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Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

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DOI:

10.3791/58077

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16. November 2018

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1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.

Zusammenfassung

Großen Pseudarthrose Knochenbrüche sind eine große Herausforderung in der orthopädischen Chirurgie. Obwohl Auto und allogene Knochentransplantate ausgezeichnet zur Heilung solcher Läsionen sind, gibt es mögliche Komplikationen mit deren Einsatz. So entwickeln die Materialwissenschaftler synthetische, biokompatible Biomaterialien um diese Probleme zu überwinden. In dieser Studie stellen wir eine multidisziplinäre Plattform für die Bewertung der Biomaterialien für Knochen-Reparatur. Wir kombinieren Fachwissen aus Knochenbiologie und Immunologie, einschließlich in-vitro- Osteoklasten (OC) und Osteoblasten (OB) Assays und in Vivo Mausmodelle der Knochen-Reparatur, Immunogenität und Allergenität Plattform zu entwickeln. Wir zeigen, wie die Experimente durchführen, Zusammenfassung der Ergebnisse und Bericht über Biomaterial Biokompatibilität. Insbesondere haben wir OB Lebensfähigkeit, Differenzierung, und Mineralisierung und OC Lebensfähigkeit und Differenzierung im Rahmen der β-Tricalcium Phosphat (β-TCP) Festplatten getestet. Wir testeten ebenfalls einen β-TCP/Kollagen (β-TCP/C)-Schaum ist ein handelsübliches Material klinisch für Knochen-Reparatur in eine kritische Größe calvarial Knochen-defekt-Maus-Modell verwendet, um festzustellen, die Auswirkungen auf die frühe Phase der Knochenheilung. In parallelen Experimenten haben wir immun und allergische Reaktionen bei Mäusen ausgewertet. Unser Ansatz erstellt eine biologische Verträglichkeit Profil von Knochen Biomaterial mit einer Reihe von Parametern für die Vorhersage der Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochenheilung und Reparatur bei Patienten erforderlich.

Einleitung

Knochen-Reparatur ist ein komplexer Prozess, der mit Hämatombildung, Entzündung beginnt, Kallus, Bildung und dann Umbau1,2. Knochenregeneration Potenzial ist jedoch beschränkt auf die Größe der Knochenbruch1,3. Zum Beispiel große Knochenbrüche verursacht durch ein Trauma, Krebs oder Osteoporose können nicht heilen und Pseudarthrose Knochenbrüche bezeichnet werden. Diese Knochenveränderungen erfordern oft Behandlung gesunde physiologische Knochen Reparatur und Regeneration zu fördern. Derzeit Autotransplantation und Allograft Knochen-Transplantation ist der Ansatz der Wahl4 mit 2,2 Millionen Knochen Ersatzverfahren jährlich5. Obwohl diese Verfahren eine hohe Erfolgsquote haben, möglicherweise gibt es Komplikationen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit von Knochen, Infektion, Spender Website Morbidität und Ablehnung4. Neue Alternativen für das Bone Tissue Engineering werden gesucht, um diese Herausforderungen zu bewältigen.

Das Design von Biomaterialien, basierend auf natürlichen oder synthetischen Polymeren, Biokeramik oder Metalle in Verbindung mit Zellen und bioaktiven Moleküle ist auf dem Aufstieg6. Unser gegenwärtige Verständnis der physiologischen Knochen heilen und Heilung im Zusammenhang mit Biomaterialien hängt von mehrere Faktoren wie mechanische Eigenschaften und mehrere lokale und systemische Faktoren, einschließlich der Zellen aus dem Verkehr und Frakturstelle7 ,8,9. Biomaterialien für Knochenregeneration Osteogenicity und Osseointegration10 fördern und sind im Idealfall biokompatibel, biologisch abbaubar und poröse (Förderung der Zellwanderung, Sauerstoff und Nährstoffe). Sie müssen auch stark genug zur Unterstützung der Frakturstelle, Schmerzen zu lindern. Darüber hinaus sind entzündliche Faktoren erforderlich, um den Heilungsprozess einzuleiten. Jedoch wenn das Biomaterial übermäßige Entzündungen und allergische Reaktionen induziert, könnte dies zu begrenzen oder hemmen Knochenheilung11,12. So ist ein interdisziplinärer Ansatz notwendig, Biomaterialien entwickelt für Knochen-Reparatur zu bewerten.

In dieser Studie stellen wir eine prä-klinischen Bewertung der repräsentativen Materialien (1) Orthovita Vitoss, den Schaum, der im Handel erhältlichen Spongiosa Graft Ersatz bestehend aus Tricalcium Phosphat ist bestehend aus nanometergroßen reines β-tricalcium Phosphat (β-TCP) Teilchen und bovinen Kollagen Typ1 (C) (β-TCP/C-Schaum) und 2) β-TCP-Festplatten. Hier wir illustrieren Biokompatibilität testen diese Biomaterialien mit primären Osteoblasten (OB) und Osteoklasten (OC) assays, eine in Vivo Modell von Knochen zu reparieren, eine immunologische Bewertung bestehend aus in-vitro- Vermehrung der T-Lymphozyten und Produktion von Zytokinen und in Vivo Immunogenität und Allergenität, wie bereits berichtet13.

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Protokoll

Die Verfahren wurden mit BALB/c Mäusen nach allen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft und Forschung getan und wurden genehmigt vom Ausschuss für die Ethik des Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Forschung.

