Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Summary

Mitophagy, den selektiven Abbau von Mitochondrien, hat im mitochondrialen Homöostase in Verbindung gebracht und ist in den verschiedenen menschlichen Krankheiten dereguliert. Bequeme experimentelle Methoden zur Messung Mitophagy Aktivität sind jedoch sehr beschränkt. Hier bieten wir eine sensible Test zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Durchflusszytometrie.

Abstract

Mitophagy ist ein Prozess der selektiven Entfernung von beschädigten oder unnötige Mitochondrien Autophagie Maschinen. Enge Verbindungen wurden zwischen defekten Mitophagy und verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Stoffwechselerkrankungen gefunden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese Mitophagy in normalen zellulären Prozessen, wie z. B. Differenzierung und Entwicklung beteiligt ist. Die genaue Rolle der und molekularen Mechanismen, die Mitophagy erfordern jedoch weiteren Studien. Daher ist es wichtig, eine robuste und bequeme Methode zur Messung der Veränderungen im Mitophagy Aktivität zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der quantitativ Mitophagy Tätigkeit mittels Durchflusszytometrie mit den Mitochondrien gezielt fluoreszierenden Proteins Otamegane (Mt-Otamegane). Dieser Assay Flow Cytometry kann Mitophagy Aktivität schneller und sensibler als bei konventionellen Mikroskopie oder Immunoblotting-basierte Methoden analysieren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Mitophagy Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu analysieren.

Introduction

Mitochondrien sind Organellen, die Zellproliferation und Physiologie unverzichtbar sind. Mitochondrien sind für die Erzeugung von mehr als 80 % der ATP-Versorgung über Oxidative Phosphorylierung verantwortlich, und sie bieten auch verschiedene Stoffwechsel Zwischenprodukte für Biosynthese und Metabolismus^1,2. Neben ihrer Rolle in der Energieversorgung und des Stoffwechsels spielen Mitochondrien zentrale Rollen in viele andere wichtige Prozesse, einschließlich reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation, die Regulierung der Zelltod und intrazellulären Ca^{2 +} Dynamik³ . Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien wurden mit menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes Mellitus und verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten^4,5verbunden. Erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mitochondriale DNA-Mutationen sind auch gedacht, um zum normalen Alterungsprozess Prozesse^6,7,8beitragen. Qualitätskontrolle ist daher ein zentrales Thema in den Mitochondrien. Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die ständig ihre Form zwischen längliche Netzwerke und kurze, fragmentierte Form ändern können. Mitochondrien Dynamik spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Mitochondrien sowie deren Abbau durch Mitophagy⁹.

Mitophagy ist ein Mechanismus, den selektiven Abbau der ganze Mitochondrien Autophagie Maschinen. Mitophagy ist der Grundsatz Mechanismus zugrunde liegende mitochondriale Umsatz und die Entfernung von beschädigten oder gestörte Mitochondrien. In diesem Prozess sind Mitochondrien vor umgeben durch eine Membran, was zur Bildung von autophagosom, die dann mit Lysosomen für hydrolytische Abbau⁹verschmelzen. Vorherigen genetischen Drosophila deutet an, dass zwei der Parkinson-Krankheit-Genen, PTEN-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) (PARK6) und Parkin (PARK2), funktionieren in der gleichen Weg^10,11. Untersequenz Studien haben gezeigt, dass der PINK1-Parkin Weg verantwortlich ist für die Beseitigung der beschädigten Mitochondrien und Mängel in diesem Weg führen dysfunktionalen Mitophagy und dazu, Krankheiten beim Menschen^{12,13 beitragen kann}. Defekte in Mitophagy Prozesse wurden vor kurzem in verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen, Erkrankungen der Leber und Neurodegenerative Krankheit ¹⁴gefunden. Neuere Studien haben darüber hinaus auch gezeigt, dass Mitophagy entscheidend für viele physiologische Prozesse, z. B. Differenzierung und Entwicklung der Immunantwort^{15,16,17,18 ,19}, was darauf hindeutet, dass Mitophagy eine aktivere Rolle bei der Kontrolle der Zellfunktionen spielen kann.

Trotz den letzten Bestätigung des Mitophagy spielt eine wichtige Rolle in beiden Qualitätskontrolle in den Mitochondrien und menschlicher Erkrankungen, die molekularen Mechanismen, die Mitophagy bleiben schlecht verstanden. Obwohl Mitophagy-bezogene Mechanismen in der Hefe systematisch untersucht worden sind, haben Studien zur Erforschung Mitophagy-bezogene Mechanismen in Säugetierzellen hauptsächlich auf den PINK1-Parkin Weg konzentriert. Frühere Studien haben festgestellt, dass die PINK1-Parkin-Weg in erster Linie verantwortlich für die selektive Entfernung von beschädigten Mitochondrien über Mitophagy^12,20,21. Jedoch haben neuere Studien berichtet, dass bei einigen Modellen auch in Abwesenheit von funktionalen PINK1^22,23,24Mitophagy aktiviert werden kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neben den PINK1-Parkin Weg, dort eine zusätzliche unbekannten Weg, die Mitophagy aktivieren können.

