Methodenartikel

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/57914

⸱

30. Juli 2018

 ,  , 
1Department of Science, Borough of Manhattan Community College/CUNY

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie eine Protein nuklearen Translokation unter Hitzestress nachverfolgen mithilfe eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein als Marker und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Das DAPI Färbeprotokoll rückt und bewahrt die GFP und Protein subzelluläre Lokalisation Signale.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll, eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung dienen zum Nachverfolgen von Protein subzelluläre Lokalisation Änderungen; insbesondere betonen eine nukleare Translokation unter einer Hitze Zustand. Proteine reagieren entsprechend zu externen und internen Signale. Ein gemeinsamer Mechanismus soll seine subzelluläre Lokalisation zu ändern. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um Protein-Lokalisierung zu verfolgen, die nicht erfordert einen Antikörper, radioaktive Markierung oder ein confocal Mikroskop. In diesem Artikel wird GFP verwendet, um das Zielprotein EXL-1 in C. Elegans, Mitglied der Chlorid intrazellulären Kanal Proteine (CLICs) Familie, einschließlich Säugetieren CLIC4 tag. Eine integrierte translationale Exl-1::gfp transgene Linie (mit einem Promotor und eine vollständige Gensequenz) entstand durch Umwandlung und γ-Strahlung, und stabil bekundet die gen und GLP. Neuere Forschungen zeigten, dass bei Hitzestress, nicht oxidativen Stress, EXL-1::GFP sammelt sich im Zellkern. Überlappung der GFP-Signal mit der Kerne-Struktur und das DAPI Signale bestätigt der EXL-1 subzelluläre Lokalisation Änderungen unter Stress. Dieses Protokoll stellt zwei unterschiedliche Fixierung Methoden für DAPI-Färbung: Ethanol Fixierung und Aceton Fixierung. Das DAPI-Färbung-Protokoll in diesem Artikel vorgestellten ist schnell und effizient und bewahrt das GFP-Signal und das Protein subzelluläre Lokalisation Änderungen. Diese Methode erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop mit Nomarski, FITC Filter und einem DAPI-Filter. Es eignet sich für kleine Labor, studentische Forschung, High School Student Forschung und Biotechnologie Klassenräume.

Einleitung

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Eine Änderung der subzellulären Lokalisierung Protein ist ein gemeinsamer Mechanismus in Reaktion auf interne oder externe Signale wie Hitze-Stress, Hunger, oxidativen Stress, Apoptose, Protein-Phosphorylierung und andere. Hitze-Stress induziert z. B. Mitglied FOXO DAF-16 nukleare Translokation1,2und dem Pro-apoptotische BCL-2-Protein, das Gebot zu den Mitochondrien beim empfangenden Tod Signalisierung3,4translocates. Verschiedene Techniken zur Verfügung, diese Veränderungen zu erkennen. Eine Kombination von westliche Beflecken und biochemisch isolieren subzelluläre Strukturen (z.B., Mitochondrien oder die Kerne) könnten auch die Ziel-3erreichen. Es erfordert jedoch einen spezifischen Antikörper gegen das Protein des Interesses. Auf diese Weise wird ein etablierter Antikörper der Schlüssel zum Erfolg. Ein alternativer Ansatz besteht darin, beschriften unterschiedliche subzelluläre Strukturen oder Organellen mit verschiedenen Markern wie grüne Fluoreszenz-Protein (GFP), rote Fluoreszenz-Protein (RFP), gelbe Fluoreszenz-Protein (YFP) und mCherry, und inzwischen Beschriften des Proteins Interesse mit anderen Markern. Dann beobachten sie unter einem confocal Mikroskop, die Ziele5,6zu lokalisieren. Radioaktive Isotope sind eine Alternative für die Kennzeichnung Zielproteine und dann ihre subzelluläre Lokalisation7erkennen. Diese Methode erfordert jedoch angemessene Ausbildung und Behandlung radioaktiver Abfälle. Ein alternativer Ansatz muss unter Umständen wie das Fehlen eines spezifischen Antikörpers, das Fehlen eines richtigen Marker oder die Knappheit von Geräten wie einem confocal Mikroskop betrachtet werden. Um ein Protein nuklearen Translokation zu identifizieren, ist es attraktiv, nur die Zielproteine mit einem Filzstift beschriften und, Kerne mit dem chemischen Reagenz 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) da dies nur eine regelmäßige Fluoreszenzmikroskop erfordert zu beflecken.