1. primäre Maustaste OB Kultur

  1. OB Isolierung von Neugeborenen Maus Calvaria mit enzymatischen Verdauung
    1. Einschläfern Sie 1 – 2 Tage alten neugeborenen Welpen (insgesamt 60) durch Enthauptung und legen Sie die Köpfe in einer Petrischale mit sterilem 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    2. Halten Sie den Kopf durch den Nacken, und schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Schere. Die Calvarium durch piercing es einzuschneiden (ca. 0,1-0,3 mm) mit einer Schere, die dann unter den Calvarium am Hinterkopf bei der Schädelbasis eingefügt und schneiden Sie entlang der calvarial Kante seitlich von hinten nach vorne über die Ohren und dann Abov e der Nasenrücken (Abbildung 1).
    3. Inkubieren Sie seziert Calvaria mit 8 mL sterilisiert Verdauung Filterlösung (300 Einheiten/mL Kollagenase Typ IV und 2.14 Einheiten/mL Dispase II in α-minimale wesentliche Medium (α-MEM) aufgelöst) in einem 50 mL konische Röhrchen bei 37 ° C für 10 min in ein Schütteln Inkubator an 200 Shakes / min.
    4. Verwerfen Sie den erste überstand und wiederholen Sie drei Mal mit 8 mL Aufschlusslösung Verdauung. Den Überstand enthält die Zellen nach jedem Schritt der Verdauung zu sammeln und eine 50 mL konische Rohr hinzufügen. Speichern Sie die 50 mL konische Rohr mit den Zellen in ein Eis-Wasserbad, bis die Verdauung (ca. 40 min) abgeschlossen ist.
    5. Die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren des Überstands (mit einer Pasteurpipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen) und Aufschwemmen in 40 mL Knochen Wachstumsmedium (BGM) mit α-MEM mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung. Fügen Sie 10 mL Zellsuspension 4 Gewebekultur Platten (10 cm).
    6. Kulturzellen Sie bei 37 ° C und 5 % CO2 bis zum Zusammenfluss (2 – 3 Tage).
    7. Am Zusammenfluss aspirieren Sie das alte Medium und waschen Sie die Gewebekultur Platten einmal mit 1 X PBS (37 ° C). Dann Aspirieren der PBS und 2 mL 1 X Trypsin Lösung mit 0,5 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) auf jede 10 cm Gewebekultur Platte.
    8. Inkubieren Sie 4 Kultur Platten bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min und überprüfen Sie dann die Platten mit einem inversen Licht Mikroskop um sicherzustellen, dass die Zellen aus dem Kunststoff gelöst werden. Übertragen Sie dann alle Zellsuspensionen (insgesamt 8 mL) auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 10 mL frisches BGM. Jede Platte mit 5 mL frischem BGM und Übertragung auf die gleichen 50 mL konische Rohr zu waschen.
    9. Die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in 16 mL frische BGM. Bereiten Sie 16 neue 10 cm Gewebekultur Platten (splitting 1:4) mit 9 mL BGM vor. Fügen Sie 1 mL Zellsuspension auf jede Platte.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.6. bis 1.1.8.
    11. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C, Aspirieren des Überstands und in 10 mL frisches BGM aufzuwirbeln. Zählen der Zellen und die Zellkonzentration zu berechnen.
      Hinweis: Diese Prozedur generiert ca. 7,5-8,3 x 105 Zellen/Pup.
    12. 300 X g für 5 min bei 4 ° C Zentrifugieren, überstand Aspirieren und Aufschwemmen im eiskalten Medium mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 40 % α-MEM und 50 % FBS. Übertragen Sie 1,5 mL Zellsuspension auf 2 mL Cryovials für insgesamt 2 x 106 Zellen pro Vial.
    13. Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff-Tank die Fläschchen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb eines Jahres, um volle Funktionalität zu gewährleisten. Verwenden Sie diese primäre OBs für die Bewertung der Verbreitung (Schritt 1.2), Differenzierung (ALP-Assays: Schritt 1.4., 1,5.) und Mineralisierung (Schritt 1.6.) im Beisein von Biomaterialien. Verwenden Sie diese Zellen für die Reifung der Bone-Marrow-derived OC Vorstufen in Kokultur (Schritt 2.3).
  2. OB Verbreitung assay
    1. Inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Festplatten in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem primären OBS. Verwendung standard Gewebekultur Platten für Steuerelemente hinzufügen und Aussetzung Kultur Platten für die Biomaterial zu Proben vorab vermeiden Sie Zellhaftung auf den Kunststoff.
    2. Aspirieren Sie Vorinkubation Medium und dann aufzuwirbeln Sie primäre Maustaste OBs in BGM. Fügen Sie 4,4 x 104 OBs/cm2 auf den Pre-inkubierten β-TCP-Datenträgern in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte und für die Kontrollgruppe in einer 24-Well-Zellkultur-Platte (1 mL/Na). OBs werden der Gewebekultur-Platte oder das Biomaterial beimessen.
    3. 14 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Während der Inkubationszeit ändern Sie das Medium alle 2 – 3 Tage und 1 mL frisch BGM in jede Vertiefung.
    4. Um zu beurteilen OB Verbreitung, übertragen Sie die β-TCP-Datenträger an den Tagen 7 und 14 zum neuer Brunnen für die Signale aus den Zellen gewachsen auf dem Fahrwerk Kultur Teller ausschließen
    5. Aspirieren Sie das alte Medium, fügen Sie 0,5 mL BGM (37 ° C) und inkubieren Sie die Kultur-Platten für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2. Fügen Sie dann 55 µL 10 x Cell Proliferation Reagenz (01:10 Verdünnung) direkt in die Kultur gut. Bereiten Sie für Zuschnitte drei Brunnen mit 0,5 mL BGM und 55 µL 10 X Cell Proliferation Reagenz. Inkubieren Sie alle Platten für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2.
    6. Zurückziehen und 150 µL des Überstands von jedem Bohrloch in einer 96-Well schwarze Platte übertragen und lesen Fluoreszenz mit Erregung bei 560 nm und Emission bei 590 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Probe-Lesungen.
  3. OB Differenzierung und Mineralisierung assays
    1. Pre-inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Festplatten in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem Hinzufügen der OBS. Verwendung standard Gewebekultur Platten für Steuerelemente und Aussetzung Kultur Platten für die Biomaterial Proben zu vermeiden Zellhaftung auf den Kunststoff.
    2. Aspirieren Sie Vorinkubation Medium und dann aufzuwirbeln Sie primäre Maustaste OBs in BGM. Fügen Sie 8,8 x 104 OBs/cm2 auf den Pre-inkubierten β-TCP-Datenträgern in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte und für die Kontrollgruppe in einer 24-Well-Zellkultur-Platte (1 mL/Na). OBs werden der Gewebekultur-Platte oder der Biomaterial-Probe beimessen.
