Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM), o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos, é geralmente associada com um prognóstico pobre e escassas eficientes terapias têm sido propostas ao longo da última década. Entre os candidatos promissores para a concepção de novas estratégias terapêuticas, imunoterapias celulares têm sido alvo para eliminar altamente invasivo e células tumorais de quimio-radioresistant, provavelmente envolveram em uma recaída rápida e fatal de câncer. Assim, organismos de alogênico GBM-reativa efetores célula imune, como linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos, nas proximidades do tumor que representa uma oportunidade única para entregar eficiente e altamente concentrado agentes terapêuticos diretamente para o site de malignidades do cérebro. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito pré-clínicos para a viabilidade e a eficácia antitumoral destes imunoterapias celulares que dependem de injeções estereotáxica de linfócitos humanos alogênico dentro camas de tumor intrabrain.
Introduction
GBM (quem grau astrocitoma IV), é o câncer de cérebro primário mais frequente e agressivo em adultos. Apesar de tratamentos agressivos que combinam radio-quimioterapia e cirurgia, GBM continua associada com um prognóstico extremamente pobre (sobrevida média de 14,6 meses e um ano-2-mortalidade > 73%)1. Isto evidencia que alguns avanços terapêuticos eficientes foram validados ao longo da última década2. Entre os candidatos para a concepção de estratégias terapêuticas mais eficazes3,4,5, imunoterapias6 são atualmente exploradas para controlar e eliminar altamente invasivo e rádio/quimioterapia-resistente do tumor células, suspeitadas por sua contribuição fundamental para a rápida e fatal tumor recaída7. Vários alvos imunológicos foram identificadas e propostas para imunoterapias, envolvendo natural ou αβ modificado ou linfócitos T de ϒδ como antígenos do tumor GBM específicos ou estresse induzido por moléculas8,9, 10. A possibilidade de administrar efetores de células imunes GBM-reativos selecionados representa uma oportunidade única para entregar quantidades elevadas de linfócitos efetores diretamente no site da malignidade residual. Para oferecer suporte a esta estratégia, nós recentemente demonstraram que modelos baseados em camundongos imunodeficientes carregando ortotópico primários xenografts humanos de GBM fielmente recapitular o desenvolvimento de tumores cerebrais em GBM pacientes9,11. Além disso, estes modelos foram usados para demonstrar a eficiência forte antitumoral de enviaram transferidos linfócitos humanos alogênico de Vϒ9Vδ2T.
Este protocolo descreve as etapas experimentais críticas para alcançar imunoterapias estereotáxica de tumores cerebrais, tais como GBM, com base na transferência adotiva de alogênico linfócitos T. O artigo mostra: (i) a amplificação de linfócitos terapêuticos alogénicos imunes efetoras T, tais como linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T; (ii) a preparação destes linfócitos efetores T para injeção; (iii) o processo de administração estereotáxica dentro do cérebro, perto do tumor. Este artigo também fornece insights sobre o comportamento desses efetores celulares após a injeção estereotáxica.
A abordagem terapêutica aqui apresentada baseia-se a injeção de 20 x 106 efetoras células por dose para cada mouse imunodeficientes rolamento-tumor de cérebro. Uma etapa de expansão inicial em vitro é necessária para produzir grandes quantidades de células do sistema imunológico. Portanto, expansões de célula não-específicas são executadas usando a Fitohemaglutinina (PHA-L) e irradiados células alogénicas alimentador: células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis e célula B-lymphoblastoid Epstein Barr vírus EBV-transformado linhas (BLCLs), derivado de PBMC por infecção em vitro com cultura EBV-contendo sobrenadante da linha celular sagui B95-8, na presença de 1 µ g/mL ciclosporina-A.
Células imunes efetoras GBM-reativa são comparadas e selecionadas a partir de vitro ensaios9. Estas células efetoras são ativadas e amplificado usando protocolos padrão, de acordo com sua natureza (por exemplo, de linfócitos humanos Vγ9Vδ2 T9 ou humano anti-herpes vírus αβ T linfócitos12) com uma pureza mínima de > 80%, como rotineiramente verificada pela análise cytometric. O procedimento de expansão celular detalhado abaixo aplica-se a vários subconjuntos de linfócitos humanos.
