Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Zusammenfassung

Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.

Zusammenfassung

Zirkulierende Serum Mikro-RNAs (MiRNAs) haben gezeigt, dass Versprechen als Biomarker für die Herz-Kreislauf-Krankheiten und akutem Myokardinfarkt (AMI), wird von den Herz-Kreislauf-Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Zirkulierenden MiRNAs sind sehr stabil und quantifiziert werden kann. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs kann mit der Pathologie und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität verknüpft werden. Neue Biomarker für Herz-Kreislauf-Krankheiten zu finden ist von Bedeutung für die medizinische Forschung. Vor kurzem wurde digital Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) erfunden. dPCR, kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht eine spezifische direkte absolute Quantifizierung. dPCR stellt überlegene technische Eigenschaften, einschließlich eine geringe Variabilität, hohe Linearität und hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu den quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Somit ist dPCR eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der MiRNAs, speziell für den Einsatz in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf-direkt. In dieser Publikation beschreiben wir, wie effektiv digitale PCR durchzuführen, um die absolute Kopienzahl in Serumproben zu beurteilen.

Einleitung

Zirkulierenden MiRNAs wurden als vielversprechender Marker für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit¹identifiziert. Die MiRNAs sind klein, nicht-kodierenden einsträngige RNA-Moleküle (ca. 22 Nukleotide lang) engagieren sich in der Posttranskriptionale Verordnung über die Änderung der Boten-RNA Übersetzung und beeinflussende Gene Expression², und in den Blutkreislauf in physiologischen und pathologischen Zuständen freigegeben werden. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs der Pathologie zugeordnet werden kann, und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität¹. Im Herz-Kreislauf-Krankheiten sind MiRNAs attraktive Kandidaten geworden, da neue Biomarker weil sie bemerkenswert stabil im Serum sind und leicht können mit Hilfe der PCR Methode³quantifiziert werden. Der potenzielle Wert der MiRNAs als Biomarker für Myokardinfarkt wurde in kleinen Studien ausgewertet, aber eine Validierung in großen Kohorten fehlt². Zum Beispiel MiR-499 findet man hoch in den Herzmuskel zum Ausdruck gebracht, und es hat gezeigt, dass ein AMI^4,5,6deutlich erhöht werden. Darüber hinaus regelt es programmierte Zelltod (Apoptose) und die Differenzierung von Kardiomyozyten und engagiert sich daher in mehrere Mechanismen, die nach einem AMI-⁷. Abgesehen von einigen kleinen Studien Berichterstattung eine Überlegenheit und inkrementellen Wert von MiRNAs für die Diagnose von AMI Überlegenheit oder Gleichheit zu hoher Empfindlichkeit kardiale Troponins nicht noch in groß angelegten Studien^{2,5 nachweislich ,6,8}. Weitere prospektiven Studien in großen Kohorten sind daher erforderlich, um die mögliche diagnostische Wertigkeit von MiRNAs zu beurteilen. Darüber hinaus Methoden zur Quantifizierung der MiRNA optimiert werden müssen und standardisierte Verwendung vergleichbarer Protokolle⁹. Standardisierte Tests möglicherweise inkonsistente Ergebnisse reduzieren und können helfen MiRNAs, potenzielle Biomarker für die routinemäßige klinische Anwendung werden als Biomarker müssen reproduzierbar Sicherstellung ihrer klinischen Anwendbarkeit quantifiziert werden.

Vor kurzem, hat dPCR als eine Endpunktanalyse eingeführt. Es Partitionen die Probe in etwa 20.000 individuelle Reaktionen¹⁰. Das dPCR System nutzt dann eine mathematische Poisson statistische fluoreszierende Signale (positive und negative Reaktionen), wodurch eine absolute Quantifizierung ohne eine Standardkurve¹⁰. Bei der Kombination von dPCR mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden wird die hochspezifische direkte absolute Quantifizierung von MiRNAs ermöglicht. Digitalen Polymerase-Kettenreaktion hat gezeigt, dass überlegene technische Eigenschaften (einschließlich eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit, ein hohes Maß an Linearität und eine hohe Empfindlichkeit) zur Quantifizierung der MiRNA-Ebenen in weisen die Zirkulation im Vergleich zu quantitative Echtzeit-PCR-^10,11. Diese überlegene technische Qualitäten könnte dazu beitragen, um aktuelle Beschränkungen bei der Verwendung von zirkulierenden MiRNAs als Biomarker zu mildern und führen zur Gründung der MiRNAs als Biomarker in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf- sowie eine diagnostische Methode in allgemeine. In einer früheren Studie haben wir vor kurzem angewendet dPCR für die absolute Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs bei Patienten mit einem AMI und konnten überlegene diagnostische Potenzial im Vergleich zu der Quantifizierung von MiRNAs qPCR¹²zeigen.