    3. Ersetzen Sie die BGM mit 1 mL osteogene Mineralisierung Mittel (MM) mit BGM, 50 µg/mL Ascorbinsäure und 5 mM β-Glycerophosphat 24 h nach der Zugabe der OBs und inkubieren Sie für 14 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2. Ändern Sie das Medium alle 2 – 3 Tage mit 1 mL frisch zubereitete MM in jede Vertiefung.
  4. OB Differenzierung von Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) von Zelle Lysates bewertet
    1. Zur Messung der ALP Aktivität am 7. Tag nach der Zugabe von MM aspirieren Sie das Kulturmedium aus dem Brunnen und dann mit 1 mL sterilen 1 X PBS (37 ° C) waschen. Aspirieren Sie sorgfältig die PBS ermöglichen die angeschlossenen Zellen bleiben auf der Gewebekultur Kunststoff oder Biomaterial und fixieren die Platten bei-80 ° C.
    2. Nach 24 Stunden (oder bis zu 2 Wochen), tauen die Steuerplatte Gewebekultur und Biomaterial Aussetzung Kultur Platte bei Raumtemperatur (RT) OB Lyse vorbereiten. Übertragen Sie für die Proben Biomaterial die β-TCP-Datenträger in eine neue Aufhängung Kultur Platte auszuschließende die Zellen an der Platte befestigt. Beide Platten 75 µL pro Bohrloch von 1 x Zelle Lysis Puffer hinzufügen. Schütteln Sie die Platten für 5 min auf einem Boston-Shaker mit 400 Shakes/min.
    3. Übertragen Sie die Zelle lysate in eine 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 300 X g für 6 min bei RT, Ablagerungen zu entfernen. Eine schwarze 96-Well Platte 50 µL der Probe Zelle lysate überstand hinzu, und fügen Sie dann 50 µL einer Lösung bestehend aus 200 µM 6,8-Difluoro-4-Methylumbelliferyl-Phosphat (DiFMUP) Fluorogenic Substrat aufgelöst in 2 x ALP-Puffer (pH 10) pro Bohrloch. Richten Sie zwei leere Brunnen mit 100 µL einer 1:1-Lösung, 1 X Zelle Lysis Puffer und 2 X ALP Puffer enthält.
    4. Bereiten Sie 8 Referenzstandards mit 100 μl/Well mit der 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) zwischen 0,5 bis 200 μM, aufgelöst in 1:1 Lösung mit 1 X Zelle Lysis Puffer und 2 X-ALP-Puffer auf eine standard-Referenz-Kurve zu erzeugen.
    5. Die schwarze Platte bei 37 ° C für 15 min inkubieren und lesen Sie dann die Fluoreszenz der Erregung bei 358 nm mit Emission bei 455 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.
    6. Die ALP-Enzym-Aktivität aus der Zelle Lysates auf den Gesamtbetrag des Proteins mit einer kolorimetrischen Assay für die Proteinkonzentration zu normalisieren. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA) Protein Referenzstandards in einem Bereich von 0,05 bis 2,5 µg/µL aufgelöst in 1 x Zelle Lysis Puffer eine Standardkurve zu generieren.
    7. Bereiten Sie die Probe Zelle Lysates und BSA Proteinstandards in Duplikate. 5 µL der Probenzelle lysate oder 5 µL des BSA Protein standard in einer 96-Well-Platte hinzufügen und fügen Sie dann 25 µL des Reagenz A' und 200 µL des Reagenz b Set up zwei leere Brunnen mit 5 µL 1 x Zelle Lysis Puffer. Die Platten bei RT für 15 min inkubieren und lesen Sie dann die Extinktion bei 690 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.
  5. OB Differenzierung anhand der Färbung ALP in der Zellkultur
    1. ALP in kultivierten OBs am 7. Tag nach der Zugabe von MM auf eine Steuerungsplatine Gewebekultur und Biomaterial in einer Suspension Kultur Platte zu beflecken.
    2. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Brunnen, und ersetzen Sie es mit 0,5 mL 1 X PBS (37 ° C). Aspirieren der PBS und die Zellen zu beheben, indem sie in 0,5 mL 10 % gepuffert Formalin bei RT für 1 min Inkubation.
    3. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin mit einem Einweg-pipettieren und 0,5 mL Waschpuffer (0,05 % Tween20 mit 1 X PBS-Puffer).
    4. Lösen Sie eine 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphat/Nitro blau Tetrazoliumsalz (BCIP/NBT) Substrat Tablette in 10 mL Reinstwasser und Wirbel bis vollständig gelöst. Die Lösung muss vor Licht geschützt werden und innerhalb von 2 h verwendet.
    5. Aspirieren der Waschpuffer und ersetzen mit 0,5 mL Substratlösung BCIP/NBT und inkubieren Sie der Platte bei RT in der Dunkelheit für 10 min. Absaugen der Färbelösung und mit 0,5 mL Waschpuffer.
    6. Übertragen Sie die gefärbten β-TCP-Datenträger zu, in einen neuen Brunnen und Scannen Sie die ALP-gefärbten Platten mit einer konventionellen Flachbett-Scanner zu Rekord ALP Färbung.
  6. OB Mineralisierung durch Färbung mit Alizarin Rot S (ARS) bewertet
    1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Brunnen mit primären OBs 14 Tage nach der Zugabe von MM und spülen Sie zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS bei RT Absaugen der PBS und beheben Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 mL der 10 % Formalin-Lösung für 10 min bei RT gepuffert.
    2. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin mit einem Einweg-pipettieren und zweimal mit 0,5 mL hochreines Wasser waschen.
    3. Die festen OBs fügen Sie hinzu, 0,25 mL 40 mM ARS Färbelösung (pH 4,2) in Reinstwasser gelöst und die Platte bei RT für 10 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min inkubieren.
    4. Aspirieren Sie der Färbelösung mit einem Einweg-pipettieren und mit 1 mL hochreines Wasser abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 – 10 Mal zu unspezifischen entfernen Flecken.
      Hinweis: Der Spüllösung sollte ohne Farbe.
    5. Anzusaugen Sie hochreine Wasser und 1 mL kaltem PBS. Inkubieren Sie die Platte bei RT für 10 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min.
    6. Aspirieren der PBS, übertragen die gefärbten β-TCP-Datenträger zu einem neuen Brunnen und Scannen Sie die Platten mit einem Flachbettscanner, Rekord Mineralisierung.
    7. Geben Sie 0,25 mL 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Platte bei RT für 15 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min den ARS-Farbstoff extrahieren.
    8. Übertragen Sie die Überstände auf eine 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 17.000 X g für 5 min bei RT
    9. Die Extrakte mit einem Verdünnungsverhältnis von 01:10 – 01:20 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung hinzu, und fügen Sie die Proben (300 µL) in eine 96-Well-Platte mit zwei leeren Brunnen mit nur 10 % Cetylpyridinium Chlorid.
    10. Bereiten Sie 7 ARS Referenzstandards von 4 bis 400 µM durch Verdünnung der 40 mM ARS Färbelösung (pH 4,2) mit 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung um eine Standardkurve zu generieren.
    11. Die 96-Well-Platte 300 µL der Referenzstandard in Duplikate hinzufügen.
    12. Lesen Sie die Absorption der Proben, Rohlinge, und verweisen Sie Standards bei 520 nm.
    13. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.

