Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Großen Pseudarthrose Knochenbrüche sind eine große Herausforderung in der orthopädischen Chirurgie. Obwohl Auto und allogene Knochentransplantate ausgezeichnet zur Heilung solcher Läsionen sind, gibt es mögliche Komplikationen mit deren Einsatz. So entwickeln die Materialwissenschaftler synthetische, biokompatible Biomaterialien um diese Probleme zu überwinden. In dieser Studie stellen wir eine multidisziplinäre Plattform für die Bewertung der Biomaterialien für Knochen-Reparatur. Wir kombinieren Fachwissen aus Knochenbiologie und Immunologie, einschließlich in-vitro- Osteoklasten (OC) und Osteoblasten (OB) Assays und in Vivo Mausmodelle der Knochen-Reparatur, Immunogenität und Allergenität Plattform zu entwickeln. Wir zeigen, wie die Experimente durchführen, Zusammenfassung der Ergebnisse und Bericht über Biomaterial Biokompatibilität. Insbesondere haben wir OB Lebensfähigkeit, Differenzierung, und Mineralisierung und OC Lebensfähigkeit und Differenzierung im Rahmen der β-Tricalcium Phosphat (β-TCP) Festplatten getestet. Wir testeten ebenfalls einen β-TCP/Kollagen (β-TCP/C)-Schaum ist ein handelsübliches Material klinisch für Knochen-Reparatur in eine kritische Größe calvarial Knochen-defekt-Maus-Modell verwendet, um festzustellen, die Auswirkungen auf die frühe Phase der Knochenheilung. In parallelen Experimenten haben wir immun und allergische Reaktionen bei Mäusen ausgewertet. Unser Ansatz erstellt eine biologische Verträglichkeit Profil von Knochen Biomaterial mit einer Reihe von Parametern für die Vorhersage der Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochenheilung und Reparatur bei Patienten erforderlich.
Einleitung
Knochen-Reparatur ist ein komplexer Prozess, der mit Hämatombildung, Entzündung beginnt, Kallus, Bildung und dann Umbau1,2. Knochenregeneration Potenzial ist jedoch beschränkt auf die Größe der Knochenbruch1,3. Zum Beispiel große Knochenbrüche verursacht durch ein Trauma, Krebs oder Osteoporose können nicht heilen und Pseudarthrose Knochenbrüche bezeichnet werden. Diese Knochenveränderungen erfordern oft Behandlung gesunde physiologische Knochen Reparatur und Regeneration zu fördern. Derzeit Autotransplantation und Allograft Knochen-Transplantation ist....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Die Verfahren wurden mit BALB/c Mäusen nach allen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft und Forschung getan und wurden genehmigt vom Ausschuss für die Ethik des Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Forschung.
1. primäre Maustaste OB Kultur
- OB Isolierung von Neugeborenen Maus Calvaria mit enzymatischen Verdauung
- Einschläfern Sie 1 – 2 Tage alten neugeborenen Welpen (insgesamt 60) durch Enthauptung und legen Sie die Köpfe in einer Petrischale mit sterilem 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
- Halten Sie den K....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Um β-TCP für seine Wirksamkeit als Biomaterial für Knochen-Reparatur zu beurteilen, haben wir in Vitro und in Vivo screening-Verfahren verwendet. Erstens haben wir die OB-Antworten auf die β-TCP-Festplatten im Vergleich zu Grundlinie mittlere allein Kontrollen gemessen. Abbildung 2 zeigt OB Rentabilität als Reaktion auf β-TCP-Festplatten auf 7 bis 14 Tage der Kultur. Zellviabilität gemessen von metabolisch aktiven Zellen in der Kultur-Brunne.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Hier zeigen wir einen multidisziplinären Ansatz für die präklinische Bewertung der Biokompatibilität für repräsentative Biomaterialien für die Knochenregeneration und Reparatur entwickelt. Wir testeten die Antworten der OBs, OCs, und die in Vivo heilende Reaktion in einer kritischen Knochendefekt Modell bei Mäusen als auch in Vitro und in Vivo Immunantworten. Wir wollten zeigen, wie die Assays arbeiten und fassen die Daten und Schlussfolgerungen aus der Untersuchung von Biomaterialien. Wir zeig.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Dieses Forschungsprojekt wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 263363.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Biomaterials | |||