In dieser Publikation wollen wir zeigen, dass mit dPCR ist eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der zirkulierenden Herz-Kreislauf-MiRNAs direkt. Die absolute Quantifizierung der MiRNA-Niveaus im Serum, mit digitalen PCR zeigt Potenzial für den Einsatz in großen multizentrischen Herz-Kreislauf-klinische Studien. In dieser Publikation beschreiben wir ausführlich, wie Sie digitale PCR effizient zu erfüllen und um die absolute MiRNA Kopienzahl im Serum zu erkennen.

Protokoll

1. Gewinnung von MiRNA aus Plasma/Serum

Hinweis: Um MiRNAs angemessen zu quantifizieren, die richtige MicroRNA-Isolierung aus dem Plasma/Serum ist ein entscheidender Schritt. Eine wichtige Sache zu beachten, vor allem, weil unterschiedliche Protokolle vorhanden sind, ist zur Einhaltung des gleichen Workflows bei der Verarbeitung der Proben. In diesem Protokoll wird MiRNA aus 50 µL Serum gewonnen. Verwenden Sie nicht mehr als 200 µL als dieser Grenzwert die korrekte Extraktion.

1. Bereiten Sie Serum oder tauen Sie gefrorene Proben auf.
2. 50 µL Serum 250 µL (5 Bände) kommerzielle Lyse-Reagenz hinzufügen. Unterstützen Sie die Lyse durch aufschütteln. Legen Sie den Schlauch mit der lysate auf der Bank bei Raumtemperatur für 5 min.
3. Spike lysate mit 3,5 µL Spike-Steuerelement (1.6 x 10⁷ Kopien/µL) und mischen sie durch aufschütteln.
4. Fügen Sie 50 µL Chloroform (d.h. den gleichen Betrag, der Ausgangspunkt Serumprobe) für die Phasentrennung. Schütteln Sie das Rohr für 15 S. Ort das Rohr auf der Bank bei Raumtemperatur für 2 – 3 min. kräftig.
5. Zentrifugieren Sie für die Phasentrennung das Rohr auf 12.000 x g bei 4 ° C für 15 Minuten.
   Hinweis: Die Proben werden nun in eine obere, wässrige Phase mit der RNA, eine weiße Interphase und eine niedrigere, Rosa organische Phase getrennt.
6. Übertragung der oberen wässrigen Phase (100 µL), enthält die RNA in einen neuen Schlauch. Übertragen Sie weiße Interphase Material nicht, da dies die Anzahl der richtigen RNA verfälscht.
7. Fügen Sie 150 µL (d.h.1,5 Mal die Menge der übertragenen Probe) von 100 % Ethanol. Mischen Sie die Materialien durch pipettieren sie rauf und runter. Zentrifugieren sie nicht und weitermachen Sie schnell mit dem nächsten Schritt.
8. Pipette 250 µL der Probe auf eine kommerzielle Spin-Spalte in einer 2 mL-Kollektion-Röhre. Schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren die Spalte > 8.000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der durchströmten.
9. Die Spin-Spalte 700 µL kommerzielle waschen-Puffer-Nummer 1 hinzufügen. Schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren die Spalte > 8.000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der Durchlauf-waschen-Puffer.
10. Die Spin-Spalte 500 µL kommerzielle waschen-Puffer-Nummer 2 hinzufügen. Schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren die Spalte > 8, 000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der Durchlauf-waschen-Puffer.
11. Pipette 500 µL Ethanol 80 % auf die Spin-Spalte. Schließen Sie den Deckel, Zentrifugieren die Spalte > 8, 000 X g bei Raumtemperatur für 2 min. verwerfen das Sammelrohr mit dem Durchfluss.
12. Übertragen Sie die Spin-Spalte auf eine neue 2 mL Sammelrohr. Zentrifugieren Sie die Spalte auf Hochtouren mit geöffneten Deckel um die Membran zu trocknen. Das sammelröhrchen mit Flow-through zu verwerfen.
13. Übertragen Sie die Spin-Spalte in eine neue 1,5 mL sammelröhrchen. Eluieren Sie RNA indem 30 µL RNase-freies Wasser direkt auf der Mitte der Membran. Schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie die Spalte auf Hochtouren für 1 min.
14. Speichern der RNS bei-70 ° C.
    Hinweis: Die Lagerung von gereinigten RNA in RNase-freies Wasser zwischen-70 ° C bis-20 ° C garantiert kein Abbau der RNA für 1 Jahr. Nach Protokoll des Herstellers ist der Mindestbetrag der RNase-freies Wasser zum Verdünnen der RNS 10 µL. mit weniger als 10 µL können nur unzureichend Hydrat die Membran und reduzieren die Gesamtausbeute RNA.