(2) Maus OB OC Kokultur Reife OCs ableiten

  1. Aufbereitung und Sterilisation der bovinen kortikalen Knochen Scheiben
    1. Reinigen Sie Segmente des Knochens aus dem umgebenden Gewebe zu und entfernen Sie den trabekulären Knochen und Knochenmark.
    2. Trocknen Sie die Knochen bei 50 ° C für 24 h.
    3. Die Knochen in kleinere Stücke schneiden und in Scheiben (ca. 300-350 µm dick) schneiden mit einer niedrigen Geschwindigkeit mit einer Diamant-Trennscheibe sah.
    4. Quadratische Platten (1 cm2) geschnitten Sie 300-350 µm Scheiben.
    5. Um die Knochen-Festplatten (1 cm2) zu reinigen, setzen Sie sie in eine verschließbare Glasflasche und mit destilliertem Wasser füllen. Die gefüllten Glases in ein Ultraschallbad zu übertragen und beschallen für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    6. Das destillierte Wasser abgießen, 70 % igem Ethanol hinzufügen und für 5 min beschallen.
    7. Gießen Sie das 70 % Ethanol und mit 100 % Ethanol zu ersetzen.
      Hinweis: Bewahren Sie die Knochen Scheiben in 100 % igem Ethanol bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
    8. Die Knochen-Scheiben mit UV-Licht für 15 min auf jeder Seite unter sterilen Bedingungen zu bestrahlen. Speichern Sie die sterilisierten Knochen Scheiben in einer sterilen Kultur-Platte bei RT bis zur weiteren Verwendung.
  2. Isolierung von Knochenmark OC Vorstufen
    1. Einschläfern Sie naive 8 – 12 Wochen alte BALB/c Mäuse mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
    2. Isolieren der Knochenmark-OC-Vorläufern aus dem Maus Oberschenkelknochen und Tibiae.
    3. Die Beine mit einer sterilen Schere an der engsten Stelle am Körper am Hüftgelenk, schneiden Sie die Glieder auf die Knie und Knöchel Gelenke entfernen Sie und das Weichgewebe mit sterilen Skalpell und Pinzette. Schneiden Sie die Epiphysen. Spülen Sie und hängen Sie das Knochenmark mit 1mL BGM in eine sterile Petrischale 6 cm mit einem 27G Nadel eine 1mL Spritze um eine Zellsuspension zu erhalten.
    4. Eine 50 mL konische Rohr die Zellsuspension hinzu, waschen Sie die 6 cm Petrischale mit 5 mL BGM und Übertragung auf die gleichen 50 mL konische Rohr zu. Zentrifuge bei 350 X g bei 4 ° C für 5 min. Aufschwemmen der Zellen in OC Differenzierung Medium (DM) mit BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-Vitamin D3 und 1 µM Prostaglandin E2 (1 mL/Na).
      Hinweis: Ein BALB/c Maus bietet OC Grundstoffe in ausreichender Zahl für eine Kultur 24-Well-Platte.
  3. Vorbereitung der Maus OB OC Kokultur mit biomaterial
    1. Pre-inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Disketten oder boviner Knochen Scheiben (1 cm2) in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem Hinzufügen der Zellen.
      Hinweis: Boviner Knochen Scheiben sind eine Kontrollgruppe physiologischen Substrat für das Studium OC Differenzierung im Beisein von Biomaterialien.
    2. Fügen Sie 8,8 x 104 Zellen/cm2 der primären OBs angehalten in BGM auf Biomaterialien oder der Kontrolle Knochen in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte oder an einer 24-Well-Zellkultur-Platte hinzu. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.
      Hinweis: OBs zuordnen der Kunststoff oder das Biomaterial oder Rind Knochen.
    3. Füge frisch isolierte Knochenmark OC Vorläufer der 24 h primäre OBs und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 Tage kultiviert. Ersetzen Sie das Medium mit frisch zubereiteten OC DM jeden zweiten Tag. Dann färben Sie OCs für Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), OC Differenzierung zu bewerten.
  4. OC-Differenzierung von TRAP Färbung bewertet
    1. Zur Charakterisierung von Reifen mehrkernigen OCs, gewonnen aus Schritt 2.3.3, aspirieren Sie das Kulturmedium aus Gewebekultur Steuerplatte Biomaterial Aussetzung Kultur Platte und 1 mL 1 X PBS (37 ° C). Aspirieren der PBS und die Zellen zu beheben, indem sie in 1 mL 10 % gepuffert Formalin-Lösung bei RT für 10 min Inkubation.
    2. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin-Lösung mit einem Einweg-pipettieren und fügen Sie 1 mL 1 X PBS am RT. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, dann Aspirieren der PBS, mit 1 mL der TRAP-Puffer (pH 5) ersetzen und die Platten bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    3. Aspirieren des TRAP-Puffers und 1 mL Aceton und 100 % Ethanol 1:1. Inkubieren Sie die Platte bei RT, 30 s. schnell Aspirat Aceton-Ethanol-Lösung mit einem Einweg-pipettieren und vollständig trocknen der Platten bei RT
    4. Bereiten Sie für die Falle Färbelösung eine 10 mg/mL Naphthol-AS-MX Phosphat-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid lösen 0,6 mg/mL schnell rot violett Salz im Falle Puffer und 0,1 mL der Stammlösung Naphthol-AS-MX Phosphat zu 10 mL schnell rot violett Salz hinzufügen im Falle Puffer.
    5. Fügen Sie 1 mL Färbelösung TRAP und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min, dann aspirieren Sie die Falle Färbelösung, und fügen Sie 1 mL Reinstwasser, die Reaktion zu stoppen.
    6. Übertragen der β-TCP-Festplatten und boviner Knochen Scheiben nach dem Färben in einen neuen Brunnen, rot gefärbten OCs mit einem Lichtmikroskop beobachten (Vergrößerung: 10 X) und Auflisten von TRAP + Reifen OCs mit drei oder mehr Kernen.

