Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.
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Methodenartikel
Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Enterochromaffinen (EG) Zellen in der gastro-intestinale (GI) Epithel bilden die größte Subpopulation von Enteroendocrine Zellen. Als spezialisierte Sinneszellen EC-Zellen spüren luminalen Reize und wandeln sie in Serotonin (5-Hyroxytryptamine, 5-HT) Release Events. Allerdings ist die Elektrophysiologie dieser Zellen schlecht verstanden, weil sie schwer zu Kultur und zu identifizieren sind. In diesem Papier Umrisse primären EG Zellkulturen vorgestellte Methode optimiert für einzelne Zelle Elektrophysiologie. Dieses Protokoll nutzt einen transgene Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) Reporter um EG Mauszellen in primären Mischkulturen, Förderung des Ansatzes auf die Erlangung von qualitativ hochwertigen Aufnahmen der ganzen Zelle Elektrophysiologie in Spannung und Strom-Klemme Modi zu identifizieren.
Einleitung
Das gastro-intestinale (GI) Epithel ist eine vielfältige Gemeinschaft, bestehend aus mehreren Zelltypen. Enteroendocrine Zellen umfassen etwa 1 % aller epithelialen Zellen, und enterochromaffinen (EG) Zellen sind die größten Enteroendocrine Cell Bevölkerung1. Neuere Studien zeigen, dass Enteroendocrine2 und EG3,4 Zellen elektrisch erregbar sind. Wir interessieren uns für das Verständnis der primären EG Zelle Elektrophysiologie. Somit war der Zweck dieser Studie primären EG Zellkulturen für ganze Zelle Elektrophysiologie optimiert.
Best....
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Protokoll
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Mayo-Klinik genehmigt. Der Primärzelle Kultur Teil dieses Protokolls basiert auf zuvor veröffentlichten Methoden, auf die verwiesen werden können für weitere Details10. Alle experimentelle Verfahren müssen von der (IACUC) genehmigt werden, und alle Experimente müssen im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden.
1. Kultur-Vorbereitung
-
Medien.
- Bereiten Sie komplette Zellkulturmedien EG mit hoher Glucose [4500mg/L] Dulbecco geändert Eagle Mediu....
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Ergebnisse
Kulturen:
Primären murine Epithelzellen gebildet aus einem transgenen Tph1-GFP-Modell beimessen Gerichte nach 4 Stunden und sind bereit für physiologische Experimente zwischen 24 bis 72 h. Wenn Kulturbedingungen nicht optimiert wurde, bestand die Epithelzelle Kultur große Horste, schwebenden zelltrümmer, beschädigte Membranen und GFP-schwach in den EG-Zellen (Abb. 1A). Kulturen, die für Elektrophysiologie optimiert wurden .......
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Diskussion
EG-Zell-Funktion vollständig zu verstehen erfordert eine qualitativ hochwertige Primärkultur Methode, Zellen für die ganze Zelle Elektrophysiologie zu generieren. Primärkulturen von GI Epithel hatte traditionell schwierig, da niedrige überleben. Linderung dieser verwirrende Faktor, ergibt das vorliegende Verfahren Kulturen der singulären EG Zellen entweder kleiner oder großer Darm, die für mehrere Tage überleben können.
Wir fanden, dass die folgenden kritischen zur Verbesserung der Qualität de.......
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Danksagungen
Die Autoren danken Frau Lyndsay Busby für Amtshilfe und Herr Robert Highet von Mayo Clinic Division of Engineering bei Design und 3D Druck des Kultur-Gericht-Einsatzes. Diese Arbeit wurde von NIH K08 AB (DK106456), Pilot und Machbarkeit Grant an AB von Mayo Clinic Center für Zelle signalisieren in Gastroenterologie (NIH P30DK084567) und 2015 amerikanischen gastroenterologischen Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB und NIH unterstützt. R01, GF (DK52766).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 mm x 15 mm Kulturschale | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transferpipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serologische Pipette | Corning (Falcon) | ||
| 50 mL konisches | Corning (Falke) | ||
| 15 mL konisches | Corning (Falke) | ||
| 1.000 mL Barriere-Pipettenspitzen | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Steril halten |
| MatTek Glasbodenschalen | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Steril halten |
| Mikrodissektionszangen - sehr feine, extra lange Spitzen | Feine wissenschaftliche Werkzeuge | SB12630M | |
| chirurgische Scheren scharf | Nasco | 14002-14 | |
| Mikrodissektionsschere | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Nadel, 21 G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mäuse | Jackson | Lager # 028366 | Verwenden Sie männliche oder weibliche Mäuse im Alter von 4-7 Wochen |
| Microfil nichtmetallische Spritzennadeln (34 Gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laborfolie | Pechiney Kunststoffverpackung | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6 mL Spritze mit regulärer Luer-Spitze | Monoject | ||
| 3 mL Spritze mit normaler Luer-Spitze | Monoject | ||
| Elektrophysiologie Geräte | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Datenerfassungssystem (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signalkonditionierer | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Referenzen
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
