Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.
Abstract
Glioblastome multiforme (GBM), le cancers du cerveau primaire plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes, est généralement associé à un mauvais pronostic, et rares thérapies efficaces ont été proposés au cours de la dernière décennie. Parmi les candidats prometteurs pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques, des immunothérapies cellulaires ont été ciblés pour éliminer très envahissante et chimio-radiorésistant des cellules tumorales, probables impliqué dans une rechute rapide et fatale de ce cancer. Ainsi, administrations de GBM-réactive allogéniques effecteurs de cellule immunitaire, telles que les lymphocytes T Vϒ9Vδ2 humains, dans le voisinage de la tumeur serait représente une occasion unique d’offrir efficace et hautement concentré des agents thérapeutiques directement dans la site des tumeurs malignes de cerveau. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept préclinique pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale de ces immunothérapies cellulaires qui s’appuient sur des injections stéréotaxiques de lymphocytes humains allogéniques dans lits tumeur intrabrain.
Introduction
GBM (qui grade astrocytome IV), est le cancer de cerveau primitif plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes. En dépit de traitements agressifs qui associent chirurgie et la radio-chimiothérapie, GBM reste associé à un très mauvais pronostic (survie médiane de 14,6 mois et un an-2-mortalité > 73 %)1. Cela prouve que quelques avancées thérapeutiques efficaces ont été validées au cours de la dernière décennie2. Parmi les candidats pour la conception du plus efficace des stratégies thérapeutiques3,4,5, immunothérapies6 sont actuellement explorées afin de suivre et d’éliminer très tumeur invasive et radio/chimio-résistant cellules, soupçonnés pour leur contribution essentielle à rapide et fatale de tumeur rechute7. Diverses cibles immunologiques potentielles ont été immunothérapies identifiés et proposés pour, comportant naturels ou modifié αβ lymphocytes T ϒδ tels que les antigènes de tumeur GBM spécifiques ou le stress induit par les molécules8,9, 10. La possibilité d’administrer des effecteurs de cellules immunitaires GBM-réactive sélectionnées représente une occasion unique d’offrir des quantités élevées de lymphocytes effecteurs directement dans le site de la tumeur maligne résiduelle. Pour soutenir cette stratégie, nous avons récemment démontré que les modèles basés sur des souris immunodéficientes transportant orthotopique primaires xénogreffes humaines de GBM fidèlement récapitulent le développement de tumeurs cérébrales dans GBM patients9,11. En outre, ces modèles ont servi à démontrer l’efficacité antitumorale forte de Moutschen transférés lymphocytes allogéniques des Vϒ9Vδ2T humains.
Ce protocole décrit les étapes expérimentales critiques pour la réalisation des immunothérapies stéréotaxiques des tumeurs cérébrales, telles que GBM, basée sur le transfert adoptif des lymphocytes de T allogéniques. L’article indique : (i) l’amplification des lymphocytes effecteur immunitaire allogénique thérapeutiques T, telles que les lymphocytes humains de Vϒ9Vδ2T ; (ii) la préparation de ces lymphocytes effecteurs T pour injection ; (iii) la procédure d’administration stéréotaxique dans le cerveau, près de la tumeur. Cet article donne également une idée sur le comportement de ces effecteurs cellulaires après injection stéréotaxique.
L’approche thérapeutique présentée ici est basée sur l’injection de 20 x 106 cellules effectrices par dose pour chaque souris immunodéficientes avec tumeur de cerveau. Une étape d’expansion initiale in vitro est nécessaire pour produire de grandes quantités de cellules immunitaires. Par conséquent, les expansions de cellules non spécifiques sont effectuées à l’aide de la phytohémagglutinine (PHA-L) et irradié des cellules nourricières allogéniques : cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) provenant de donneurs sains et cellule B-lymphoblastoïdes transformées par Epstein Barr Virus EBV lignes (BLCLs), dérivés de PBMC par in vitro l’infection par EBV contenant la culture surnageante de la lignée cellulaire Ouistiti B95-8, en présence de 1 µg/mL de cyclosporine-A.