3. kritische-Size-Maus-Calvarial defekt-Modell

  1. Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan zu injizieren (s.c.) in 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse für Analgesie.
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu, fügen Sie ein Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  3. Rasieren Sie das Fell auf der Oberseite des Kopfes zwischen den Ohren zu und reinigen Sie die Oberfläche mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol.
  4. Machen Sie einen Mittellinie sagittaler Schnitt auf der Oberseite der Schädel zwischen den Ohren mit einem sterilen Skalpell zu entlarven die Calvarium und das Bindegewebe der Schädeldecke oberhalb der rechten parietalen Knochen durch Schaben mit einem Skalpell entfernen.
  5. Erstellen Sie einen kritische Größe defekt im rechten parietalen Knochen mit einer sterilen dental Trephine mit einem Durchmesser von 4 mm (2000 u/min) unter ständiger Bewässerung mit normalen Kochsalzlösung zu verbuchen der rechten parietalen Knochen und Schnitt durch die Ectocortex und einige Endocortex.
  6. Zur Vermeidung von Schäden an der Dura Mater benutzen Sie einen kleine periostalen Aufzug zu durchbrechen die restlichen Endocortex, sorgfältig die calvarial Knochen heben und mit einer Pinzette entfernen. Der daraus resultierende Mangel sollte Rundschreiben und etwa 3,5 mm Durchmesser.
  7. Füllen Sie den calvarial Defekt mit eingeweichter (sterile 1 X PBS bei RT) β-TCP/C Schaum mit Pinzette.
  8. Bereiten Sie die entsprechende Anzahl an Alter abgestimmt, Sham Negativkontrollen mit einem leeren defekt.
  9. Um das Biomaterial in Position zu halten, setzen Sie 0,5 µL Gewebe Klebstoff am Rande des Mangels an zwei gegenüberliegenden Punkten.
  10. Schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht.
  11. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  12. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  13. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Injizieren von Buprenorphin 0,1 mg/kg s.c. für postoperative Schmerztherapie zweimal pro Tag für 72 h Rückkehr vollständig erholt Mäuse in ihren Käfigen.
  14. Um die Wirksamkeit der Biowerkstoff einschläfern Sie Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
  15. Enthaupten Sie bei 8 – 12 Wochen nach der Implantation euthanasierten Maus mit einer scharfen Schere.
  16. Update der enthaupteten Maus-Kopf in 30 mL von 4,5 % gepuffert Formalin-Lösung für 1-2 Wochen volle Penetration das Fixativ in das Gewebe zu garantieren.
  17. Übertragen Sie die Köpfe in 70 % igem Ethanol für die langfristige Lagerung bei 4 ° C bis zu einem Jahr.
  18. Verwendung Mikro berechnet Tomographie (MicroCT) oder standardisierte undecalcified histologischen Techniken zur Knochenregeneration zu bewerten. Es ist möglich, MicroCT auf Post-mortem Proben mit hoher Auflösung scannen verwenden (90 kV, 4 min) in 2D und 3D sagittalen und frontalen Ebenen.
  19. Für undecalcified Histologie Entwässern Sie die Köpfe in aufsteigender Noten von Ethanol und in Glykol Methylmethacrylat einbetten.
  20. Schneiden Sie Glykol Methylmethacrylat eingebettet Blöcke mit einer Diamant-Säge und Schleifen Sie die Abschnitten bis zu einer Dicke von ca. 80-100 µm.
  21. Bewerten Sie Levai Laczko gebeizt Knochen Abschnitte um neue Knochen Bildung14zu identifizieren.