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Protocol
As procedimento envolvendo animais disciplinas foi realizada segundo as orientações institucionais (acordo #00186.02; Comitê de ética regional de Pays de la Loire [França]). Humano PBMC foram isolada a partir do sangue coletado de doadores saudáveis informados (Etablissement Français du Sang Nantes, França). Todas as etapas são executadas sob condições estéreis.
1. não-específica expansão de linfócitos citotóxicos Effector T
- Preparar e irradiar as células alimentador em 35 Gy. Para a estimulação de 2 x 105 - células efetoras de 4 x 105 , prepare-se 10 x 106 PBMCs e 1 x 106 BLCLs de três doadores distintos, saudáveis.
- Resuspenda tanto células alimentador e células efetoras em 15 mL de RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor FCS, 2 mM L-glutamina, penicilina (100 UI/mL), estreptomicina (0,1 µ g/mL) e recombinantes IL-2 300 UI/mL.
- Adicionar PHA-L em uma concentração final de 1 µ g/mL, misture cuidadosamente e distribuir 150 µ l de suspensão de célula por bem em placas de 96 poços de fundo U.
- Incube a 37 ° C e com 5% CO2 em um ambiente umidificado.
- Verificar diariamente a placa até grandes células agrupa formulário dos poços de cultura (~ dia 7).
- Transferi as células em um frasco de cultura a 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.
- Determinar o número total de células por contagem (2x por semana) e mantê-las em 1 x 106 células/mL em meio de cultura fresco.
Nota: As células imunes efetoras devem estar prontas para a administração de terapêutica em um estado de repouso (geralmente 3 semanas após o estímulo inicial de amplificação). A pureza e a reatividade destas células efetoras devem ser verificados antes na vivo injeções (por exemplo, com ensaios em vitro ).
2. preparação de células efetoras pré-operatório
- Depois de verificar a contagem de células efetoras, colete as células efetoras em um tubo de 50 mL por centrifugação (300 x g por 5 min).
Nota: Para compensar qualquer perda, prepare um excesso de células (por exemplo, 50 x 106). - Cuidadosamente, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 15 mL de PBS estéril e centrifugar durante 5 min à 300 x g para executar a lavagem.
- Cuidadosa e completamente remover o sobrenadante e em seguida Ressuspender as células em 1 mL de PBS estéril.
- Transferi as células ressuspensa em um microtubo de 1,5 mL por centrifugação a 300 x g durante 5 min.
- Cuidadosa e completamente remova o sobrenadante pipetando lentamente.
- Ressuspender as células em 8 µ l de PBS estéril por rato.
Nota: Este é um passo crítico. - Medir o volume da suspensão celular usando uma micropipeta. Se necessário, adicionar PBS estéril (20 x 106 células em 15 µ l de PBS por dose) e misturar cuidadosamente.
- Verificar, por meio de uma micropipeta, que o volume final por rato é entre 15 e 20 μL (imperativamente < 20 µ l).
- Manter as células no gelo até injeção estereotáxica.
Nota: mais de 3-h momentos não foram testados.
3. estereotáxica injeção
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Instalação de equipamento
- Montar e calibrar um pequeno quadro estereotáxico animal de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção).
Nota: A taxa de infusão lenta é recomendada (ou seja, 2-3 µ l/min). - Instale o material em um armário de segurança microbiana (MSC) para manter a esterilidade dos instrumentos e para proteger os ratos de infecções.
Nota: lugar "blocos isotérmicos" em um banho-maria a 37 ° C. Este sistema limita a hipotermia de ratos durante a cirurgia. Radiante, que são necessárias para o cuidado pós-processual, deve ser usado durante a monitorização contínua da temperatura.
- Montar e calibrar um pequeno quadro estereotáxico animal de acordo com as instruções do fabricante para garantir a precisão das injeções intracranianas (por exemplo, tamanho da seringa, volume desejado e taxa de injeção).
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Preparação de animais pré-operatório
- Anestesia um rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (10 mg/mL) e xilazina (0,1 mg/mL) em 10 µ l/g de peso do corpo do mouse.