Das Fehlen eine bequeme Methode, um Mitophagy Tätigkeit zu beurteilen ist ein Haupthindernis zu erkunden die Wege, die Mitophagy und ihre Rolle bei der pathophysiologischen Ereignisse zu regulieren. Elektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Autophagosome verschlungen Mitochondrien direkt sichtbar zu machen. Elektronen-Mikroskopie hat jedoch Einschränkungen bei der Quantifizierung der Mitophagy Aktivität. Obwohl die Strategien, mit denen Mikrotubuli-assoziierten Protein-1 Kette 3 (LC3) Licht-konjugierte fluoreszierende Sonden, wie GFP-LC3, sind derzeit die am weitesten verbreitete Ansätze²⁵, die vergängliche Natur des Signals LC3-basierte und seine hohe falsch-Positive Signale begrenzen seine Empfindlichkeit zur Erkennung von Mitophagy in Zellen²⁶. Eine Kombination von westlichen Beflecken zur Messung der mitochondrialen Protein-Ebene, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA und Fluoreszenz-Mikroskopie-Analyse zu Mitochondrien mit autophagosom oder Lysosomen colocalize wäre ein guter Ansatz für die Bewertung Mitophagy. Allerdings rufen Quantifizierung Einschränkungen und mangelnder Komfort von bestehenden Methoden für neue Ansätze. Die Einführung einer neuen pH-abhängig fluoreszierenden Proteins, das mitochondriale Ziel Otamegane (Mt-Otamegane), verbessert stark die Fähigkeit, Mitophagy²⁷zu erkennen. Durch die Verschmelzung der mitochondrialen Zielversionen Abfolge von Cytochrom C Oxidase Untereinheit VIII (COX VIII) in Otamegane, richtet sich die Mt-Otamegane an der mitochondrialen Matrix. Die große Verschiebung in der Erregung Höhepunkt des Tages von 440 nm auf 586 nm (entsprechend pH 7 und pH 4, beziehungsweise) kann genutzt werden, um Mitophagy mit guten sensibel in in Vitro und in Vivo Experimente^{28,29 bewerten} . Noch wichtiger ist, verursacht der Widerstand der Mt-Otamegane lysosomalen Abbau die Integration des Mt-Otamegane Signals in Lysosomen, ermöglicht die einfache quantitative Messung der Mitophagy Tätigkeit. Die Fluoreszenz-Änderung, die in Mt-Otamegane Auftritt kann entweder konfokalen Mikroskopie analysiert werden oder flow Cytometry^28,29. Jedoch hat eine Flow Cytometry basierende Methode zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Mt-Tages im Detail bis heute nicht erbracht.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine Flow Cytometry basierende Technik zur Messung Mitophagy Aktivität in den Zellen mit Mt-Otamegane. Obwohl wir hier gezeigt haben, dass Flow Cytometry Analyse erfolgreich CCCP-induzierten Mitophagy in HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Parkin erkannt, kann diese Technik auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden.