Immunolabeling C. Elegans mit Antikörpern ist schwierig wegen der geringen Durchlässigkeit der Eierschale oder die kollagenen Nagelhaut rund um das Tier. Unterdessen da C. Elegans Proteine deutlich abweichend von ihrer vertebrate Orthologe sind, bieten einige kommerzielle Firmen C. Elegans mit speziellen Produkten. Es ist schwierig für ein kleines Labor, C. Elegans Antikörper selbst zu generieren. Forscher aus der Gemeinschaft verwenden oft tagged Proteine als Marker, um ein Protein-Lokalisierung oder gen-Expression zu demonstrieren. Dieser Artikel verwendet EXL-1::GFP als Beispiel, um eine Protein nuklearen Translokation unter Hitze-Stress-8zu verfolgen. Eine integrierte translationale Exl-1::gfp in das tierische Genom wird verwendet, um stabil das Gen mit der Gfp Fusion zum Ausdruck bringen. Forschung hat gezeigt, dass Exl-1 in Darm, Körperwand Muskel- und anderen subzellulären Strukturen8ausgedrückt wird. Dieses Protokoll zeigt, wie Würmer, die vierten Larvenstadium (L4) zu synchronisieren, führen Sie eine Hitze Stress Experiment und Verhalten DAPI Färbung, Ethanol Fixierung, Aceton Fixierung und Bildgebung unter dem regulären Fluoreszenzmikroskop.

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Protokoll

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(1) Lösungen

  1. NGM Platten
    1. Fügen Sie in einem 2 L-Erlenmeyer-Kolben 3 g NaCl, 17 g Agar, 2,5 g Pepton und 975 mL dH2O. Cover der Mündung des Kolbens mit Alu-Folie. Autoklaven der Küvette für 50 min. Abkühlen für 20-30 min.
    2. Fügen Sie dann sterilisierte Lösungen: 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterin in Ethanol, 1 mL 1 M MgSO4und 25 mL 1 M KPO4 (pH 6.0) Puffer. Schwenken Sie die Lösungen, die ihnen gut mischen.
    3. Mit einem liquid Dispenser, verzichten Sie die NGM-Lösung für 60 mm Petri Platten. Die Platten 2/3 voll Füllen des Nährbodens. In einem luftdichten Behälter bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.
  2. 1 M KPO4 Puffer (pH 6.0)
    1. Lösen Sie 10,83 g KH2PO4 und 3,56 g K2HPO4 dH2O auf, dann stellen Sie das Gesamtvolumen von 100 mL. Autoklaven für 15 Minuten die Lösung.
  3. M9
    1. Lösen Sie 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4und 5 g NaCl in dH2O, fügen Sie 1 mL 1 M MgSO4, und passen Sie das Gesamtvolumen von 1 L.
  4. 10 µg/mL DAPI
    1. Fügen Sie 1 µL von 10 mg/mL DAPI in 999 µL dH2O.
  5. 95 % Alkohol (V/V)
    1. 95 mL 100 % Alkohol zu messen und zum Einstellen der Lautstärke bis 100 mL destilliertes Wasser hinzufügen.
  6. 30 % Aceton (V/V)
    1. DH2O 30 mL Aceton hinzu und passen Sie das Gesamtvolumen von 100 mL.