| β-Tricalciumphosphat-Scheiben (β-TCP, 14 mm) | Die Scheiben wurden in einem Muffelofen bei einer Temperatur von 1150 μC gesintert. Eine detaillierte Beschreibung der Produktion findet sich in Zimmer et al. (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Die Proben wurden vor der Verwendung in Zellkulturen UV-bestrahlt (15 min für jede Seite). | ||
| Orthovita Vitoss Schaum (β-TCP/C Schaum) | Orthovita | 2102-1405 | |
| Maus Osteoblastenkultur | |||
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| ALP Assay Puffer (2x) pH 10,4 | 200 mM Glycin, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Zinkchlorid in Reinstwasser auflösen und auf pH 10 einstellen. | ||
| Knochenwachstumsmedium (BGM) | α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin | ||
| Zelllysepuffer: CyQuant Zelllysepuffer 20x Konzentrat | Thermo Scientific | C7027 | Verdünnen Sie den konzentrierten Zelllysepuffer 20-fach in Reinstwasser. |
| Reagenz für die Zellviabilität: Presto Blue Reagenz für die Lebensfähigkeit von Zellen | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | A13261 | |
| Kollagenase Typ IV aus Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| DC Protein Assay Kit II | Bio Rad | 5000112 | DC Protein Assay Kit enthält Reagenz A, Reagenz B, Reagenz S und BSA für den Referenzstandard. Für Reagenz A' fügen Sie 20 µ L Reagenz S bis 1000 &Mikro; L Reagenz A. |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Sterilfilter DMSO vor dem Gebrauch. |
| Dispase II (neutrale Protease, Grad II) | Roche | 4942078001 | |
| EnzCheck Phosphatase Assay Kit für alkalische Phosphatase-Aktivität | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | E12020 | EnzCheck Phosphatase Assay Kit enthält 6,8-Difluor-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP), N,N-Dimethylformamid und 6,8-Difluor-7-hydroxy-4-methylcumarin (DiFMU). |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalinlösung neutral gepuffert 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Glycin | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Hexadecylpyrdinium (Cetylpyridinium)-chlorid-Monohydrat | Sigma-Aldrich | C9002 | |
| L-Ascorbinsäure 2-phosphat Sesquimagnesiumsalzhydrat | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Magnesiumchlorid-Hexahydrat | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MEM alpha medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| Osteogenes Mineralisationsmedium (MM) | α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin + 50 & Mikro; g/mL Ascorbinsäure + 5 mM β-Glycerophosphat | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sigmafast BCIP/NBT | Sigma-Aldrich | B5655 | |
| Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot (10x) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15400054 | Verdünnen Sie die konzentrierte Stammlösung 10-fach in 1x PBS. |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfrei | VWR | L0970-500 | |
| Waschpuffer | 0,05 % Tween20 bis 1x PBS. | ||
| Zinkchlorid | Sigma-Aldrich | 1.08816 | |
| β-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat | Sigma-Aldrich | G5422 | |
| 24-Well-Suspensionskulturplatte | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-Well-Schwarzplatte | Greiner bio-one | 655076 | |
| 96-Well-Klarplatte | Greiner bio-one | 655001 | |
| Zentrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Inkubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Cryovial 2 mL | Greiner bio-one | 122263 | |
| Einweg-Filtereinheit FP30/0,2 CA-S | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 10462200 | Für die Sterilfiltration von Enzymlösungen. |
| Flachbettscanner: Epson Perfection 1200 Photo | Epson | ||
| Infinite M200 Pro Mikroplatten-Reader | Tecan | ||
| Mikrozentrifugenröhrchen: Eppendorf Röhrchen Safe-Lock 0,5 mL | VWR | 20901-505 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen: Eppendorf Tube Safe-Lock 1,5 mL | VWR | 21008-959 | |
| Shaker Swip (orbital und horizontal) | Edmund Bühler | ||
| Schüttel-Inkubator GFL3032 | GFL | 3032 | |
| Einmalpipette: Serumpipette | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile Instrumente (Schere, Pinzette, gebogene Pinzette) | |||
| Gewebekulturplatte (10 cm) | Greiner bio-one | 664960 | |
| Maus-Osteoblasten-Osteoklasten-Co-Kultur | |||
| 1α,25- Dihydroxyvitamin D3 | Sigma-Aldrich | 17936 | 1000x konzentrierter Stamm (10 & Mikro; M in Ethanol 100%) |
