 되 고 증폭 된 표준 프로토콜을 사용 하 여 (예를 들어, 인간의 Vγ9Vδ2 T 림프 톨9 또는 인간 항 헤 르 페 스 바이러스 αβ T 림프 톨12) 그들의 성격에 따라 정기적으로 > 80%의 최소 순도와 cytometric 분석에 의해 확인. 아래 상세한 셀 확장 프로시저는 다양 한 인간 림프 톨 부분 집합에 적용 됩니다.
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Protocol
다음 절차와 관련 된 동물 과목 (계약 #00186.02; 지역 윤리 위원회는 드 라 루아르 [프랑스]의) 기관 지침에 따라 수행 되었다. 인간의 PBMCs 정보 건강 한 기증자 (Etablissement 프랑스어 뒤 상 낭트, 프랑스)에서 수집 된 혈액에서 분리 했다. 모든 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다.
1. 특정 세포 독성 효과 기 T 세포의 확장
- 준비 하 고 35 Gy에서 피더 세포를 비추는. 2 x 105 -4 x 105 effector 세포 자극에 대 한 세 가지, 건강 한 기증자 로부터 10 x 106 PBMCs 및 1 x 106 BLCLs을 준비 합니다.
- 피더 세포와 RPMI 10% 열 비활성화 FCS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (100 IU/mL), 고 스 (0.1 µ g/mL) 및 300 IU/mL 재조합 일리노이-2와 보충의 15 mL에 이펙터 셀 resuspend.
- 1 µ g/mL의 최종 농도에 PHA-L을 추가 하 고 신중 하 게 혼합, 96-잘 U 바닥 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 150 µ L를 배포.
- 37 ° C에서 그리고 5% CO2 습도 분위기에서 품 어.
- 큰 셀 묶습니다 문화 우물에서 때까지 접시를 매일 확인 (~ 7 일).
- 1 x 106 셀/mL 신선한 문화 매체에서 문화 플라스 크로 셀을 전송 합니다.
- (주 2)를 계산 하 여 총 셀 수를 결정 하 고 신선한 문화 매체에 1 x 106 셀/mL에서 그들을 유지 합니다.
참고: 이펙터 면역 세포 휴식 상태 (초기 증폭 자극 후 보통 3 주)에서 치료 관리에 대 한 준비 되어야 합니다. 순도 이러한 효과 기 세포의 반응성 vivo에서 한 주사 (예를 들면, 생체 외에서 분석으로) 전에 검사 되어야 한다.
2. 수술 Effector 세포 준비
- 이펙터 세포 수를 확인 한 후 원심 분리 (300 x g 5 분)에 의해 50 mL 튜브에 효과 기 세포를 수집 합니다.
참고: 모든 손실에 대 한 보상 (예를 들어, 50 x 106) 세포의 과잉 준비. - 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS와 300 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 세척을 수행의 15 mL에 셀 resuspend.
- 신중 하 고 완전히 제거는 상쾌한 하 고 메 마른 PBS의 1 mL에 다음 셀 펠 릿을 resuspend.
- 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리에 대 한 1.5 mL microtube resuspended 셀을 전송 합니다.
- 신중 하 고 완전히 천천히 pipetting 여는 상쾌한을 제거 합니다.
- 마우스 마다 살 균 PBS의 8 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
참고:이 중요 한 단계입니다. - micropipette를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 측정 합니다. 필요한 경우 살 균 PBS (복용량 당 PBS의 15 µ L에서 20 x 106 셀)을 추가 하 고 신중 하 게 혼합.
- 마우스 당 최종 볼륨 15과 20 μ (명령적 < 20 µ L) 사이 micropipette를 사용 하 여 확인 합니다.
- 정위 적 주입까지 얼음에 셀을 계속.
참고: 이상의 3 h timepoints은 테스트 하지.
3. 정위 적 주입
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장비 설정
- 조립 하 고 intracranial 주사 (예를 들어, 주사기 크기, 원하는 볼륨 및 사출 속도)의 정확성을 보장 하는 제조업체의 지침에 따라 작은 동물 정위 적 프레임 보정.