2. Hitze-Stress

  1. Generieren einer Extrachromosomale Array-Linie mit einem translationalen Konstrukt Ziel Gene9,10. Alternativ erhalten Sie solche Linien von Caenorhabditis Genetik Center (CGC), die eine öffentliche Ressource für C. Elegans Forschung ist, oder aus einer zuvor veröffentlichten Forschungslabor.
  2. Die Extrachromosomale Linien in das Genom zu integrieren, Würmer bis 3.800 Rad γ-Strahlung9auszusetzen. Wählen Sie die stabil ausgedrückten Linien so, dass jedes Tier ein Marker Protein wie GFP oder Walze drückt.
  3. Um während der Strahlung erzeugte Mutationen zu entfernen, outcross Linien mindestens 2 X. Verwenden Sie diese transgenen Linie Protein Ausdruck Muster Änderungen unter Stress zu erkennen.
  4. Bereiten Sie NGM Wurm Platten vor, wie unter Punkt 1.1 beschrieben. Streifen einen OP50-Klon und Kultur die Bakterien in flüssiger LB Brühe über Nacht. Samen, die der NGM-Platten mit flüssigen OP50 Kultur und die Platten in einem Inkubator 37 ° C inkubieren, über Nacht in eine Bakterien-Rasen als Nahrungsquelle für die Würmer wachsen. Die Platten bei Zimmertemperatur mindestens 30 Minuten vor der Anwendung abkühlen.
  5. Wachsen der transgenen Linie bei 20 ° C ohne Hunger für mindestens 2 Generationen vor der Hitze-Stress-test.
  6. Wählen Sie 8 – 10 jungen trächtige Erwachsene (Gebärmutter voller Eier) zu einem neuen Wurm-Platte, dann lassen sie Eier für ca. 3 – 5 h und entfernen Sie die Erwachsenen von den Platten zu.
  7. Um die Würmer zu synchronisieren, lassen Sie die Eier schlüpfen und wachsen die Larven für ca. 48 h auf dem vierten Larvenstadium (L4). Untersuchen Sie ihre Vulva-Struktur (eine halbmondförmige Struktur) Ermittlung der L4-Stadium (Abb. 1, Pfeil)11.
  8. Platzieren Sie die Wurm-Platten mit den L4-Larven in einem Inkubator 35 ° C für 2 – 5 h, Hitzestress zu erreichen. Legen Sie einen Thermometer in den Inkubator zur Messung der Temperatur.

(3) DAPI-Färbung

  1. Ethanol-Fixierung
    1. Fügen Sie 10 µL des Puffers M9 in der Mitte des einen Objektträger.
    2. Wähle die Hitze schockiert Würmer aus Schritt 2,8 und lege sie in den M9-Puffer auf dem Objektträger.
      1. Alternativ waschen Sie die Platte mit M9, 1.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und den überstand verwerfen. Fügen Sie die Würmer auf den Objektträger.
    3. Verwenden Sie ein weiches Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit abtropfen lassen. Sehen Sie sich diesen Schritt unter dem sezierenden Mikroskop.
    4. Fügen Sie 10 µL von 95 % Alkohol auf die Würmer und an der Luft trocknen lassen. Beobachte den Prozess unter dem sezierenden Mikroskop, und lassen Sie sich nicht die Tiere zu trocken zu bekommen. Sofort nachdem das Äthanol von den Tieren verdunstet ist, fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort.
      Hinweis: Ethanol verdunstet sehr schnell.
    5. Wiederholen Sie Schritt 3.1.4 zweimal so dass die Würmer fixiert sind.
      Hinweis: Es ist normal, dass die Tiere sich dunkler und verzerrt.
    6. Fügen Sie 10 µL des DAPI (10 µg/mL), die Würmer. Sofort mit einem Deckglas abdecken und die Folie mit transparenten Nagellack Gel zu versiegeln.
    7. Die Tiere nach etwa 10 min auf dem Fluoreszenzmikroskop ansehen.
  2. Aceton-Fixierung (Alternativ)
    1. Waschen Sie die Hitze schockiert Platte aus Schritt 2.8 mit M9, 1.000 x g für 1 min bei Raumtemperatur Zentrifugieren Sie und verwerfen Sie überstand. Waschen Sie die Tablette mit 1 mL dH2O, sammeln Sie das Pellet und verwerfen Sie den überstand.
    2. Fügen Sie 400 µL 30 % Aceton für 15 min. Zentrifugieren bei 1.000 X g für 1 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den überstand. Verwenden Sie 500 µL dH2O Waschen der Tiere 2 X. Verwerfen Sie den überstand.
    3. Fügen Sie 200 µL DAPI (10 µg/mL) oder 4 x die Menge an der gesamten Würmer Volumen in der Röhre für 15 min.
    4. Bei 1.000 X g für 1 min zentrifugieren und den überstand verwerfen. Waschen Sie das Pellet 2 X mit 500 µL dH2O. legen die Würmer auf Objektträger, decken Sie sie mit Deckgläsern, die Folie mit transparenten Nagellack Gel zu versiegeln und beobachten die Tiere unter dem Fluoreszenzmikroskop.