(2) reverse Transkription

Hinweis: Ergänzende DNA (cDNA) wurde unter Verwendung des folgenden 15 µL reverse Transkription (RT) Protokolls (gesamte Reaktionsvolumen) synthetisiert.

1. Tauen Sie das RT-Kit auf dem Eis. Halten Sie die Enzyme in den Gefrierschrank so lange wie möglich zu verhindern, dass sie beeinträchtigt und drehen sie Sie vor dem Gebrauch. Tauen Sie RT Primer auf Eis auf und drehen sie Sie vor dem Gebrauch.
2. Bereiten Sie den master-Mix, wie in Tabelle 1beschrieben.
3. Kombinieren Sie 10 µL des master-Mix und 5 µL der extrahierten RNA pro Bohrloch in einer 96-Well-Platte.
4. Zentrifugieren Sie die well-Platte bei 2.000 x g bei 4 ° C für 2 min.
5. Verwenden Sie das thermischen Zyklus-Protokoll für die reverse Transkription in Tabelle 2 beschrieben.
   Hinweis: Wie unten beschrieben, cDNA kann direkt verarbeitet werden in der digitalen PCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien); Alternativ kann es bei-20 ° c gelagert werden

(3) Tröpfchen Generation und digitale PCR

Hinweis: Digitale PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des folgenden 40 µL-Protokolls.

1. Tauen Sie den kommerziellen dPCR Mix, die vorbereiteten cDNA und die PCR-Primer auf Eis. Zentrifugieren sie kurz vor der Verwendung.
2. Die master-Mix vorzubereiten, wie in beschrieben Tabelle 3.
3. 1,33 μl/Well des Messguts RT hinzufügen und kurz Zentrifugieren.
4. Pipette 20 μl der Probe in jede Vertiefung der Kassette 8-Brunnen (mittlere Reihe).
   Hinweis: Wenn die 8-Brunnen-Kassette nicht vollständig gefüllt ist, füllen Sie die restlichen Brunnen mit nicht-Template-Steuerelemente (NTCs), die cDNA (d. h., das RT-Produkt mit Wasser anstelle von extrahierten RNA hergestellt) weglassen oder dPCR kommerziellen Puffer. Der NTC dient als eine Kontaminationskontrolle. Wasser darf nicht in den verbleibenden Brunnen verwendet werden, weil die die Qualität der Tropfenbildung beeinträchtigen wird.
5. Pipette 70 μL des tröpfchens Generation Öl für die Sonden in den Ölquellen (untere Zeile) der 8-Brunnen-Kassette.
6. Legen Sie eine Dichtung auf die 8-Brunnen-Kassette und legen Sie die Kassette in die tropfengenerators. Schließen Sie die tropfengenerators. Warten Sie, bis die 3 leuchtet durchgehend grün sind.
   Hinweis: Tröpfchen sind nun generiert.
7. Vorsichtig und langsam transfer 40 μL der Tröpfchen gebildet Probe (obere Zeile) in separaten Vertiefungen einer 96-Well-Platte pipettieren.
8. Nach Abschluss der Tropfenbildung an den Proben, versiegeln die PCR-Platte mit einer durchstechbare dPCR Folie bei 180 ° C für 4 s.
9. Legen Sie die Folie versiegelt PCR-Platte in der Cycler und Zyklus, wie beschrieben in Tabelle 4, mit einer Rampe-Rate von 2,5 ° C/s.

(4) Tropfen lesen und analysieren

1. Übertragen Sie die Platte aus der Thermocycler auf der Basis der Kennzeichenhalter. Ziehen Sie die PCR-Platte, indem man oben auf den Kennzeichenhalter auf die PCR-Platte.
2. Starten Sie die kommerzielle dPCR Software.
3. Geben Sie die probennamen, den Namen des Experiments und das Ziel in der Einrichtung. Wählen Sie die absolute Quantifizierung.
4. Starten Sie das Droplet lesen durch Klicken auf Ausführen. Wählen Sie FAM/HEX oder FAM/VIC als Erkennung Chemie, bei der Arbeit mit Hydrolyse-Sonden.
   Hinweis: Die kommerzielle dPCR Software wird dann automatisch-die Daten analysieren.
5. Überprüfen Sie die Tröpfchen-Nummern in der Ergebnistabelle um eine richtige Tröpfchen-Generation zu gewährleisten.
6. Wählen Sie alle Brunnen mit der gleichen quantifizierte MiRNA und klicken Sie auf analysieren. Verwenden Sie den 2D Blot positivere Tröpfchen markieren und manuell korrigieren Sie die Auto-analysiert Daten (Abbildung 1).