- Execute um teste do beliscão do dedo do pé para garantir a completa anestesia e analgesia do animal.
Nota: Qualquer movimento é uma indicação de analgesia não de profundidade e, se isso ocorrer, mais alguns minutos são necessários antes de repetir a operação. - Uma vez que o mouse é devidamente anestesiado, use a tesoura para remover a pele do local cirúrgico (entre as duas orelhas, até o nariz).
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Preparação da pilha pré-operatória
- Cuidadosamente, Ressuspender as células com uma pipeta (várias vezes) antes de cada injecção para impedir que qualquer célula aglutinação.
- Desenhe cuidadosamente o volume de suspensão de células necessárias (15-20 µ l) para o microseringa 22-G para evitar a aspiração de bolhas.
Nota: Este passo de carregamento de celular para o microseringa é importante para minimizar as variações no volume injetado. Recarrega pilhas para cada injeção individual entre procedimentos para impedir que qualquer célula aglutinação e garantir um número par de administração de células efetoras na coorte. - Em seguida, coloque a seringa para a bomba de seringa adaptada.
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Cuidados processuais
- Desinfectar o local cirúrgico com cotonetes embebidos em solução de iodo-povidona 5% pelo menos 3 x.
- Coloque uma pomada oftálmica lubrificante nos olhos do rato, para evitar qualquer secagem de córneas.
- Posição do mouse anestesiado na armação estereotáxica, num bloco isotérmico quente coberto com um filme plástico estéril para manter a temperatura do rato durante a cirurgia e limitar a taxa de mortalidade.
Nota: Do mouse nariz e dentes devem ser adequadamente posicionados acima da barra de dente, para assegurar o fluxo respiratório adequado durante o procedimento. - Uma vez que o mouse está posicionado acima da barra de dente, aperte as barras de orelha firmemente sob as orelhas do rato para imobilizar a cabeça.
Nota: Tenha cuidado para não danificar os tímpanos ou comprometer a respiração. - Fazer uma incisão de 1-2 cm da pele sagital com tesoura estéril, ao longo da parte superior do crânio de anterior posterior para expor o crânio.
- Identifica a interseção das suturas coronais e sagitais (Bregma) para servir como pontos de referência para localização estereotáxica antes da injeção (mostrada na Figura 1).
- Lugar da micro-seringa acima deste ponto.
- Mova a micro-seringa lateral direita 2 mm e 0,5 mm anterior do Bregma.
- Usando um microdrill, faça um pequeno furo no crânio com uma broca estéril coordenadas pré-determinadas. Tenha cuidado para permanecer superficial para evitar qualquer lesão traumática do cérebro.
Nota: No presente protocolo, as células imunes foram injetadas dentro um tumor estabelecido (uma semana após a injeção de células de tumor). A pele deve ser reaberto (scar) e a injeção é executada com as mesmas coordenadas usadas para a implantação de células de tumor (o furo geralmente ainda está presente acima de 2 semanas após a injeção). As coordenadas foram selecionadas para injetar células de tumor e efetoras no parênquima cerebral13,14.
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Injeção de células imunes efetoras
- Cuidadosamente Introduza a micro-seringa o orifício perfurado e, movendo-se lentamente, encaminhar a agulha 3 mm para baixo na dura-máter e então para trás 0.5 mm até uma profundidade final de 2,5 mm antes de injetar as células efetoras.
- Executar a injeção de células efetoras em 2-3 µ l/min e monitorar os ratos ao longo do tempo de injeção.
- Uma vez concluída a injeção, retirar a agulha para apenas 1 mm e manter a micro-seringa no lugar por um minuto adicional antes lentamente retirando completamente o microseringa, para evitar qualquer vazamento do local da infusão.
Nota: Após a remoção do animal do dispositivo estereotáxico, limpe imediatamente o equipamento de injeção para experiências futuras.
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Cuidados pós-operatórios e follow-up de rato
- Retire o animal do quadro estereotáxico e imediatamente aplicar solução de 5% de iodo-povidona no local da incisão e fechar a pele com uma sutura cirúrgica adequada.
- Aplicar o gel de lidocaína 2% diretamente sobre a ferida e administrar 0,15 µ g/g de buprenorfina por injeção subcutânea para analgesia pós-processual.