4. in-vitro- Immunantworten

  1. Naive 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin einschläfern.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf der rechten Seite, Rasieren Sie das Fell auf der linken Seite zu und reinigen Sie die Haut über der linken Seite des Bauches mit 70 % Ethanol.
  3. Machen Sie einen 10 mm langen und 1 mm tiefen Einschnitt in die Haut der Maus auf der linken Seite nach hinten nach dem Rippen über den Magen mit einer sterilen Schere.
  4. Öffnen Sie die Haut und setzen Sie dann das Bauchfell. Machen Sie eine 10 mm lang und weniger als 1 mm tiefen Einschnitt in das Bauchfell mit einer Schere unter sterilen Bedingungen.
  5. Drücken Sie den Magen nach proximal, die Milz verfügbar zu machen.
  6. Halten Sie die Milz sanft mit der sterilen Pinzette und entfernen Sie sie durch das Schneiden des Gewebes und Schiffe, darunter befestigt.
  7. Legen Sie die intakte Milz in ein 50 mL-Tube mit 10 mL kalten 1 x sterile PBS.
  8. Bereiten Sie ein einzelnes Zellsuspension durch Zerkleinern der Milz mit 2 sterilen Pinzette oder 2 sterilen Objektträger vor.
  9. Entfernen Sie Schmutz, indem man es durch eine sterile 40 µm Zelle Sieb mit kalten 1 X PBS mit dem Kolben eine 1 mL Spritze.
  10. Die einzigen Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C in einem 50 mL konische Röhrchen Zentrifugieren, Aspirieren und überstand verwerfen. Dann erneut die Zelle Pellet in 5 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer.
  11. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 14 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion zu, indem man 45 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium.
  12. Die Zellen nach der Lyse der Zelle bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und verwerfen Sie den überstand.
  13. Aufschwemmen Splenocyten in RPMI Medium mit 10 % inaktivierten Hitze-FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin Lösung 0,1 % Gentamicin, 0,2 % ß-Mercaptoethanol und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren.
  14. Pre-inkubieren Sie β-TCP/C Schaum in einer 96-Well sterilen Kultur-Platte mit RPMI Medium für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2 vor der Aussaat der Zelle.
  15. Fügen Sie Splenocyten am betitelten zahlen, zB., 1,25 x 105, 2,5 x 105 und 5 x 105/well nach Wells in einer Gewebekultur 96-Well-Platte mit RPMI Medium und Zusatzstoffe, mit oder ohne die Pre inkubierten β-TCP/C-Schaum.
  16. Fügen Sie 10 µg/mL Concanavalin (Con A) im Medium für eine Gesamtmenge von 100 µL/Well in die entsprechenden Vertiefungen aufgelöst und dann Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 72 h.
  17. Zellproliferation mit einem Bromodeoxyuridine (BrdU) Assay zu messen. Fügen Sie 10 µL/Well BrdU Kennzeichnung Lösung bei 48 h von Zellkultur und inkubieren Sie die Platte für weitere 24 h.
  18. Mit 72 h den Überstand zu sammeln und bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern.
  19. Jedes gut 200 µL/Well der Fixierung-Lösung hinzu und dann für 30 min bei RT Aspirat inkubieren Sie Fixierung Lösung. Fügen Sie 100 µL/Well von der Anti-BrdU Antikörper Arbeitslösung und 90 min inkubieren.
  20. Aspirieren Sie der Antikörperlösung, spülen Sie die Brunnen dreimal mit 200 – 300 µL/Well der Waschlösung und entfernen Sie die Waschlösung.
  21. 100 µL Substratlösung hinzufügen und 3 – 10 min bei RT inkubieren, dann messen Sie die Extinktion bei 450 nm.
  22. Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4) und Interferon-γ (IFN-γ) in den gesammelten Überstände mit einem standard ELISA zu messen.

5. hohe Durchsatz intraperitoneale Modell

  1. Betäuben Sie weibliche 6-8-Wochen alten BALB/c Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu und fügen Sie ein Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  2. Das Bauch-Fell rasieren und mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 %-Ethanol reinigen.
  3. Ein 8 mm langen Mittellinie Einschnitt durch die Haut entlang der Linea Alba. Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Bauchfell mit einem Skalpell.
  4. Sterile PBS Ort getränkt β-TCP/C Schaum Transplantate (2 x 2 x 2 mm-3) in der Bauchhöhle oder ohne Zusatz von Materialien für die Alter abgestimmt Sham-Kontroll-Mäusen.
  5. Naht das Peritoneum und die Haut mit resorbierbaren und nicht resorbierbaren Naht, beziehungsweise.
  6. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  7. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  8. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Zurück vollständig wiederhergestellten Mäuse in ihren Käfigen.
    Hinweis: Dieses Verfahren führt zu minimalen Schmerzen. Postoperative Schmerztherapie ist in der Regel nicht notwendig. Wenn die operierten Tiere zeigen Anzeichen von Schmerzen, 0,1 mg/kg Buprenorphin injizieren s.c. oder einem anderen geeigneten Analgetikum zur Schmerzlinderung.
  9. Einschläfern der Mäuse 7 Tage nach der Implantation, mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin i.p.
  10. 7 Tage nach der Implantation Lavage der Bauchhöhle mit einer 1 mL Spritze mit einer Nadel 25 G für eine Gesamtmenge von 3 mL kaltem PBS durch Gedrückthalten der Maus-Kopf und einsetzen der Nadel in der linken unteren abdominalen Quadranten und Streben nach proximal.
    Hinweis: Die peritoneale Flüssigkeit sollte frei von Erythrozyten sein.
  11. Zentrifugieren der peritoneal Lavage-Flüssigkeit bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C und sammeln die peritoneale Flüssigkeit bei-20 ° C für ELISA Messungen der Zytokine IL-1β, IL-2 und IL-4 zu speichern.
  12. Den Überstand abgesaugt, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL PBS und zählen die peritonealen Zellen verwenden Trypan blau auf einem Hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge der Zellsuspension auf 5 x 105 Zellen auf Glas-Objektträger, können die Folien trocknen und für eine differenzierte Zellzahl Flecken.
  14. Mit einem Lichtmikroskop, zählen ein Minimum von 300 Zellen insgesamt und Makrophagen, Eosinophilen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten unterscheiden.

6. subchronische subkutane Modell

  1. Betäuben Sie weibliche 6 – 8 Wochen alten BALB/c Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu, fügen Sie Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken, das Bauch-Fell rasieren und rasierte reinigen mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol.
  3. Ein 8 mm langen Mittellinie Einschnitt durch die Haut entlang der Linea Alba des Bauches mit einem Skalpell und dann Implantat PBS getränkt Biomaterial (2 x 2 x 2 mm-3) unter die Haut oder fügen Sie keine Materialien für das Alter abgestimmt Sham-Kontroll-Mäusen.
  4. Naht der Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht.
  5. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  6. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  7. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Zurück vollständig wiederhergestellten Mäuse in ihren Käfigen.
    Hinweis: Dieses Verfahren führt zu minimalen Schmerzen. Postoperative Schmerztherapie ist in der Regel nicht notwendig. Wenn die operierten Tiere zeigen Anzeichen von Schmerzen, 0,1 mg/kg Buprenorphin injizieren s.c. oder eine andere geeignete Schmerzmittel.
  8. Wenn Sie bereit sind, den Implantationsort zu untersuchen, einschläfern Sie die Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
  9. Acht Wochen nach der Implantation, Verbrauchsteuern Implantationsort mit umgebenden Gewebes (1 cm2).
  10. Fixieren Sie das Gewebe in 4,5 % gepuffert Formalin-Lösung über Nacht, in Paraffin eingebettet und in 4 µm Abschnitte schneiden.
  11. Fleck 4 µm Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) für Entzündungen oder Masson trichrome für Kollagen Ablagerung und Fibrose.