참고: 느린 주입 속도 (즉, 2-3 µ L/min) 좋습니다. - 감염에서 미생물 안전 캐비닛 (MSC) 악기의 불 임을 유지 하 고 쥐를 보호 하기 위해 아래 자료를 설치 합니다.
참고: 장소 "등온선 진영" 37 ° c.에 물 목욕 이 시스템 수술 시 쥐의 저체온증을 제한 한다. 패드는 포스트 절차적 케어에 필요한 난방 지속적인 온도 모니터링 하는 동안 사용 해야 합니다.
- 조립 하 고 intracranial 주사 (예를 들어, 주사기 크기, 원하는 볼륨 및 사출 속도)의 정확성을 보장 하는 제조업체의 지침에 따라 작은 동물 정위 적 프레임 보정.
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수술 동물 준비
- 케 타 민 (10mg/mL) 및 xylazine (0.1 mg/mL) 마우스의 몸 무게의 10 µ L/g의 복 주사와 마우스 anesthetize
- 완전 한 마 취 및 진통 동물의 발가락 핀치 테스트를 수행 합니다.
참고: 모든 운동 비 깊은 진통의 표시 이며, 몇 분 작업을 반복 하기 전에 필요한 경우. - 일단 마우스 제대로 마 취가 위를 사용 하 여 (두 귀, 코까지) 사이 수술 사이트에서 모피를 제거.
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수술 세포 준비
- 신중 하 게 resuspend는 피 펫 셀 (여러 번) 셀 응집을 방지 하기 위해 각 주입 전에.
- 신중 하 게 거품의 열망을 피하기 위해 22-G microsyringe에 필요한 셀 서 스 펜 션 볼륨 (15-20 µ L)를 그립니다.
참고:이 셀 로드 단계는 microsyringe에는 주입 된 볼륨에 분산을 최소화 하는 것이 중요입니다. 셀 응집을 방지 하 고 이펙터 셀 관리는 일대에는 짝수를 위해 절차 사이 각 개별 주입에 대 한 셀을 다시 로드 합니다. - 그런 다음, 적응된 주사기 펌프에 주사기를 놓습니다.
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절차적 케어
- Povidone-요오드 5% 솔루션 적어도 3에에서 젖은 면봉으로 수술 부위의 소독 x.
- 어떤은 각 막의 건조를 방지 하기 위해 마우스의 눈에서 윤 활 안과 연 고를 배치 합니다.
- 위치는 따뜻한 등온선 블록에 정위 적 프레임에 마 취 마우스 수술 하는 동안 마우스의 온도 유지 하 고 사망률을 제한 하는 살 균 플라스틱 포장으로 커버.
참고: 마우스의 코 그리고 치아 해야 적절 하 게 배치 절차 중 적절 한 호흡기 흐름을 보장 하기 위해 치아 바 위에. - 일단 치아 바 위에 마우스를 위치 귀 바 머리를 고정 하는 마우스의 귀 아래 단단히 조입니다.
참고: 고 막 손상 하지 또는 호흡 타협 다는 것을 주의 하십시오. - 후부는 두개골을 폭로 앞쪽에서 두개골의 상단 부분을 따라 살 균가 위는 1-2 cm 중간 화살 피부 절 개를 확인 합니다.
- 화살과 코로나 봉합 (Bregma) ( 그림 1참조) 주입 전에 정위 적 지역화에 대 한 랜드마크로 서 역할을 교차로 식별 합니다.
- 이 이때 위의 microsyringe를 놓습니다.
- Microsyringe 오른쪽 측면 2 m m와 0.5 m m는 Bregma의 앞쪽을 이동 합니다.
- microdrill를 사용 하 여 미리 결정 된 좌표에 살 균 드릴 비트와 함께 두개골에 작은 구멍을 확인 합니다. 두뇌의 어떤 외상 성 상해를 피하기 위하여 표면 유지 주의 해야 합니다.