Les cellules immunes effectrices GBM-réactive sont comparées et choisies dans in vitro tests9. Ces cellules effectrices sont activés et amplifié à l’aide de protocoles standard, selon leur nature (par exemple, de lymphocytes humains Vγ9Vδ2 T9 ou virus anti-herpès humain αβ T lymphocytes12) d’une pureté minimale de > 80 %, comme d’habitude vérifiée par l’analyse par cytométrie en flux. La procédure d’extension cellulaire détaillée ci-dessous s’applique à divers sous-ensembles de lymphocytes humains.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les sujets impliquant animaux suivants de procédure s’est déroulée conformément aux directives institutionnelles (accord #00186.02 ; Comité d’éthique régional des Pays de la Loire [France]). PBMC humaines ont été isolées du sang provenant des donneurs sains informés (Etablissement Français du Sang de Nantes, France). Toutes les mesures sont effectuées dans des conditions stériles.
1. Expansion de non spécifique des Lymphocytes effecteurs cytotoxiques T
- Préparer et irradier les cellules nourricières à 35 Gy. Pour la stimulation de 2 x 105 - cellules effectrices de 4 x 10,5 , préparer les PBMC6 10 x 10 et 1 x 106 BLCLs de trois donateurs distincts, en bonne santés.
- Remettre en suspension les cellules nourricières et cellules effectrices dans 15 mL de RPMI additionné de FCS inactivés par la chaleur de 10 %, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (100 UI/mL) et streptomycine (0,1 µg/mL) et 300 UI/mL IL-2 recombinante.
- Ajouter PHA-L à une concentration finale de 1 µg/mL, mélanger soigneusement et distribuer 150 µL de la suspension de cellules par puits dans les plaques à 96 puits à fond U.
- Incuber à 37 ° C et avec 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
- Vérifier quotidiennement la plaque jusqu'à ce que des touffes de grandes cellules forme dans les puits de culture (~ jour 7).
- Transférer les cellules dans un flacon de culture à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche.
- Déterminer le nombre total de cellules de comptage (2 x par semaine) et de les entretenir à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche.
Remarque : Les cellules immunes effectrices devraient être prêts pour l’administration thérapeutique à un état de repos (généralement 3 semaines après l’impulsion initiale de l’amplification). La pureté et la réactivité de ces cellules effectrices doivent être vérifiés avant in vivo les injections (par exemple, avec des analyses in vitro ).
2. préparation de cellules effectrices préopératoire
- Après avoir vérifié le nombre de cellules effectrices, recueillir les cellules effectrices dans un tube de 50 mL par centrifugation (300 x g pendant 5 min).
Remarque : Pour compenser toute perte, préparer un excès de cellules (par exemple, 50 x 10,6). - Avec précaution, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 mL de PBS et de Centrifuger pendant 5 min à 300 x g stérile pour effectuer le lavage.
- Soigneusement et complètement éliminer le surnageant et puis Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.
- Transférer les cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL pour la centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
- Soigneusement et complètement supprimer le surnageant par pipetage lentement.
- Resuspendre le culot dans 8 µL de PBS stérile par souris.
NOTE : Ceci est une étape cruciale. - Mesurer le volume de la suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette. Si nécessaire, ajouter une solution PBS stérile (20 x 106 cellules 15 µL de PBS par dose) et mélanger soigneusement.
- Vérifier, à l’aide d’une micropipette, que le volume final par souris se situe entre 15 et 20 μL (impérativement < 20 µL).
- Conserver les cellules sur la glace jusqu'à injection stéréotaxique.
NOTE : plus de 3 h h n’ont pas été testés.
3. stéréotaxique Injection
-
Installation de l’équipement
- Monter et étalonner un petit cadre stéréotaxique animaux selon les instructions du fabricant pour s’assurer de l’exactitude des injections intracrâniennes (p. ex., taille de la seringue, volume désiré et vitesse d’injection).