5. korrekte Berechnungen auf die Probe

1. Normalisieren Sie die Probe die Probe mit der Normalisierungsfaktor (NF) multipliziert.
   NF = Median_{alle Proben}[C. Elegans MiR-39 Messungen] / [C. Elegans MiR-39]_{gegebene Probe}
2. Berechnen Sie die endgültige MiRNA-Serum-Konzentration, bereinigt um Verdünnungsfaktoren (DF).
   [MiRNA] _Final = [MiRNA]_Rohwert x DF_RT x DF_dPCR x DF_Ex
   Wo:
   [MiRNA] _Rohwert = die MiRNA quantifiziert durch kommerzielle dPCR Software;
   DF_RT = Verdünnungsfaktor der Vorlage in reverse Transkription;
   DF_dPCR = Verdünnungsfaktor der Vorlage im dPCR;
   DF-_Ex = Verdünnungsfaktor bei der Extraktion.

(6) synthetisches Oligonukleotid Verdünnungsreihe

1. Lyophilisierter synthetisches Oligonukleotid auf Eis Auftauen. Zentrifugieren Sie es kurz.
2. Verdünnen Sie die lyophilisierten synthetisches Oligonukleotid in Nuklease-freies Wasser, eine Endkonzentration von 10 Pmol / µL. kurz Zentrifugieren.
3. Verdünnen Sie es in Nuklease-freies Wasser, wie in Tabelle 5beschrieben. Zentrifugieren Sie die Verdünnung kurz zwischen jedem Verdünnungsschritt bei 8.000 x g für 10 s.
4. Fahren Sie mit der reversen Transkription wie in Schritt 2 beschrieben und analysieren Sie die Proben mit digitalen PCR zu, wie in Schritt 3 und Schritt 4 beschrieben.

Ergebnisse

Digitale PCR kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht Forschern direkt die absoluten Beträge der spezifischen MiRNAs in Kopien/µL zu quantifizieren. Wie das Beispiel in dPCR in etwa 20.000 einzelnen PCR-Reaktionen, partitioniert ist dPCR erfordert keine technischen repliziert¹⁰. Das dPCR System nutzt eine mathematische Poisson statistische Analyse der fluoreszierenden Signale (die sich zwischen positiven und negativen Reaktionen) eine absolute Qu...

Diskussion

Digitale PCR ist ein relativ neuer Endpunkt-Methode von PCR, die die direkte absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren innerhalb einer Probe ermöglicht. Die Methode besitzt bestimmte Vorteile, wie eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität^11,12. Darüber hinaus durch die Partitionierung der Probe in etwa 20.000 einzelne Reaktionen und Endpunkt Analysen dPCR ist robuster, störender Substanzen in der PCR ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RNA-Extraktion
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Probe & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Kit für die microRNA-Extraktion. Das Kit enthält den kommerziellen Puffer RWT (im Manuskript als Nummer eins bezeichnet)  und RPE (im Manuskript als Nummer zwei bezeichnet).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol	Qiagen-Probe & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in für die Normalisierung, Sequenz: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'
Reverse Transcription
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reaktionen)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Kit für die reverse Transkription von microRNA
TaqMan MicroRNA Assays M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays für die reverse Transkription
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay-Nummer 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay-Nummer 000200
PCR-Platte, 96-Well, segmentierte, halbröckige	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96-Well-Platte für die reverse Transkription
Microseal ' B’ Versiegelung versiegelt	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Folie zur Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Lagerung
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler für die reverse Transkription
Droplet Digital PCR
100 nmol RNA Oligo has-miR-499-5p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequenz: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUUU-3'ddPCR
Supermix für Sonden (kein dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix für die Tröpfchengenerierung
TaqMan MicroRNA Assays	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assays für die digitale PCR (Fluoreszenzhydrolysesonde)
>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 001352, kommerzielle Primer
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Assay Nummer 000200, kommerzielle Primer
DG8 Kartuschen und Dichtungen	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Kartusche nimmt bis zu 8 Proben für die Tröpfchenerzeugung
auf DG8 Kartusche Halter	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Hält Kartuschen in der Tröpfchenerzeugung
Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Öl für die Tröpfchenerzeugung
ddPCR 96-Well-Platten	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96-Well-Platte für ddPCR
PCR-Platte mit Heißsiegel, Folie, durchstechbar	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Durchstechbare Folie, kompatibel mit Droplet Reader
ddPCR Droplet Reader Oil	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Öl, das bei der Tröpfchenlesung
verwendet wird QX100 oder QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Droplet Generator, erzeugt die Tröpfchen aus der Proben-/Ölemulsion
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Versiegelt die Platte vor PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler für ddPCR
QX100 oder QX200 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Liest PCR-positive und PCR-negative Tröpfchen mit einem optischen Detektor
ddPCR-Pufferkontrolle für Sonden	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Blindkontrolle  und zum Auffüllen der restlichen Vertiefungen von 8-Well
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Programm zur Tröpfchenlesung
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Programm zur statistischen Analyse