참고:이 프로토콜에 면역 세포는 설립된 종양 (종양 세포 주입 후 1 주일) 내 주입 했다. 피부 되어야 재개 (흉터) 및 사출 (구멍은 일반적으로 주사 후 2 주까지 여전히 존재) 종양 세포 이식에 사용 되는 같은 좌표에서 수행 됩니다. 좌표는 뇌 실질13,14에서 종양과 effector 세포를 주입에 대 한 선정 됐다.
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면역 효과 기 세포의 주입
- 조심 스럽게 드릴된 된 구멍에는 microsyringe를 삽입 하 고, 경질에서 아래로 3mm 고 효과 기 세포를 주입 하기 전에 2.5 m m의 최종 깊이를 다음 뒤로 0.5 m m 바늘을 앞으로 천천히 이동.
- 2-3 µ L/분 effector 세포 주입을 실행 하 고 주입 시간 따라 마우스를 모니터링.
- 주입이 완료 되 면만 1 m m의 바늘을 철회 하 고 천천히 주입 사이트에서 어떤 누설을 방지 하기 위해 microsyringe을 완전히 철수 하기 전에 추가 분 자리에는 microsyringe를 유지.
참고: 정위 적 장치에서 동물의 제거 다음 즉시 곧 실험에 대 한 주입 장비 청소.
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수술 치료 및 마우스의 후속
- 정위 적 프레임에서 동물을 제거 하 고 즉시 povidone-요오드 5% 솔루션 절 개 사이트에 적용 하 고 적절 한 수술 치료와 피부를 닫습니다.
- 상처에 직접 2 %lidocaine 젤을 적용 하 고 0.15 µ g/g buprenorphine의 사후 절차 진통에 대 한 피하 주입에 의해 관리.
- 적절 한 마우스 체온을 유지 하 고 어떤 저체온증을 피하기 위해 장소 다시 마 취 마우스 난방 패드 위에 그것의 감 금 소를 37 ° C로 설정 합니다.
참고: 별도 주거 필요는 없습니다. - 그것은 완전히 마 취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터 하 고 주택 룸에 그것을 전송.
참고: 날짜,이 프로토콜은 잘 지원 몇 외 합병증 발생 (주입 된 쥐의 < 5%)으로. - 매일 쥐를 모니터링 하 고 어떤 감소 건강 징후 (예를 들어, 돌출된 자세, 감소 이동성, 의식, 또는 중요 한 몸 무게 감량 [≥ 15%]) 관찰 하는 때 그들을 안락사.
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Representative Results
이 연구는 종양 침대 내에서 직접 수행 하는 정위 적 주사에 따라 종양을 들고 쥐의 뇌 내 세포 면역 효과 기 세포의 입양 전송의 전략을 설명 합니다.
큰 사출 량과 관련 된 뇌 손상의 모든 위험을 최소화 하려면 effector 세포 현 탁 액 (20 x 106 셀 PBS의 15-20 µ L에) 집중 될 필요가 있다. 이 셀 농도 단계 효과 기 세포의 생존에 영향을 미칠 수 여부를 확인 하려면이 셀 설명된 프로토콜에 따라 준비 하 고는 microsyringe에 로드 된 했다. 효과 기 세포는 microsyringe에 그들을 로드 후 즉시, 또는 10 분을 수집 했다. 셀은 propidium 요오드 화물 (PI)은 세포를 라이브 permeant cytometry 다른 timepoints (0, 24, 그리고 72 시간)에 의해 분석 된 형광 DNA intercalating 에이전트와 얼룩이 있었다. 결과 준비와 로드는 microsyringe에 크게 영향을 주지 않습니다 효과 기 세포의 생존 능력 (그림 2A와 2B) 적어도 24 시간 동안 보여줍니다. 72 시간에서 PI긍정적인 세포의 약간의 하지만-중요 한 증가 (14% 언로드된 셀 11%에 비해) 관찰 되었다. 비슷한 방법으로 준비 하 고 3 시간 동안 얼음에 유지 했다 effector 세포의 antitumor 반응성 분석 했다. 효과 기 세포는 안티 CD107a mAb의 존재 4 시간 동안 뇌 종양 세포와 cocultured 했다. 활성화 마커 CD107a, 유사한 제어 조건에서 얻은 값의 upregulation 효과 기 세포의 반응성 준비와 로드 microsyringe (그림 2C)에 의해 영향을 받지 않습니다 것을 나타냅니다.