Remarque : Une vitesse de perfusion lente est recommandé (p. ex., 2-3 µL/min). - Installer le matériel sous une armoire de sécurité microbienne (MSC) de maintenir la stérilité des instruments et de protéger les souris contre les infections.
NOTE : Place » blocs isothermes » dans un bain d’eau à 37 ° C. Ce système limite l’hypothermie des souris pendant la chirurgie. Chauffage des plaquettes, qui sont nécessaires pour les soins post-procédure, doit être utilisé au cours de la surveillance continue de la température.
- Monter et étalonner un petit cadre stéréotaxique animaux selon les instructions du fabricant pour s’assurer de l’exactitude des injections intracrâniennes (p. ex., taille de la seringue, volume désiré et vitesse d’injection).
-
Préparation préopératoire animale
- Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (10 mg/mL) et de xylazine (0,1 mg/mL) à 10 µL/g de poids de la souris.
- Effectuer un test du pincement orteil pour assurer la complète anesthésie et analgésie de l’animal.
Remarque : N’importe quel mouvement témoigne d’une analgésie profonde non et, dans ce cas, quelques minutes sont nécessaires avant de répéter l’opération. - Une fois que la souris est correctement anesthésiée, utiliser des ciseaux pour enlever la fourrure du site chirurgical (entre les deux oreilles, jusqu'à le nez).
-
Préparation préopératoire cellulaire
- Soigneusement Resuspendre les cellules avec une pipette (plusieurs fois) avant chaque injection, afin d’empêcher toute cellule agglomérante.
- Tracer soigneusement le volume de suspension cellulaire requis (15-20 µL) dans la microseringue 22-G pour éviter l’aspiration des bulles.
Remarque : Cette étape de la cellule de chargement dans la microseringue est importante afin de minimiser les écarts dans les volumes injectés. Recharger les cellules pour chaque injection individuelle entre les procédures pour empêcher n’importe quelle cellule agglomérante tout en assurant un nombre pair d’administration de cellules effectrices de la cohorte. - Ensuite, placez la seringue dans le pousse-seringue adaptée.
-
Soins de la procédure
- Désinfecter le site chirurgical avec tampons trempés dans la solution de povidone-iode 5 % au moins de 3 x.
- Placer une pommade ophtalmique lubrifiante dans les yeux de la souris afin d’éviter tout dessèchement de la cornée.
- Position de la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique, sur un bloc isotherme chaud recouvert d’une pellicule de plastique stérile pour maintenir la température de la souris pendant la chirurgie et de limiter la mortalité.
NOTE : Nez et les dents de la souris doivent être convenablement positionnés au-dessus de la barre de la dent, afin d’assurer un débit respiratoire adéquat au cours de la procédure. - Une fois que la souris est positionnée au-dessus de la barre de la dent, serrer les barres d’oreilles fermement sous les oreilles de la souris pour immobiliser la tête.
Remarque : Veillez à ne pas endommager les tympans ou compromettre la respiration. - Faire une incision de la peau sagittale médiane 1 ou 2 cm avec des ciseaux stériles le long de la partie supérieure du crâne d’antérieur postérieur pour exposer le crâne.
- Identifier l’intersection de la suture sagittale et coronale (Bregma) pour servir de points de repère pour la localisation stéréotaxique avant l’injection (illustrée à la Figure 1).
- Placez la microseringue au-dessus de ce point.
- Déplacer la microseringue latérale droite 2 mm et 0,5 mm partie antérieure de la Bregma.
- En utilisant un microforages, faire un petit trou dans le crâne avec une mèche stérile au point de coordonnées prédéterminé. Veillez à rester superficielle afin d’éviter toute lésion traumatique du cerveau.
Remarque : Dans ce protocole, les cellules immunitaires ont été injectés au sein d’une tumeur établie (une semaine après l’injection de cellules tumorales). La peau devrait être réouvert (cicatrice) et l’injection est effectuée par les mêmes coordonnées utilisées pour l’implantation de cellules de tumeur (le trou est généralement toujours présent jusqu'à 2 semaines après l’injection). Coordonnées ont été sélectionnées pour l’injection des cellules tumorales et effecteurs dans le cerveau parenchyme13,14.