(4) mikroskopische Bildgebung

  1. Schalten der UV-Lichtquelle und dem Fluoreszenzmikroskop. Schalten Sie den Computer mit dem Mikroskop verbunden.
  2. Laden Sie die Folie auf dem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine low-Power-Objektiv (10 X) zu finden die Würmer, erhöhen Sie die Vergrößerung-Kraft auf 400 X und fokussieren Sie auf die Probe.
  3. Öffnen Sie die Software mit dem Mikroskop zur Verfügung gestellt. Klicken Sie im Menü auf "Übernahme"; Klicken Sie auf "Kamera" und wählen Sie die Kamera an das Mikroskop angeschlossen; Dadurch kann die ausgewählte Kamera, mit der Software zu kommunizieren.
    Hinweis: Verschiedene Mikroskope variieren in Betrieb.
  4. Klicken Sie unter den gleichen "Erwerb" auf "Mehrdimensionalen Erfassung". Daraufhin wird eine neue "Multidimensional" Navigation Erfassungsfenster. Klicken Sie auf "Multichannel", und alle verfügbaren Kanäle werden angezeigt.
  5. Wählen Sie blau, grün und DIC (differential Interferenz-Kontrast), das Präparat zu beobachten. Verlassen Sie im Fenster "Mehrdimensionalen Erfassung" Navigation die "Blau-DAPI", "Green-GLP" und "Grau-DIC", "Nomarski" Kanäle auf; mit der rechten Maustaste auf anderen Kanälen wie "Red-Rhodamin" und "White-helles Feld", um sie zu schließen.
  6. Messen Sie zunächst die Belichtungszeit für jeden Kanal:
    1. Klicken Sie auf den "Blau-DAPI" Kanal um es auszuwählen und klicken dann auf "Messen", um ein live-Bild unter dem DAPI-Kanal mit der automatischen Belichtungszeit nehmen. Es erscheint ein neues Fenster mit einem live-Bild.
    2. Passen Sie auf der linken Seite des Fensters Livebild die Belichtungszeit manuell an, wenn nötig, um das Bild wie gewünscht.
    3. Klicken Sie auf " ""OK", "in das live-Bild-Fenster. Dadurch wird die Belichtungszeit unter dem DAPI-Kanal.
  7. Wiederholen Sie Schritt 4.6 für die anderen Kanäle, "Green-GLP" und "Grau-DIC", "Nomarski", um die Belichtungszeiten für diese Kanäle einrichten.
  8. Klicken Sie im Navigationsfenster "Mehrdimensionalen Erfassung" auf "Start" um automatisch 3 Bilder unter den 3 verschiedenen Kanälen in Ordnung (siehe oben) mit bestimmten Belichtungszeiten als Set zu sammeln.
  9. Um die Datei zu speichern, gehen Sie zum Hauptmenü zurück, klicken Sie auf "Datei" dann auf "Speichern unter". Dateinamen und den Ordnernamen eingeben. Speichern Sie die Datei als Standard-Dateiformat, die detaillierten Bildinformationen für die Zukunft zu bewahren.
  10. Um die Datei in andere Formate zu exportieren:
    1. Gehen Sie auf "Datei" und klicken Sie auf "Exportieren". Es öffnet sich ein Fenster "Export-Setting".
    2. Stellen Sie Dateinamen und Ordner. Überprüfen Sie die Daten "Erstellen Sie einen Projektordner" besser zu organisieren. Die Software erlaubt auch dem Benutzer, 4 Weitere Optionen festlegen: "Generate fusionierte Bilder", "Verwenden Sie Farbe für Kanal-Bilder", "Einsatz-Channel-Namen" und "Nur Bild verschmolzen".
    3. Wählen Sie einen gewünschten Dateityp aus der Drop-Down-Menü, z. B. "TIF", "BMP", "PSD", oder "JPG" und andere Arten. Klicken Sie auf "Start" zu exportieren.