효과 기 세포 생존 하 고 그들의 내부 종양 이식, 20 x 106 이펙터에 따라 뇌 실질 내에서 이동 하는 여부를 평가 셀 뇌종양 (GBM-111)를 운반 하는 쥐의 종양 사이트에 주입 했다. 1 주일 후, 두뇌 수집 했다, 고정, sectioned, 그리고 스테인드 되며, 오신, 및 safran 채색 (HES) 및 안티 인간 CD3 mAb (IHC)에 대 한. HES 채색 뇌종양 (그림 3, 왼쪽된 패널)의 구조를 식별합니다. CD3 얼룩 식별 및 지역화 이펙터 면역 T 세포 (여기, 인간 Vϒ9Vδ2 T 세포) (그림 3, 오른쪽 패널). 흥미롭게도, 효과 기 T 세포 검색 (그림 3, 오른쪽 위 패널), 종양 주위 종양 코어 (그림 3, 중간 오른쪽 패널), 뿐만 아니라 contralateral 반구 (그림 3, 하단 오른쪽 패널). 또한, 쥐의 뇌에서 뇌 세포의 2%를 대표 하는 그들의 주입 (4 x 106 αβ T 세포), 후 48 시간 고립 인간 T 림프 톨의 기능 분석 했다. 결과 수집 된 뇌 주입 이펙터 수용자 αβ T 세포 확장 일반적인 PHA 피더 세포 활성화 일리노이-2 (그림 4)의 수행 시 증식 나타냅니다.
함께, 이러한 결과 효과 기 T 세포 준비 하 고이 절차에 따라 관리 시간에 대 한 뇌의 생존과 종양 및 건강 한 뇌 조직 내 순찰 수 보여 줍니다. 이러한 절차 인간의 GBM 뇌 종양9,11의 개발을 제어를 수용자 인간의 휴식 Vϒ9Vδ2 T 세포의 치료 정위 적 행정의 antitumor 효율성을 평가 하기 위한 사용 되었습니다. 이러한 연구 증거 수용자 인간의 이펙터 T 림프 톨 종양 침대에서의 뇌종양을 운반 하는 쥐의 생존을 크게 향상 시킵니다. 흥미롭게도, 살아남은 마우스 감지 종양 세포, 따라서 완전 한 종양 제거를 나타내는 수행 하지 않았다.