-
Injection de cellules effectrices immunitaire
- Avec précaution, insérer la microseringue dans le trou percé et, se déplaçant lentement, transmettre l’aiguille 3 mm vers le bas dans la dure-mère et vers l’arrière puis 0,5 mm à une profondeur finale de 2,5 mm avant l’injection des cellules effectrices.
- Exécutez l’injection de cellules effectrices à 2-3 µL/min et surveiller les souris tout au long du temps d’injection.
- Une fois l’injection terminée, retirer l’aiguille pour seulement 1 mm et garder la microseringue en place pendant une minute supplémentaire avant de lentement se retirer complètement la microseringue, pour éviter toute fuite provenant du site de perfusion.
Remarque : Après le retrait de l’animal de l’appareil stéréotaxique, nettoyer immédiatement le matériel d’injection pour des expériences à venir.
-
Les soins post-opératoires et le suivi de la souris
- Retirez l’animal le cadre stéréotaxique et immédiatement appliquer la povidone-iode 5 % solution sur le site de l’incision puis fermez la peau avec une suture chirurgicale appropriée.
- Appliquez le gel de lidocaïne 2 % directement sur la plaie et administrer 0,15 µg/g de buprénorphine par une injection sous-cutanée d’analgésie post procédurale.
- Lieu de retour la souris anesthésiée à sa cage au-dessus d’un coussin chauffant mis à 37 ° C pour maintenir une température corporelle de souris approprié et d’éviter une hypothermie.
Remarque : Un logement distinct n’est pas nécessaire. - Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il est complètement remis de l’anesthésie et le transférer dans une chambre de logement.
Remarque : A ce jour, ce protocole est bien pris en charge que peu de complications imprévues ont eu lieu (5 < % des souris injectées). - Tous les jours surveiller les souris et les euthanasier quand on observe des signes de santé en déclin (p. ex., posture voûtée, mobilité réduite, prostration ou perte de poids significative [≥ 15 %]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cette étude décrit la stratégie des transferts adoptifs des cellules effectrices immunitaires cellulaires dans le cerveau des souris porteurs de tumeur, basé sur des injections stéréotaxiques réalisées directement dans le lit de la tumeur.
Pour minimiser le risque de lésion cérébrale associée à un volume d’injection grande, la suspension de cellules effectrices doit être concentré (20 x 106 cellules en 15-20 µL de PBS). Pour vérifier si cette étape de concentration cellulaire peut-être influer sur la viabilité des cellules effectrices, ces cellules ont été préparés selon le protocole décrit et chargés dans la microseringue. Les cellules effectrices ont été prélevés immédiatement, ou 10 min après leur chargement dans la microseringue. Les cellules ont été colorées avec l’iodure de propidium (PI), un agent intercalant fluorescent de l’ADN qui n’est pas perméable à vivre les cellules et analysés par cytométrie à différents intervalles (0, 24 et 72 heures). Les résultats montrent que la préparation et le chargement dans la microseringue ne pas incidence notable sur la viabilité des cellules effectrices pendant au moins 24 heures (Figure 2 a et 2 b). À 72 heures, une augmentation légère, mais non significative, des cellulespositives PI a été observée (14 % contre 11 % pour les piles déchargées). De façon similaire, la réactivité antitumorale des cellules effectrices qui ont été préparés et maintenus sur la glace pendant 3 heures a été analysée. Les cellules effectrices sont co-cultivées avec des cellules de tumeur de cerveau pendant 4 heures en présence d’un anti-CD107a mAb. La stimulation de l’expression du marqueur de l’activation CD107a, similaire à la valeur obtenue dans les conditions de contrôle, indique que la réactivité des cellules effectrices n’est pas affectée par la préparation et le chargement dans la microseringue (Figure 2).