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Ergebnisse

Um β-TCP für seine Wirksamkeit als Biomaterial für Knochen-Reparatur zu beurteilen, haben wir in Vitro und in Vivo screening-Verfahren verwendet. Erstens haben wir die OB-Antworten auf die β-TCP-Festplatten im Vergleich zu Grundlinie mittlere allein Kontrollen gemessen. Abbildung 2 zeigt OB Rentabilität als Reaktion auf β-TCP-Festplatten auf 7 bis 14 Tage der Kultur. Zellviabilität gemessen von metabolisch aktiven Zellen in der Kultur-Brunne...

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Diskussion

Hier zeigen wir einen multidisziplinären Ansatz für die präklinische Bewertung der Biokompatibilität für repräsentative Biomaterialien für die Knochenregeneration und Reparatur entwickelt. Wir testeten die Antworten der OBs, OCs, und die in Vivo heilende Reaktion in einer kritischen Knochendefekt Modell bei Mäusen als auch in Vitro und in Vivo Immunantworten. Wir wollten zeigen, wie die Assays arbeiten und fassen die Daten und Schlussfolgerungen aus der Untersuchung von Biomaterialien. Wir zeig...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Dieses Forschungsprojekt wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 263363.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biomaterials
β-Tricalciumphosphat-Scheiben (β-TCP, 14 mm)Die Scheiben wurden in einem Muffelofen bei einer Temperatur von 1150 μC gesintert. Eine detaillierte Beschreibung der Produktion findet sich in Zimmer et al. (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Die Proben wurden vor der Verwendung in Zellkulturen UV-bestrahlt (15 min für jede Seite).
Orthovita Vitoss Schaum (β-TCP/C Schaum)Orthovita2102-1405
Maus Osteoblastenkultur
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
ALP Assay Puffer (2x) pH 10,4200 mM Glycin, 2 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Zinkchlorid in Reinstwasser auflösen und auf pH 10 einstellen.
Knochenwachstumsmedium (BGM)α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin/Streptomycin
Zelllysepuffer: CyQuant Zelllysepuffer 20x KonzentratThermo ScientificC7027Verdünnen Sie den konzentrierten Zelllysepuffer 20-fach in Reinstwasser.
Reagenz für die Zellviabilität: Presto Blue Reagenz für die Lebensfähigkeit von ZellenInvitrogen, Thermo Fisher ScientificA13261
Kollagenase Typ IV aus Clostridium histolyticumSigma-AldrichC5138
DC Protein Assay Kit IIBio Rad5000112DC Protein Assay Kit enthält Reagenz A, Reagenz B, Reagenz S und BSA für den Referenzstandard. Für Reagenz A' fügen Sie 20 µ L Reagenz S bis 1000 &Mikro; L Reagenz A. 
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD8418Sterilfilter DMSO vor dem Gebrauch. 
Dispase II (neutrale Protease, Grad II)Roche4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit für alkalische Phosphatase-Aktivität Invitrogen, Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit enthält 6,8-Difluor-4-methylumbelliferylphosphat (DiFMUP), N,N-Dimethylformamid und 6,8-Difluor-7-hydroxy-4-methylcumarin (DiFMU). 
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalinlösung neutral gepuffert 10%Sigma-AldrichHT501128
GlycinSigma-AldrichG8898
Hexadecylpyrdinium (Cetylpyridinium)-chlorid-MonohydratSigma-AldrichC9002
L-Ascorbinsäure 2-phosphat SesquimagnesiumsalzhydratSigma-AldrichA8960
Magnesiumchlorid-HexahydratSigma-AldrichM2670
MEM alpha medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
Osteogenes Mineralisationsmedium (MM)α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin + 50 & Mikro; g/mL Ascorbinsäure + 5 mM β-Glycerophosphat
Penicillin-Streptomycin  Sigma-AldrichP4333
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Sigmafast BCIP/NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0,5%), kein Phenolrot (10x)Gibco, Thermo Fisher Scientific 15400054Verdünnen Sie die konzentrierte Stammlösung 10-fach in 1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfreiVWRL0970-500
Waschpuffer0,05 % Tween20 bis 1x PBS.
ZinkchloridSigma-Aldrich1.08816
β-Glycerophosphat DinatriumsalzhydratSigma-AldrichG5422
24-Well-SuspensionskulturplatteGreiner bio-one662102
24-Well-GewebekulturplatteGreiner bio-one662160
50 mL konisches RöhrchenGreiner bio-one227261
96-Well-SchwarzplatteGreiner bio-one655076
96-Well-KlarplatteGreiner bio-one655001
Zentrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Inkubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 mLGreiner bio-one122263
Einweg-Filtereinheit FP30/0,2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200Für die Sterilfiltration von Enzymlösungen.
Flachbettscanner: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro Mikroplatten-ReaderTecan
Mikrozentrifugenröhrchen: Eppendorf Röhrchen Safe-Lock 0,5 mLVWR20901-505
Mikrozentrifugenröhrchen: Eppendorf Tube Safe-Lock 1,5 mLVWR21008-959
Shaker Swip (orbital und horizontal)Edmund Bühler 
Schüttel-Inkubator GFL3032GFL 3032
Einmalpipette: SerumpipetteGreiner bio-one612301
Sterile Instrumente (Schere, Pinzette, gebogene Pinzette)
Gewebekulturplatte (10 cm)Greiner bio-one664960
Maus-Osteoblasten-Osteoklasten-Co-Kultur
1α,25- Dihydroxyvitamin D3Sigma-Aldrich179361000x konzentrierter Stamm (10 & Mikro; M in Ethanol 100%)
AcetonVWR Chemicals22065.327
Knochenwachstumsmedium (BGM)α-MEM + 10% hitzeinaktivierte FBS + 1% Penicillin-Streptomycin
Destilliertes WasserCarl Roth3478.4
Ethanol (100% vol/vol)VWR Chemicals20821.365
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Schnelles rotviolettes LB-SalzSigma-AldrichF3381
Fötales Rinderserum (FBS)Sigma-AldrichF7524
Formalinlösung neutral gepuffert 10%Sigma-AldrichHT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies11900-073
N,N-DimethylformamidSigma-AldrichD4551
Naphthol AS-MXphosphat Sigma-AldrichN4875
Osteoklasten-Differenzierungsmedium (DM)α-MEM + 10% hitzeinaktiviertes FBS + 1% Penicillin-Streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-Vitamin D3 + 1 µ M Prostaglandin E2 
Penicillin-Streptomycin Sigma-AldrichP4333
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Prostaglandin E2 (PGE2)Cayman Chemical Company90030161000x konzentrierter Stamm (1 mM in Ethanol 100%)
Natriumacetat-TrihydratSigma-AldrichS7670
Natriumtartrat zweibasisches DihydratSigma-AldrichS8640
Sterile Instrumente (Schere, Pinzette, Skalpell)
TRAP Puffer pH 5,040 mM Natriumacetat, 10 mM Natriumtartrat in Reinstwasser auflösen und auf pH 5 einstellen.
Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfreiVWRL0970-500