그림 1 : 마우스 두개골에 주요 해부학 적 랜드마크의 그림. 화살 (빨간 선)와 화관 (파란 선) 봉합 및 사출 사이트의 방향을 하는 데 사용 그들의 교차점 (Bregma) 포함 됩니다. 눈금 막대에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 생존의 활성화 준비 이펙터 T 림프 톨. 효과 기 세포 (여기, 인간의 주변 Vϒ9Vδ2 T 세포 휴식) 증폭 되었고 설명 된 절차에 따라 준비. Propidium 요오드 화물 (PI)와 세포의 얼룩, 세포, 및 기능 활성화 permeant은 형광 화합물 intercalating DNA 수행 했다. 앞으로 (FSC-H) 대 측 (SSC-H)의 대표 작 흩어 게이팅 effector 세포 (왼쪽 패널)의 (A)이이 패널 표시 합니다. 히스토그램 문이 제어 림프 톨 (오른쪽 패널)의 PI 얼룩을 보여줍니다. PI긍정적인 림프 톨의 백분율 표시 됩니다. (B)이이 패널의 백분율을 나타냅니다 죽은 세포 (PI긍정적인) 즉시 수집 (밝은 파란색 선) 또는 지정 된 timepoints에서 측정은 microsyringe에서 10 분 (진한 파란색 선), 후. 제어, 언로드된 준비 셀 사용 되었다 (회색 선). (n = 3; ± SD; 의미 ns = 중요.) (C) CD107a 표면 동원 cytometry 어느 Vδ2긍정적인 제어 셀 (준비)에 의해 측정 되었다 또는 준비 얼음 (준비 + 3 h) 대상 인간의 기본 뇌 종양 세포와 coculture 다음에 유지 하는 세포. 림프 톨의 백분율은 각 cytometric 사분면에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 검출 및 이펙터 T 림프 톨 종양 방위 쥐의 뇌에서의 지역화. 1 주일 후 세포종 뇌 종양 이식, 이펙터 면역 세포 (여기, 인간의 주변 Vϒ9Vδ2 T 세포 휴식) 쥐의 두뇌에 주입 했다. Immunotherapeutic 치료 후 1 주일 두뇌 수집, 고정 되었고 구분. 뇌 섹션 immunohistochemistry 분석 (되며, 오신, 및 safran [HES] 채색) 착 색 했다 (왼쪽된 패널) 또는 안티-인간의 CD3 항 체 (오른쪽 패널)로 얼룩진. 표시 된 결과 3 개의 독립적인 실험의 대표. 눈금 막대에 표시 됩니다.
그림 4 : 이펙터 T 림프 톨의 활성화 치료 쥐의 뇌에서 수집. 휴식 인간 T 림프 톨 (여기, 4 x 106 인간 αβ T 림프 톨)는 NSG 쥐의 두뇌에 주입 했다. 48 시간 후, 두뇌 수집 되었고 해리. 인간의 뇌에 침투 T 림프 톨의 백분율 cytometry 안티 인간 CD3 항 체 (하단 패널)을 사용 하 여 측정 했다. 수집 된 셀 96 잘 U 바닥 접시와 자극된 (PHA 피더 세포와 일리노이-2) 20 일 (16 배로 주기)에 대 한 (10 셀/잘) 시드 했다. 하루 10, 13.3 x 10에 참고, 인간 T 림프 톨의6 (오른쪽 패널)를 획득 했다.
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Discussion
입양 전송 선정 네이티브 또는 조작된 면역 효과 기 세포 효율적으로 제한 비 변형 세포15에 대 한 reactivities의 infiltrative 뇌 암 같은 종양을 치료 하는 유망한 접근 방식을 나타냅니다. 16,,1718. 그러나, 중앙 신경 조직, 두뇌를 구성 하는 혈액-뇌 장벽의 존재와 고아 한 림프 배수 시스템19,20의 부족 때문에 특히 특정 면역 상태. 이러한 생리 적 기능 조직 인신 매매에 영향을 하 고 면역 세포의 조직 주사를 손상 수 있습니다. 극복 하기 위해 이러한 hindrances, intraparenchymal 주사 antitumor 셀 배달 되는 대신 로컬로, 약리 화합물21, 를 포함 하는 스피어에 관해서는 종양 사이트에 밀접 하 게 원칙에 탐험 되어 22. 한 반면에, 기관 내에서 세포의 제한 된 희석 그들의 antitumor 효율성을 향상 시킬 수 있습니다 하지만 그것은 또한 해로운 기계 또는 종양 적응 효과, 뇌 따라 개발 tissular 압축 등 증폭 종양 성장입니다. 이이 절차에서는 immunotherapeutic 주사의 작은 볼륨을 의미 합니다. 이 문제는 뇌에 종양 수 없습니다 수 수술 excised 동물 실험 모델에서 더욱 중요 하다. 이 문서에서는 준비 및 뇌 종양 특정 세포 이펙터, 수용자 인간 T 림프 톨의 정위 적 injection(s)에 따라 로컬 배달에 대 한 치료 방법을 설명 합니다.