Afin de déterminer si les cellules effectrices survivent et se déplacent dans le parenchyme du cerveau après leur implantation intra-tumorale, l’effecteur de 20 x 106 cellules ont été injectées dans le site de la tumeur de souris porteurs d’une tumeur au cerveau (GBM-1,11). Une semaine plus tard, le cerveau ont été recueilli, fixe, sectionnés et colorés pour coloration hématoxyline et éosine safran (HES) et anti-l’homme CD3 mAb (IHC). La coloration HES d’identifier la structure des tumeurs cérébrales (Figure 3, panneau de gauche). La coloration du CD3 identifiés et localisés les lymphocytes de T immunitaires effecteur (ici, les cellules humaines de Vϒ9Vδ2 T) (Figure 3, panneau de droite). Fait intéressant, les lymphocytes T effecteurs ont été détectées autour de la tumeur (Figure 3, panneau droit supérieur), dans le noyau de la tumeur (Figure 3, panneau central de droite), mais aussi dans l’hémisphère controlatéral (Figure 3, panneau de droite bas). En outre, la fonction des lymphocytes T humains isolés dans le cerveau de souris 48 heures après leur injection (4 x 106 αβ NKT), qui représentent 2 % des cellules du cerveau, a été analysée. Les résultats indiquent que les cellules allogéniques αβ T effectrices de cerveau-injecté recueillies élargir et prolifèrent à une activation de cellules non spécifiques PHA-alimentation en présence de IL-2 (Figure 4).
Ensemble, ces résultats montrent que les cellules effectrices T préparé et administré en vertu de ces procédures de survivent pendant des heures dans le cerveau et peuvent patrouiller dans la tumeur et les tissus cérébraux sains. Ces procédures ont été utilisées pour évaluer l’efficacité antitumorale des thérapeutiques administrations stéréotaxiques d’allogéniques cellules humaines de Vϒ9Vδ2 T au repos pour contrôler le développement de tumeurs de la cerveau GBM humaine9,11. Ces preuves d’études que des injections de lymphocytes effecteurs humain allogénique T dans le lit de la tumeur améliorent de façon significative la survie des souris portant des tumeurs au cerveau. Fait intéressant, survivant des souris n’a pas exploité les cellules tumorales détectable, ce qui indique un rejet complet de tumeur.
Figure 1 : Photo des principaux repères anatomiques sur le crâne de souris. Cela inclut sagittale (ligne rouge) et les sutures coronale (ligne bleue) et leur intersection (Bregma) utilisé pour orienter le site d’injection. La barre d’échelle est indiquée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : La survie et l’activation de préparé les lymphocytes effecteurs T. Les cellules effectrices (ici, de repos des cellules Vϒ9Vδ2 T périphériques humaines) ont été amplifiés et établi selon la procédure décrite. La coloration des lymphocytes avec l’iodure de propidium (PI), un ADN intercalant fluorescent composé qui n’est pas perméable à vivre des cellules et activation fonctionnelle ont été effectuées. (A), ce panneau indique un terrain représentatif (FSC-H) par rapport à côté avant (ASC-H) scatter blocage des lymphocytes effecteurs (panneau de gauche). L’histogramme montre la coloration PI des lymphocytes de contrôle fermée (panneau de droite). Le pourcentage de lymphocytespositifs PI est indiqué. (B), ce panneau indique le pourcentage de lymphocytes morts (PIpositif) prélevé immédiatement (ligne bleu clair) ou après 10 min (ligne bleu foncé) dans la microseringue, mesuréà les intervalles indiqués. Comme contrôle, déchargés cellules préparés ont été utilisées (gris en ligne). (n = 3 ; moyenne ± écart-type ; ns = non significatif.) (C) CD107a mobilisation surface a été mesurée par cytométrie en flux sur soit Vδ2 cellules de contrôlepositif (non préparés) ou préparés maintenus sur la glace (préparé + 3 h) après une coculture avec des cellules de tumeurs primaires du cerveau humain cible les lymphocytes. Le pourcentage de lymphocytes est indiqué dans chaque quadrant de la cytométrie en flux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Détection et localisation des lymphocytes effecteurs T dans le cerveau des souris de tumeur-roulement. Une semaine après le glioblastome cerveau implantation de la tumeur, les cellules immunes effectrices (ici, de repos des cellules Vϒ9Vδ2 T périphériques humaines) ont été injectées dans le cerveau des souris. Une semaine après le traitement immunothérapeutique, le cerveau ont été recueilli, fixe et sectionné. Sections du cerveau étaient colorées pour l’analyse immunohistochimique (hématoxyline, éosine et safran [HES] coloration) (panneau de gauche) ou teinté avec un anticorps CD3 anti-humain (panneau de droite). Les résultats présentés sont représentatifs des trois expériences indépendantes. La barre d’échelle est indiquée.