- Lugar de volta o mouse anestesiado para sua jaula sobre uma almofada de aquecimento definida a 37 ° C para manter uma temperatura de corpo do mouse apropriado e evitar qualquer hipotermia.
Nota: Alojamento separado não é necessário. - Monitorar o mouse até que ele está totalmente recuperado da anestesia e transferi-lo para um quarto de habitação.
Nota: Até à data, este protocolo é bem suportado como poucas complicações imprevistas ocorreram (< 5% dos ratos injetados). - Diariamente, monitorar os ratos e sacrificá-los quando qualquer declínio saúde são observados sinais (por exemplo, postura encurvada, mobilidade reduzida, prostração ou perda de peso significativa corpo [≥ 15%]).
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Representative Results
Este estudo descreve a estratégia de transferência adotiva de células efetoras imune celular dentro do cérebro de camundongos portadores de tumor, baseado em injeções estereotáxica realizadas diretamente dentro da cama do tumor.
Para minimizar qualquer risco de lesão cerebral associada com um volume grande de injeção, a suspensão de células efetoras precisa ser concentrado (20 x 106 células em 15-20 µ l de PBS). Para verificar se essa etapa de concentração celular pode afetar a viabilidade das células efetoras, estas células foram preparadas de acordo com o protocolo descrito e carregadas para o microseringa. As células efetoras foram recolhidas imediatamente, ou 10 min depois de carregá-los para o microseringa. As células foram coradas com iodeto de propidium (PI), um agente intercalante fluorescente de DNA que não é permeant de células vivas e analisadas por citometria de fluxo em momentos diferentes (0, 24 e 72 horas). Os resultados mostram que a preparação e o carregamento para o microseringa não afetar significativamente a viabilidade de células efetoras pelo menos 24 horas (Figura 2A e 2B). Em 72 horas, observou-se um aumento ligeiro, mas não significativas, de célulaspositivas de PI (14% contra 11% para pilhas descarregadas). De forma semelhante, foi analisada a reatividade antitumoral de células efetoras que foram preparados e mantido no gelo por 3 horas. Células efetoras foram cocultured com as células do tumor de cérebro por 4 horas na presença de um mAb anti-CD107a. O upregulation do marcador de ativação CD107a, similar ao valor obtido em condições de controle, indica que a reatividade de células efetoras não é afectada pela preparação e o carregamento para o microseringa (Figura 2).
Para avaliar se as células efetoras sobrevivem e mover-se dentro do parênquima cerebral após sua implantação intra-tumoral, 20 x 106 efetoras células foram injetadas o site tumor de ratos com tumor cerebral (GBM-111). Uma semana depois, os cérebros foram coletados, fixo, seccionado e coradas por coloração de hematoxilina e eosina safran (HES) e anti-humano CD3 mAb (IHC). Coloração de HES identificou a estrutura dos tumores cerebrais (Figura 3, painel esquerdo). A coloração de CD3 identificadas e localizadas de linfócitos T efetores imunes (aqui, células humanas Vϒ9Vδ2 T) (Figura 3, painel direito). Curiosamente, os linfócitos T do effector foram detectados em torno do tumor (Figura 3, painel superior direito), no núcleo do tumor (Figura 3, meio painel direito), mas também no hemisfério contralateral (Figura 3, painel direito inferior). Além disso, a função dos linfócitos T humanos isolados do cérebro do rato 48 horas após a sua injeção (4 x 106 células de T de αβ), que representam 2% das células do cérebro, foi analisada. Os resultados indicam que coletados cérebro-injetado effector alogênico αβ T células expandir e proliferam em cima de uma ativação de células de PHA-alimentador específico realizada na presença de IL-2 (Figura 4).
Juntos, esses resultados mostram que células efetoras T preparadas e administradas sob estes procedimentos sobrevivem durante horas no cérebro e podem patrulhar dentro do tumor e os tecidos cerebrais saudáveis. Esses procedimentos têm sido utilizados para avaliar a eficiência antitumoral das administrações estereotáxica terapêuticas alogénicas humanas descanso Vϒ9Vδ2 de pilhas de T, para controlar o desenvolvimento humano GBM cérebro tumores9,11. Estas evidências de estudos que injeções de linfócitos alogênico effector humana T na cama tumor melhorar significativamente a sobrevivência de ratos com tumores cerebrais. Curiosamente, sobreviver os ratos não carregava pilhas do tumor detectável, indicando, assim, uma rejeição completa do tumor.