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Ergebnisse

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Chlorid intrazellulären kanalproteinen (CLIC) sind multifunktionale Proteine, die hoch über Arten12konserviert sind. Ein Großteil der Forschung zeigt, dass CLICs zu, zellulären Stresses, Autophagie, Apoptose, Karzinogenese, Angiogenese und der angeborenen Immunantwort Makrophagen in der Säugetier-System13,14,15,16 regulieren ,...

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Diskussion

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Dieser Artikel präsentiert eine schnelle und effiziente Methode, um Protein subzelluläre Änderungen vom Zytoplasma in den Zellkern zu überprüfen. Die Proteinexpression zeigte eine GFP Fusion, während die Kern-Struktur vom DAPI-Färbung (Abbildung 3) überprüft wurde. Da Immunostaining C. Elegans Proteine ist eine Herausforderung, die meisten C. Elegans Protein subzelluläre Lokalisierung zeichnen sich durch Markieren mit markerproteine wie GFP, Laz und mCherry

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verzollen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. Elegans -Stämme, die in dieser Studie verwendeten stammen vom Caenorhabditis Genetik entfernt, die von den National Institutes of Health - Büro der Forschung Infrastrukturprogramme (P40 OD010440) unterstützt wird. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH: 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-CCRG 1501 Jun Liang und PSC-CUNY 66184-00 44 und 67248-00 45 bis Jun Liang. Wir danken Cathy Savage-Dunn freundlicherweise ihr Labor Raum teilen. Alle Fluoreszenzbilder wurden am Queens College Core Facility gesammelt. Wir danken William für seine Bemerkungen über das Manuskript.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DAPIBiotium40043sowohl Hoechst 33258 als auch Hoechst 33342 funktioniert auch gut
OP50CGCOP50https://cgc.umn.edu/
Caenorhabditis Genetics Center (CGC)https://cgc.umn.edu/
Kim WipeKimberly-Clark CorporationWeichgewebe
Zeiss  AX10ZeissFluoreszenzmikroskop
Axiovision Rel 4.8ZeissMikroskop Software
AxioCam MR Rev3ZeissDigitalkamera
Inkubator 
Mikrozentrifuge
Transparentes Nagellackgel
60 mm Petrischalen
Objektträger
Glasdeckgläser
1-20 & Mikro; L Pipette
20-200 µ L Pipette
200-1000 µ L Pipette
1-200 µ L Pipettenspitzen
200-1000 µ L Pipettenspitzen
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen
Platindraht Wurmpickel

Referenzen

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Schlagwörter

GFP MarkierungDAPI F rbungHitzestressnukle re TranslokationFluoreszenzmikroskopieEthanol FixierungAceton Fixierungtransgene Linie

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