Figure 4 : Activation des lymphocytes effecteurs T prélevés dans le cerveau des souris traitées. Au repos des lymphocytes T humains (ici, les lymphocytes humains αβ T 4 x 106 ) ont été injectées dans le cerveau des souris NSG. Après 48 heures, le cerveau ont été recueilli et dissocié. Le pourcentage des lymphocytes de T de s’infiltrer le cerveau humains a été mesuré par cytométrie en flux à l’aide d’un anticorps CD3 d’anti-humain (panneau inférieur). Les cellules recueillies ont été ensemencés (10 cellules/puits) en plaques de 96 puits à fond U et stimulée (cellules de PHA-conducteur et IL-2) pendant 20 jours (16 doublement cycles). Remarque, au jour 10, 13,3 x 106 des lymphocytes T humains ont été obtenus (panneau de droite).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un transfert adoptif de sélectionné natif ou cellules effectrices immunitaire machiné représente une approche prometteuse pour traiter efficacement les tumeurs, comme les cancers du cerveau infiltrante, en prenant soin de limiter la réactivité contre les cellules non transformées15, 16,17,18. Toutefois, le système nerveux central, qui comprend le cerveau, a un statut particulier de système immunitaire, notamment en raison de l’existence de la barrière hémato - encéphalique et l’absence d’un système de drainage lymphatique classique19,20. Ces caractéristiques physiologiques affectent le tissu traite et compromettent les injections systémiques des cellules immunitaires. Pour surmonter ces obstacles, intraparenchymateuses injections ont été explorées sur le principe selon lequel les cellules antitumorales sont livrés plutôt localement, près pour le site de la tumeur, en ce qui concerne les microsphères qui contiennent des composés pharmacologiques21, 22. d’une part, la dilution limitée des lymphocytes au sein de l’organe peut améliorer leur efficacité antitumorale, mais il peut aussi amplifier mécanique ou tumeur adaptation effets préjudiciables, tels que la compression tissulaire, qui se développe le long du cerveau croissance de la tumeur. Cela implique que cette procédure nécessite de petits volumes d’injections immunothérapeutiques. Ce problème est encore plus critique dans des modèles animaux expérimentaux dans quel cerveau, tumeurs ne peuvent pas être excisées chirurgicalement. Cet article décrit une approche thérapeutique pour la préparation et la livraison locale de cerveau tumeur spécifique cellulaire effecteurs basé sur stéréotaxique administré d’allogéniques lymphocytes T humains.