Figura 1 : Imagens dos principais marcos anatômicas no crânio do mouse. Isso inclui sagital (linha vermelha) e a sutura coronal (linha azul) e a sua interseção (Bregma) usado para orientar o local da injeção. Barra de escala é indicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Sobrevivência e ativação de preparados linfócitos efetores T. Células efetoras (aqui, descansando de células humanas de Vϒ9Vδ2 T periféricas) foram amplificadas e preparados de acordo com o procedimento descrito. Coloração de linfócitos com iodeto de propidium (PI), foram realizados um DNA intercalante composto fluorescente que não permeant viver as células e ativação funcional. (A), este painel mostra uma parcela representativa de frente (FSC-H) contra lateral (SSC-H) scatter gating de linfócitos efetores (deixou o painel). O histograma mostra a coloração de PI de linfócitos de controle fechado (painel direito). É indicada a percentagem de linfócitospositivos de PI. (B), este painel mostra o percentual de linfócitos mortos (PIpositivo) recolhido imediatamente (linha azul clara) ou após 10 min (linha azul escura) na microsseringa, medido em momentos os indicado. Como controle, foram usadas células preparadas descarregadas (linha de cinzento). (n = 3; média ± DP; ns = não significativo.) CD107a (C) mobilização de superfície foi medida por citometria de fluxo ou células de controlepositivo Vδ2 (despreparados) ou preparadas de linfócitos mantidos no gelo (preparado + 3 h) seguindo um coculture com células de tumor de cérebro humano principal alvo. A percentagem de linfócitos é indicada em cada quadrante cytometric. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Deteção e localização dos linfócitos efetores T dentro do cérebro de ratos de tumor-rolamento. Uma semana depois de glioblastoma cerebral implantação do tumor, as células imunes efetoras (aqui, descansando de células humanas de Vϒ9Vδ2 T periféricas) foram injetados nos cérebros de ratos. Uma semana após o tratamento de imunoterapia, os cérebros foram coletados, fixo e seccionados. Seções do cérebro foram coloridas para análise imuno-histoquímica (hematoxilina eosina e coloração safran [HES]) (painel esquerdo) ou manchado com anticorpo CD3 de anti-humano (painel direito). Os resultados mostrados são representativos de três experimentos independentes. Barra de escala é indicada.
Figura 4 : Ativação de linfócitos efetores T coletados de cérebro de ratos tratados. Descanso de linfócitos T humanos (aqui, 4 x 106 humano αβ T linfócitos) foram injetados nos cérebros de ratos NSG. Após 48 horas, os cérebros foram coletados e dissociados. A percentagem de linfócitos de T infiltrando cérebro humanos foi medida por citometria de fluxo, usando um anticorpo anti-humano de CD3 (painel inferior). As células coletadas foram semeadas (10 células/poço) em placas de 96 poços de fundo U e estimulado (PHA-alimentador células e IL-2) por 20 dias (16 ciclos de duplicação). Nota, no dia 10, 13,3 x 106 de linfócitos T humanos foram obtidos (painel direito).