Protocol

1. Generation von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Mito-Otamegane (Mt-Otamegane)

1. Vorbereitung der Mt-Otamegane lentivirus
   1. Bestreichen Sie eine 100-mm-Kulturschale durch Zugabe von 2 mL von 0,001 % Poly-L-Lysin/Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und für 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
   2. Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung mit einer Glaspipette verbunden mit einem Vakuum und waschen Sie der Kulturschale durch Zugabe von 2 mL 1 X PBS.
   3. Platte 1,5 x 10⁶ HEK293T Zellen auf die beschichtete Kultur Schüssel mit 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem CO₂ Gewebekultur Inkubator für einen Tag.
   4. Transfizieren 2 µg von Mt-Otamegane Lentivirale Plasmid²⁹ DNA zusammen mit Verpackung DNAs (PsPAX 2 µg und pVSVG 0,25 µg) mit einem Transfection Reagens für 8 h entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
   5. Entfernen Sie die Transfektion Medium und 8 mL frische Medien.
   6. Sammeln Sie das Medium mit Viruspartikel 48 h später. Die gesammelten Medien durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min zelltrümmer entnehmen und sie mit einem 0,45-µm-Spritze-Filter filtern.
      Hinweis: Für den langfristigen Einsatz Aliquote Lentivirale Partikel und speichern Sie die Proben bei-80 ° C. Vermeiden Sie die virale Proben um Frost-Tau-Zyklen für effiziente Virusinfektion zu unterwerfen.
2. HeLa-Parkin Zellen mit Mt-Otamegane Lentivirus zu infizieren
   1. Platte 5 x 10⁴ -HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Parkin (HeLa-Parkin) in der Kulturschale von 60 mm mit 4 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C einen Tag vor der Ernte die Mt-Otamegane Lentivirus.
      Hinweis: Wegen des Fehlens von endogenen Parkin Ausdruck in HeLa Zellen³⁰, die HeLa-Parkin Zellen hier verwendet, um mehr klar zeigen CCCP-induzierten Mitophagy. Dieses Verfahren kann auch auf andere primäre oder immortalisierte Zelllinien angewendet werden.
   2. Entfernen Sie am nächsten Tag das Wachstumsmedium zu und fügen Sie 1 mL der Mt-Otamegane Lentivirale Medien. Hinzugeben Sie eine zusätzliche 2 mL Wachstumsmedium, enthält 3 µL Polybrene-Stammlösung (8 mg/mL in destilliertem Wasser). Eines Tages in eine CO₂ Gewebekultur Inkubator inkubieren.
   3. Entfernen Sie die Mt-Otamegane Lentivirale Mischung am nächsten Tag und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 X PBS. 4 mL Wachstumsmedium hinzufügen und die Zellen mit 2 µg/mL Puromycin für zwei Tage zu behandeln.
   4. Entfernen Sie nach zwei Tagen Puromycin Auswahl das Wachstumsmedium, und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 X PBS. Wachstumsmedium hinzufügen und Kultur der Zellen in einem CO₂ Inkubator bis zur Verwendung.
      Hinweis: Diese Methode kann angewendet werden, um Zellen zu generieren, die stabil Mt-Otamegane, einschließlich anderer Zelllinien und Primärzellen Ausdrücken.

(2) Induktion Mitophagy mit CCCP Behandlung und FACS Probenvorbereitung

1. Platte 5 x 10⁴ HeLa-Parkin Zellen mit dem Mt-Tages in einer 60-mm-Kultur Ausdruck Schüssel mit 4 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur sie für einen Tag bei 37 ° C in einem CO₂ Gewebekultur Inkubator.
2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag und 4 mL frische DMEM mit 10 µM Carbonyl Zyanid m-Chlorophenylhydrazone (CCCP). Inkubieren Sie HeLa-Parkin-Mt-Otamegane Zellen in eine CO₂ Gewebe-Brutkasten für 6 h.
3. Entfernen Sie das Wachstumsmedium 6 h später zu und waschen Sie die Zellen mit 2 mL 1 X PBS. Lösen Sie die Zellen, indem mit Trypsin/EDTA-Lösung behandeln und inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von Wachstumsmedium mit 10 % FBS. Übertragen Sie die Zellen in einer 15 mL konische Rohr.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min.
5. Vorsichtig herausnehmen Sie das Wachstumsmedium durch Absaugen und aufzuwirbeln Sie die Zellen mit 1 mL kalten 1 X PBS.
6. Übertragen Sie Zellen in das entsprechende FACS-Rohr und legen Sie es auf dem Eis.
   Hinweis: Bereiten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen als Negativkontrolle.
   Hinweis: Zellen sind auf Eis für mehrere Stunden lebensfähig, und Mt-Otamegane Fluoreszenz Signale auch stabil bleiben.

(3) FACS Analyse der mitophagy

Hinweis: In dieser Studie wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem 405 nm und 561 nm Laser analysiert. Zellen waren begeistert mit einem violetten Laser (405 nm) mit Emission bei 610 ± 10 nm erkannt, mit einem BV605-Detektor und mit einem Gelb-Grün-Laser (561 nm) mit Emission bei 610 ± 10 nm durch eine PE-CF594-Detektor gleichzeitig erkannt (Abbildung 1).