이 연구는 인간의 GBM xenografts 들고 immunodeficient NSG 쥐에 준비 및 수용자 인간 Vϒ9Vδ2 T 림프 톨의 stereotaxic 배달을 보여줍니다. 이 프로토콜의 첫 번째 단계는 건강 한 기증자의 PBMCs에서 수용자 T 세포를 증폭, 순수 이펙터 T 림프 톨의 대량 생산 하는 표준 일반적인 PHA-지류-IL2 자극을 사용 하 여, 허용에 대 한 간단한 절차 설명 그들의 치료 이용23,24. 이 문서의 두 번째 단계는 T 림프 구 정지 stereotaxic 관리의 날에 휴식의 준비에 중점을 둡니다. 특히 초점 생존 및 선택한 이펙터 T 림프 톨의 기능에 영향을 주지 해야 높은 세포 밀도 요구 하는이 중요 한 단계에 배치 했다. 마지막으로, vivo에서 실험에 관한 효과 기 T 세포와 종양 코어 내의 그들의 주입의 준비 뿐만 아니라 강조 주변 뇌 조직에서에서 종양 내에서 뿐만 아니라 그들의 보급에 연관 된 그들의 순찰 하 고 침략 적인 종양 세포를 추적 하는 특정 능력. 중요 한 것은, 이러한 준비와 주입 방법 뇌 종양 세포의 특정 인식에 따라 뇌 내에서 활성화 될이 T 림프 톨의 기능을 유지 합니다. 이러한 뛰어난 특성에 T 세포의 기능을 구체적으로 보장 효율적으로 대상 고 GBM25의 특징 깊은 infiltrative 뇌 종양 세포를 제거. 노트의 특별 한 주의를 주입 하 고는 microsyringe의 제거 모든 뇌 병 변을 최소화 하는 또는 이펙터 셀 누수.
결론적으로,이 문서에는 수용자 인간의 안티 종양 세포, 뇌 종양의 주변 안에서 인간의 Vϒ9Vδ2T 세포, 휴식 등의 대용량을 제공 하기 위한 효율적인 절차를 설명 합니다. 중요 한 것은,이 치료 절차 하지 전송된 T 림프 톨 (예를 들면, 생존, 반응성) 또는 뇌 조직에 불리 한 효과와 함께 합니다. 기본 인간 GBM의 murine orthotopic 모델에 따라 최근 연구 Vϒ9Vδ2T 세포 효율적으로 뇌 실질9,11침투 깊이 종양 세포를 포함 하 여 GBM 셀 대상 증명 하고있다. 이러한 요소는 첫 번째 인스턴스에서 orthotopic 뇌종양을 들고 쥐와, 그럼, GBM 환자에 임상 연구에서 소설 입양 T 림프 톨 전송 절차의 적용 될 수 있는 개발을 위한 기회를 엽니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 낭 뜨에서 대학 병원 동물 시설 (UTE) 낭트의 축산 관리, 셀룰러 및 tissular 이미징, 낭트 대학 (MicroPICell)의 핵심 시설을 이미징에 대 한 그리고 Cytometry 시설 (Cytocell)의 직원을 감사 합니다. 대 한 그들의 전문 기술 지원. 이 작품은 INSERM, CNRS, 대학교 드 낭트, 인 국가 뒤 암 (잉카 #PLBio2014-155), 국가 리그 죄수 르 암 (AO 국제 2017), 그리고 유럽 컨소시엄 시대 Net Transcan2에 의해 투자 되었다 (Immunoglio). 팀은 Fondation 부 라 검색 Medicale (DEQ20170839118)에 의해 자금이 다. 이 작품은 LabEX IGO의 맥락에서 실현 하 고 IHU Cesti 프로그램에서 지 원하는는 국가 연구 기관 Investissements d'Avenir 통해 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01 ANR-10-IBHU-005, 각각. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로폴와 드 라 루아르 지역에 의해 지원 됩니다. 저자는 원고 수정에 도움을 제공 하는 Chirine Rafia 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
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