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Discussion
Uma transferência adotiva de selecionado nativo ou células efetoras imune engenharia representa uma abordagem promissora para tratar eficientemente a tumores, como câncer de cérebro infiltrativa, tendo o cuidado de limitar reatividades contra células não-transformadas15, 16,17,18. No entanto, o sistema nervoso central, que compreende o cérebro, tem um determinado status imune, nomeadamente devido a existência da barreira hemato - encefálica e a falta de um sistema de drenagem linfática clássica19,20. Estas características fisiológicas afetam tráfico de tecido e podem comprometer sistêmicas injeções de células do sistema imunológico. Para superar estes obstáculos, injeções difuso tem sido exploradas no princípio de que células antitumorais bastante localmente são entregues, estreitamente para o local do tumor, quanto microesferas que contêm compostos farmacológicos21, 22. por um lado, a diluição limitada de linfócitos dentro o órgão pode melhorar sua eficácia antitumoral, mas ele também pode amplificar mecânica ou tumor adaptação efeitos deletérios, como a compressão tecidual, que se desenvolve ao longo do cérebro crescimento do tumor. Isto implica que este procedimento exige volumes pequenos de injeções de imunoterapia. Esta questão é ainda mais crítico em modelos experimentais animais no qual cérebro tumores não podem ser extirpados cirurgicamente. Este artigo descreve uma abordagem terapêutica para a preparação e a entrega local de efetores celulares tumor-específicas cérebro, baseado em injection(s) estereotáxica de alogênico linfócitos T humanos.
Este estudo mostra a preparação e a entrega estereotáxica de alogênico linfócitos T Vϒ9Vδ2 humanos em ratos NSG imunodeficientes carregando humanas xenografts GBM. A primeira fase do presente protocolo descreve um procedimento simples para amplificar alogênico linfócitos T de PBMC de doadores saudáveis, usando uma padrão estimulação de PHA-alimentadores-IL2 inespecífica que produz grandes quantidades de linfócitos efetores pura T, permitindo sua utilização terapêutica23,24. A segunda fase deste artigo incide sobre a preparação de suspensões de linfócitos T de repouso no dia da administração estereotáxica. Um foco particular foi colocado nesta etapa importante que requer uma alta densidade celular não deve afetar a viabilidade e a função dos linfócitos effector selecionada T. Finalmente, sobre experiências na vivo , a preparação de linfócitos efetores T e sua injeção dentro do núcleo do tumor está associada a sua divulgação, não só dentro do tumor, mas também nos tecidos cerebrais circundantes, destacando suas habilidade especial para patrulhar e controlar as células do tumor invasivo. Importante, estes métodos de preparação e injeção mantêm a capacidade destes linfócitos T para ser ativado dentro do cérebro em cima de um reconhecimento específico de células de tumor cerebral. No total, estas características atraentes assegurar a capacidade de linfócitos T para especificamente e eficientemente alvo e eliminam as células do tumor cerebral profunda infiltrativa que são uma marca registrada da GBM25. Digno de nota, um cuidado especial tem que ser tomado durante a injeção e a remoção do microseringa para minimizar qualquer lesão cerebral ou vazamentos de células efetoras.
Em conclusão, este artigo descreve um procedimento eficiente para fornecer grandes quantidades de alogênico linfócitos humanos anti-tumoral, tais como repouso linfócitos humanos Vϒ9Vδ2T, nas proximidades de tumores cerebrais. Importante, este procedimento terapêutico não é acompanhado com efeitos adversos sobre os linfócitos T transferidos (por exemplo, viabilidade, reatividade) ou sobre os tecidos do cérebro. Estudos recentes, baseados em modelos de murino ortotópico de GBM humana primária, têm demonstrado que os linfócitos Vϒ9Vδ2T alvo eficientemente células GBM, incluindo células de tumor que infiltraram-se profundamente o cérebro parênquima9,11. Estes elementos abrir oportunidades para o desenvolvimento do romance adotiva T linfócitos transferência procedimentos que pode ser aplicado em primeira instância em camundongos carregando ortotópico os tumores cerebrais e, em seguida, em estudos clínicos em pacientes GBM.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer o pessoal do Hospital Universitário animal instalação (UTE) de Nantes para pecuária e cuidados, o celular e tecidual de imagem facilidade do núcleo da Universidade de Nantes (MicroPICell) para a imagem latente e a facilidade de citometria (Cytocell) de Nantes para sua assistência técnica especializada. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO inter-regional 2017) e o consórcio europeu ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). A equipe é financiada pelo Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Este trabalho foi realizado no contexto do LabEX IGO e os programas IHU-Cesti, suportado pelo nacional investigação Agência Investissements d'Avenir através dos programas ANR-11-LABX-0016-01 e ANR-10-IBHU-005, respectivamente. O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Metropole e a região de Pays de la Loire. Os autores agradecer Chirine Rafia para fornecer ajuda em corrigir o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
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