1. Anspritzung von lebenden Zellen
   1. Schalten Sie das Durchflusszytometer und den Computer und melden Sie sich bei der Analyse-Software.
   2. Generieren Sie ein neues Experiment oder duplizieren Sie vorhandener Experiment. Zellen mit violetten begeistern (405 nm) und gelb-grün (561 nm) Laser und Emission bei 610 ± 10 nm Detektor erkennen, wählen Sie BV605 und PE-CF594 neben forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) im Fenster "Parameter" als erforderlich Fluorophore.
      Hinweis: Alle Fluorophore sollte in einem linearen Modus hinzugefügt werden.
   3. Vortex aggregiert jedes Zellprobe kurz zu Zelle zu zerstreuen.
   4. Das Rohr mit einer Kontrolle HeLa-Parkin Zellprobe, die nicht mit Mt-Otamegane Lentivirus auf die Probe spritzenport infiziert ist, und drücken Sie "run" auf die Cytometer.
   5. Passen Sie in der Dot-Plot des FSC gegen SSC die FSC und SSC Spannung um Zellen in der Mitte des Dot-Plot zu platzieren.
   6. Zeichnen Sie ein P1-Tor mit dem Polygon-Symbol aller lebenden Zellen und beseitigen Sie abgestorbene Zellen und zellenrückstand (Abbildung 2A).
2. Anpassen der Spannungen für die violette und grüne laser
   1. Legen Sie das Rohr mit HeLa-Parkin Zellen infiziert mit Mt-Otamegane Lentivirus auf die probeninjektion port und drücken Sie "run" auf die Cytometer.
   2. In der Dot-Plot des BV605 (405 nm) gegen SSC, die BV605 Spannung so einstellen, dass HeLa-Parkin Zellen mit dem Ausdruck Mt-Otamegane von Kontrollzellen klar abgegrenzt sind, die Mt-Otamegane (Abb. 2 b) nicht ausdrücken.
   3. In der Dot-Plot von PE-CF594 (561 nm) gegen SSC, die PE-CF594-Spannung so einstellen, dass HeLa-Parkin Zellen mit dem Ausdruck Mt-Otamegane von Kontrollzellen (Abb. 2 b) klar abgegrenzt sind.
3. Den Anteil der Zellen im Mitophagy bewerten
   1. Erwerben Sie die BV605 im Vergleich zu PE-CF594-Dot-Plot anhand einer linearen Skala. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Polygon-Symbol um die Zellen mit dem Mt-Otamegane Ausdruck, und beseitigen Sie Zellen, die nicht mit dem Ausdruck Mt-Otamegane (Abbildung 3A). Die Mt-Otamegane Fluoreszenz-positiven Zellpopulation bezeichnet man als die "Mt-Otamegane" Tor.
   2. Erstellen Sie ein weiteres Dot-Plot des BV605 im Vergleich zu PE-CF594 zeigt nur "Mt-Otamegane"-geschlossene Zellen. Zeichnen Sie in dieser Dot-Plot ein Tor um unbehandelten Mt-Tages-positiven Zellen. Die basale Mitophagy Aktivität des Steuerelements HeLa Zellen ist niedrig, und das Verhältnis der Emission bei PE-CF594/BV605 ist kleiner als 1. Somit ist dieses Tor als "niedrig" Tor bezeichnet.
   3. Zeichnen Sie ein weiteres Tor mit der oben genannten Region von "niedrig" Tor. Dieses Tor wird als "hoch" Tor bezeichnet, da es Zellen mit hohen Mitophagy Aktivität, das heißt, Zellen mit einem hohen Anteil an Emission bei PE-CF594/BV605 (Abb. 3 b enthält).
   4. Um den Prozentsatz der Zellen in der "hohen" Tor zu berechnen, wählen Sie Menü "Zeigen Bevölkerung Hierarchie". "Prozent der Wert des übergeordneten Elements" (% Elternteil) gibt den Prozentsatz der Zellen in der "hohen" Tor der Mt-Otamegane-positiven Bevölkerung.
   5. Stellen Sie mindestens 10.000 Ereignisse in das "Mt-Otamegane" stoppen Tor aufnehmen und jede Probe laufen.

Results

Ein Beispiel der Flow-zytometrie-Analyse von CCCP-induzierten Mitophagy in HeLa-Parkin Zellen ist in Abbildung 4dargestellt. Verwenden die oben beschriebene Flow Cytometry Analysemethode, erkennen wir eine dramatische Zunahme in Mitophagic Zellen im "hohen" Tor. Der Anteil der Zellen im "hohen" Tor wurde erhöht, mehr als 10-Mal im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abb. 4A). Diese Zunahme der Mitophagy Aktivität wurde dur...

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und empfindliche Methode für die Verwendung von Durchflusszytometrie, zelluläre Mitophagy Aktivität in den Zellen, die mit dem Ausdruck Mt-Otamegane zu messen. Durchläuft ein hohes Maß an Mitophagy Zellen weisen ein erhöhtes Verhältnis von PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) Erregung. So kann Mitophagy Aktivität als der Anteil der Zellen ausstellenden ein hohes Verhältnis von 561/405 ausgedrückt werden. Wir berechnen den Prozentsatz der Zellen in der Region "hohe" Tor auf einem Pu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENZIEN
poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
Penicillin/Streptomycin	Wellgene	LS202-02
PBS	Hyklon	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermoskanne wissenschaftlich	R0531
0,45 μ m Spritzenvorsatzfilter	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
Polybren	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
Puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazin (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
Trypsin-EDTA	Wellgen	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)