Cette étude montre la préparation et la livraison stéréotaxique des lymphocytes allogéniques à Vϒ9Vδ2 T humains dans des souris immunodéficientes NSG transportant des xénogreffes humaines de GBM. La première étape de ce protocole décrit une procédure simple pour amplifier les lymphocytes T allogéniques de PBMC de donneurs sains, à l’aide d’une stimulation non spécifique standard de PHA-mangeoires-IL2 qui produit de grandes quantités de lymphocytes effecteurs pure T, ce qui permet leur utilisation thérapeutique23,24. La deuxième étape de cet article se concentre sur la préparation des suspensions de lymphocytes T de repos le jour de l’administration stéréotaxique. Un accent particulier a été placé sur cette étape importante qui nécessite une forte densité cellulaire qui ne devrait pas affecter la viabilité et la fonction des lymphocytes sélectionnés effecteur T. Enfin, au sujet des expériences in vivo , la préparation des lymphocytes effecteurs T et leur injection dans le noyau de la tumeur est associée à leur diffusion, non seulement au sein de la tumeur mais aussi dans les tissus environnants de cerveau, mettant en évidence leur capacité de patrouiller et de suivre les cellules de tumeur invasive. Ce qui est important, ces méthodes de préparation et d’injection conservent la capacité de ces lymphocytes T être activé dans le cerveau sur une reconnaissance spécifique de cellules de tumeur de cerveau. Au total, ces caractéristiques intéressantes s’assurer de la capacité des lymphocytes T à plus précisément et efficacement ciblent et éliminer les cellules de tumeur de cerveau profond infiltrante qui sont une marque de GBM,25. Il est intéressant de constater qu’un soin particulier doit être pris au cours de l’injection et la suppression de la microseringue pour minimiser toute lésion cérébrale ou fuites de cellules effectrices.
En conclusion, cet article décrit une méthode efficace pour livrer de grandes quantités d’allogéniques anti-tumorale les lymphocytes humains, comme le repos des lymphocytes humains de Vϒ9Vδ2T, à proximité des tumeurs cérébrales. Ce qui est important, cette procédure thérapeutique n'est pas accompagnée d’effets indésirables sur les lymphocytes T transférées (p. ex., viabilité, réactivité) ou sur les tissus cérébraux. Des études récentes, basées sur des modèles murins orthotopique de GBM humaine primaire, ont démontré que Vϒ9Vδ2T lymphocytes ciblent efficacement les cellules GBM, y compris les cellules tumorales qui ont infiltré profondément le cerveau parenchyme9,11. Ces éléments ouvrir des opportunités pour le développement de nouveaux adoptifs T lymphocytes transfert procédures qui pourraient être appliquées en premier lieu chez la souris porteurs de tumeurs cérébrales orthotopique et, ensuite, dans les études cliniques chez les patients GBM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le personnel de l’hôpital universitaire animalerie (UTE) de Nantes pour l’élevage et soins, cellulaire et tissulaire d’imagerie de laboratoire central de l’Université de Nantes (MicroPICell) pour l’imagerie et la facilité de la cytométrie en flux (Cytocell) de Nantes pour leur assistance technique d’experts. Ce travail a été financé par l’INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interrégional 2017) et le consortium européen ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). L’équipe est financé par la Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Ce travail a été réalisé dans le contexte de la LabEX IGO et les programmes de IHU-Cesti, soutenu par le National Research Agency Investissements d’avenir via les programmes ANR-11-LABX-0016-01 et ANR-10-IBHU-005, respectivement. Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la région Pays de la Loire. Les auteurs remercient Chirine Rafia pour aider à corriger le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBMCs | from 3 different healthy donors | ||
| BLCLs | from 3 different donors | ||
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Dutscher | S1810-500 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| IL-2 | Novartis | proleukin | |
| PHA-L | Sigma | L4144 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51600 | |
| Mouse adaptator for stereotaxic frame | Stoelting Co. | 51624 | |
| microsyringe pump injector | WPI | UMP3-4 | |
| NanoFil Syringe | WPI | NF34BV-2 | |
| NSG mice | Charles River | NSGSSFE07S | |
| Ketamine | Merial | Imalgène 1000 | |
| Xylazine | Bayer | Rompur 2% | |
| Scissors | WPI | 201758 | |
| Forceps | WPI | 501215 | |
| OmniDrill 115/230V | WPI | 503598 | |
| Vicryl 4-0 | Ethicon | VCP397H | |
| Xylocaine | Astrazeneca | 3634461 |
References
- Stupp, R., Roila, F. Malignant glioma: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Annals of Oncology. 20 Suppl 4, 126-128 (2009).
- Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet? Neuro-Oncology. 15 (1), 4-27 (2013).