| Aceton | VWR Chemicals | 22065.327 | |
| Knochenwachstumsmedium (BGM) | α-MEM + 10% hitzeinaktivierte FBS + 1% Penicillin-Streptomycin | ||
| Destilliertes Wasser | Carl Roth | 3478.4 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | VWR Chemicals | 20821.365 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Schnelles rotviolettes LB-Salz | Sigma-Aldrich | F3381 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Formalinlösung neutral gepuffert 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| MEM alpha Medium (α-MEM) | Gibco Life Technologies | 11900-073 | |
| N,N-Dimethylformamid | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Naphthol AS-MX | phosphat Sigma-Aldrich | N4875 | |
| Osteoklasten-Differenzierungsmedium (DM) | α-MEM + 10% hitzeinaktiviertes FBS + 1% Penicillin-Streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-Vitamin D3 + 1 µ M Prostaglandin E2 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Cayman Chemical Company | 9003016 | 1000x konzentrierter Stamm (1 mM in Ethanol 100%) |
| Natriumacetat-Trihydrat | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Natriumtartrat zweibasisches Dihydrat | Sigma-Aldrich | S8640 | |
| Sterile Instrumente (Schere, Pinzette, Skalpell) | |||
| TRAP Puffer pH 5,0 | 40 mM Natriumacetat, 10 mM Natriumtartrat in Reinstwasser auflösen und auf pH 5 einstellen. | ||
| Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfrei | VWR | L0970-500 | |
| 24-Well-Suspensionskulturplatte | Greiner bio-one | 662102 | |
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Greiner bio-one | 662160 | |
| 50 mL konisches Röhrchen | Greiner bio-one | 227261 | |
| Zentrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| CO2-Inkubator: HeraCell 240 | Thermo Scientific | ||
| Diamond Wafering-Klinge (10,2 cm x 0,3 cm) | Bühler | ||
| Isomet Niedriggeschwindigkeitssäge | Bühler | ||
| Petrischale (6 cm) | Greiner bio-one | 628,161 | |
| Glasflasche mit Schraubverschluss 20 mL | Carl Roth | EXY4.1 | |
| Sterile Einwegspritze 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Einwegpipette: Serumpipette | Greiner bio-one | 612301 | |
| Sterile Nadel: Injektionsnadel RW 27 G x 3/4''Henry | Schein Animal Health | 9003340 | |
| Maus Schädelbad Defektmodell | |||
| Analgesie: Buprenorphin (Bupaq) | Richter Pharma AG | ||
| Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Kaltsterilisationsmittel: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Augensalbe: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Normal Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung) | Fresenius Kabi | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% gepuffertes Formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Gewebekleber: Histoacryl 5 x 0,5 mL | B. Braun Surgical | 1050060 | |
| Persönliche Schutzausrüstung: OP-Handschuhe, Mütze und Maske, Kittel | Henry Schein Animal Health 1045073 | , 1026614, 9009062, 370406 | |
| Sterile Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter) | |||
| Sterile Nadeln: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' und 30 G x 1/2'' | Henry Schein Animal Health 9003340 | , 9003630 | |
| sterile Einwegspritze 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Heizplatte: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Sterile Mulltupfer | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Steriles Einwegskalpell (Figur 20) | Henry Schein Animal Health | 9008957 | |
| Chirurgischer/zahnmedizinischer Bohrer: Implantmed SI-923 | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 16929000 | |
| Handstück Typ S-II | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 30056000 | |
| Trephine, Durchmesser 4 mm | Hager& Meisinger GmbH | 229040 | |
| Bewässerungsschlauch-Set 2,2 m | W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH | 4363600 | |
| Periostlift 2 mm / 3 mm | Henry Schein Animal Health | 472683 | |
| Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Polyester grün, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm | Henry Schein Animal Health | 300715 | |
| In vitro Immunantworten | |||