24-Well-SuspensionskulturplatteGreiner bio-one662102
24-Well-GewebekulturplatteGreiner bio-one662160
50 mL konisches RöhrchenGreiner bio-one227261
Zentrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
CO2-Inkubator: HeraCell 240Thermo Scientific
Diamond Wafering-Klinge (10,2 cm x 0,3 cm)Bühler
Isomet NiedriggeschwindigkeitssägeBühler
Petrischale (6 cm)Greiner bio-one628,161
Glasflasche mit Schraubverschluss 20 mLCarl RothEXY4.1
Sterile Einwegspritze 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Einwegpipette: SerumpipetteGreiner bio-one612301
Sterile Nadel: Injektionsnadel RW 27 G x 3/4''HenrySchein Animal Health9003340
Maus Schädelbad Defektmodell
Analgesie: Buprenorphin (Bupaq)Richter Pharma AG
Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Kaltsterilisationsmittel: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Augensalbe: VitA POS 5 gUrsapharm
Normal Kochsalzlösung (0,9% Natriumchloridlösung)Fresenius Kabi
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% gepuffertes FormalinCarl Roth2213.6
Gewebekleber: Histoacryl 5 x 0,5 mL B. Braun Surgical1050060
Persönliche Schutzausrüstung: OP-Handschuhe, Mütze und Maske, KittelHenry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter)
Sterile Nadeln: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' und 30 G x 1/2'' Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
sterile Einwegspritze 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Heizplatte: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Sterile MulltupferHenry Schein Animal Health220192
Steriles Einwegskalpell (Figur 20)Henry Schein Animal Health9008957
Chirurgischer/zahnmedizinischer Bohrer: Implantmed SI-923W& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
Handstück Typ S-IIW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
Trephine, Durchmesser 4 mmHager& Meisinger GmbH229040
Bewässerungsschlauch-Set 2,2 mW& H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
Periostlift 2 mm / 3 mmHenry Schein Animal Health472683
Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Polyester grün, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cmHenry Schein Animal Health300715
In vitro Immunantworten
Anästhesie zur Euthanasie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Zellproliferation ELISA, BrdU (kolorimetrisch) Assay KitSigma-Aldrich11647229001Das Kit enthält BrdU-Markierungslösung, Fixierungslösung (FixDenat), Anti-BrdU-Antikörperlösung, Waschpuffer und Substratlösung.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
Nährmedium SplenozytenRPMI-Medium + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung + 0,1 % Gentamicin + 0,2 % ß-Mercaptoethanol + 1 % nicht-essentielle
Aminosäuren Ethanol (70 % vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific& nbsp;
GentamicinGibco, Thermo Fisher Scientsp;
Maus IL-1β ELISA Auf die Plätze, fertig, los!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Maus IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Maus IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Maus INF-γ ELISA MAX StandardBioLegend430801
Lösung für nicht-essentielle AminosäurenGibco, Thermo Fisher Scientific 
Penicillin-Streptomycin Gibco, Thermo Fisher Scient 
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC): BD Pharm LyseBD Bioscience555899
RPMI 1640 Medium, HEPESGibco, Thermo Fisher Scientific 52400025
β-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific 
konisches 50-ml-RöhrchenGreiner bio-one227261
96-Well-GewebekulturplatteGreiner bio-one655180
Zentrifuge: VWR Mega Star 600RVWR
Zellsieb 40 & Mikro; mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro Mikroplatten-ReaderTecan
Sterile Einwegspritze 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile chirurgische Instrumente (Pinzetten, Objektträger<
stark>Intraperitoneales Modell mit hohem Durchsatz
Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Kaltsterilisationsmittel: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Augensalbe: VitA POS 5 gUrsapharm
Maus IL-1β ELISA Auf die Plätze, fertig, los!Invitrogen, Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Maus IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Maus IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scient 
Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff FärbekitThermo Scientific9990700Für die differentielle Zellzahl.
Heizplatte: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Hämozytometer: Neubauer-KammerCarl RothPC72.1
Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Resorbierbares Nahtmaterial: PolysorbCovidienSL-5628
Shandon-Zentrifuge für CytopsinThermo Scientific
Sterile Einmalspritze 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile MulltupferHenry Schein Animal Health220192
Sterile Nadeln: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' und 25 GHenry Schein Animal Health9003340, 420939
Sterile chirurgische Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter)
Trypanblaue Lösung 0,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 15250061
Subchronisches subkutanes Modell
Anästhesie: Ketamin (Ketamidor), Xylazin (Rompun)Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Kältesterilisator: SafeSept MaxHenry Schein Animal Health9882765
Ethanol (70% vol/vol)VWR Chemicals93003.1006
Augensalbe: VitA POS 5 gUrsapharm
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4Gibco, Thermo Fisher Scientific 
Povidon-Jodlösung: Braunol 1000 mLB. Braun3864154
Roti-Histofix 4,5% gepuffertes FormalinCarl Roth2213.6
Heizplatte: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
Nicht resorbierbares Nahtmaterial: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
Persönliche Schutzausrüstung: chirurgisch Handschuhe, Mütze und Maske, KittelHenry Schein Animal Health1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile Einwegspritze 1 mLHenry Schein Animal Health9003016
Sterile MulltupferHenry Schein Animal Health220192
Sterile Instrumente (Skalpell, Schere, Pinzette, Nadelhalter)
Sterile Nadel: Injektionsnadeln RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Tiergesundheit9003340, 420939
10010023100100231001002310500064157500371114005015140122100100233135001010010023%10010023

Referenzen

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  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
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