- Chen, S. H., Shine, H. D., Goodman, J. C., Grossman, R. G., Woo, S. L. Gene therapy for brain tumors: regression of experimental gliomas by adenovirus-mediated gene transfer in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (8), 3054-3057 (1994).
- Choi, P. J., Tubbs, R. S., Oskouian, R. J. Emerging Cellular Therapies for Glioblastoma Multiforme. Cureus. 10 (3), e2305 (2018).
- Zhu, L., et al. Targeting and Therapy of Glioblastoma in a Mouse Model Using Exosomes Derived From Natural Killer Cells. Frontiers in Immunology. 9, 824 (2018).
- Chung, D. S., Shin, H. J., Hong, Y. K. A new hope in immunotherapy for malignant gliomas: adoptive T cell transfer therapy. Journal of Immunology Research. 2014, 326545 (2014).
- Vauleon, E., Avril, T., Collet, B., Mosser, J., Quillien, V. Overview of cellular immunotherapy for patients with glioblastoma. Clinical and Developmental Immunology. 2010, (2010).
- Brown, C. E., et al. Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy. The New England of Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).
- Jarry, U., et al. Stereotaxic administrations of allogeneic human Vgamma9Vdelta2 T cells efficiently control the development of human glioblastoma brain tumors. Oncoimmunology. 5 (6), e1168554 (2016).
- Dutoit, V., et al. Exploiting the glioblastoma peptidome to discover novel tumour-associated antigens for immunotherapy. Brain. 135 (Pt 4), 1042-1054 (2012).
- Joalland, N., et al. IL-21 Increases the Reactivity of Allogeneic Human Vgamma9Vdelta2 T Cells Against Primary Glioblastoma Tumors. Journal of Immunotherapy. 41 (5), 224-231 (2018).
- Clemenceau, B., et al. Effector memory alphabeta T lymphocytes can express FcgammaRIIIa and mediate antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Immunology. 180 (8), 5327-5334 (2008).
- Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas. Journal of Visualized Experiments. (57), e3403 (2011).
- Jarry, U., et al. Treg depletion followed by intracerebral CpG-ODN injection induce brain tumor rejection. Journal of Neuroimmunology. 267 (1-2), 35-42 (2014).
- June, C. H., O'Connor, R. S., Kawalekar, O. U., Ghassemi, S., Milone, M. C. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 359 (6382), 1361-1365 (2018).
- Baruch, E. N., Berg, A. L., Besser, M. J., Schachter, J., Markel, G. Adoptive T cell therapy: An overview of obstacles and opportunities. Cancer. 123 (S11), 2154-2162 (2017).
- Bryant, N. L., et al. Characterization and immunotherapeutic potential of gammadelta T-cells in patients with glioblastoma. Neuro-Oncology. 11 (4), 357-367 (2009).
- Pereboeva, L., Harkins, L., Wong, S., Lamb, L. S. The safety of allogeneic innate lymphocyte therapy for glioma patients with prior cranial irradiation. Cancer Immunology, Immunotherapy. 64 (5), 551-562 (2015).
- Bailey, S. L., Carpentier, P. A., McMahon, E. J., Begolka, W. S., Miller, S. D. Innate and adaptive immune responses of the central nervous system. Critical Reviews in Immunology. 26 (2), 149-188 (2006).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Menei, P., et al. Local and sustained delivery of 5-fluorouracil from biodegradable microspheres for the radiosensitization of glioblastoma: a pilot study. Cancer. 86 (2), 325-330 (1999).
- Menei, P., et al. Stereotaxic implantation of 5-fluorouracil-releasing microspheres in malignant glioma. Cancer. 100 (2), 405-410 (2004).
- Salot, S., et al. Large scale expansion of gamma 9 delta 2 T lymphocytes: Innacell gamma delta cell therapy product. Journal of Immunological Methods. 326 (1-2), 63-75 (2007).
- Bennouna, J., et al. Phase-I study of Innacell gammadelta, an autologous cell-therapy product highly enriched in gamma9delta2 T lymphocytes, in combination with IL-2, in patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (11), 1599-1609 (2008).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