| Anästhesie zur Euthanasie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Zellproliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisch) Assay Kit | Sigma-Aldrich | 11647229001 | Das Kit enthält BrdU-Markierungslösung, Fixierungslösung (FixDenat), Anti-BrdU-Antikörperlösung, Waschpuffer und Substratlösung. |
| Concanavalin A (ConA) | MP Biomedicals | 150710 | |
| Nährmedium Splenozyten | RPMI-Medium + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung + 0,1 % Gentamicin + 0,2 % ß-Mercaptoethanol + 1 % nicht-essentielle | ||
| Aminosäuren Ethanol (70 % vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp; | ||
| Gentamicin | Gibco, Thermo Fisher Scientsp; | ||
| Maus IL-1β ELISA Auf die Plätze, fertig, los! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Maus IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Maus IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Maus INF-γ ELISA MAX Standard | BioLegend | 430801 | |
| Lösung für nicht-essentielle Aminosäuren | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scient | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): BD Pharm Lyse | BD Bioscience | 555899 | |
| RPMI 1640 Medium, HEPES | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 52400025 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| konisches 50-ml-Röhrchen | Greiner bio-one | 227261 | |
| 96-Well-Gewebekulturplatte | Greiner bio-one | 655180 | |
| Zentrifuge: VWR Mega Star 600R | VWR | ||
| Zellsieb 40 & Mikro; m | BD Bioscience | 352340 | |
| Infinite M200 Pro Mikroplatten-Reader | Tecan | ||
| Sterile Einwegspritze 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile chirurgische Instrumente (Pinzetten, Objektträger< | |||
| stark>Intraperitoneales Modell mit hohem Durchsatz | |||
| Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Kaltsterilisationsmittel: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Augensalbe: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Maus IL-1β ELISA Auf die Plätze, fertig, los! | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 88-7013-88 | |
| Maus IL-2 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431001 | |
| Maus IL-4 ELISA MAX Standard | BioLegend | 431101 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scient | ||
| Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Färbekit | Thermo Scientific | 9990700 | Für die differentielle Zellzahl. |
| Heizplatte: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Hämozytometer: Neubauer-Kammer | Carl Roth | PC72.1 | |
| Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Resorbierbares Nahtmaterial: Polysorb | Covidien | SL-5628 | |
| Shandon-Zentrifuge für Cytopsin | Thermo Scientific | ||
| Sterile Einmalspritze 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile Mulltupfer | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile Nadeln: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' und 25 G | Henry Schein Animal Health | 9003340, 420939 | |
| Sterile chirurgische Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter) | |||
| Trypanblaue Lösung 0,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Subchronisches subkutanes Modell | |||
| Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun) | Richter Pharma AG/Bayer HealthCare | ||
| Kältesterilisator: SafeSept Max | Henry Schein Animal Health | 9882765 | |
| Ethanol (70% vol/vol) | VWR Chemicals | 93003.1006 | |
| Augensalbe: VitA POS 5 g | Ursapharm | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | ||
| Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mL | B. Braun | 3864154 | |
| Roti-Histofix 4,5% gepuffertes Formalin | Carl Roth | 2213.6 | |
| Heizplatte: Physitemp | Rothacher Medical | TCAT-2LV | |
| Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Ethibond Excel 4-0 | Ethicon | 6683H | |
| Persönliche Schutzausrüstung: chirurgisch Handschuhe, Mütze und Maske, Kittel | Henry Schein Animal Health | 1045073, 1026614, 9009062, 370406 | |
| Sterile Einwegspritze 1 mL | Henry Schein Animal Health | 9003016 | |
| Sterile Mulltupfer | Henry Schein Animal Health | 220192 | |
| Sterile Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter) | |||
| Sterile Nadel: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' | Henry Schein Tiergesundheit | 9003340, 420939 |
Referenzen
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
- Cooper, G. M., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
