Methodenartikel

Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes

DOI:

10.3791/58117

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24. August 2018

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15th Medical Department, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2Department of Internal Medicine, Heidelberg University, 3German Center for Diabetes Research (DZD), 4European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.

Zusammenfassung

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Kultivierung von Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) in einer großen Weise auf Agarplatten kann zeitraubend und schwierig sein. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige Methode, um eine große Anzahl von Tieren für die Isolierung von Proteinen mit einem western-Blot, Massenspektrometrie oder weitere Proteomics Analysen fortfahren zu erhalten. Darüber hinaus können eine Erhöhung der Nematoden Zahlen für Immunostainings und die Integration von mehreren Analysen unter den gleichen Bedingungen Kultivierung leicht erreicht werden. Darüber hinaus wird eine Übertragung zwischen Platten mit verschiedenen experimentellen Bedingungen erleichtert. Allgemeine Techniken in der Platte Kultur beinhalten den Transfer von einem einzigen C. Elegans mit einem Platindraht und die Übertragung der besiedelten Agar Brocken mit einem Skalpell. Jedoch werden diese Techniken mit immer mehr Nematoden, allzu zeitaufwendig. Dieses Protokoll beschreibt die groß angelegte Kultur von C. Elegans einschließlich zahlreiche Schritte zur Minimierung der Auswirkungen der Probenvorbereitung auf die Physiologie des Wurms. Flüssigkeit und Schubspannung verändern können die Lebensdauer und Stoffwechselprozesse in C. Elegans, erfordern somit eine detaillierte Beschreibung der kritischen Schritte um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse abzurufen. C. Elegans ist ein Modellorganismus, bestehend aus neuronalen Zellen bis zu ein Drittel, aber fehlen Blutgefäße, wodurch die Möglichkeit, unabhängig von vaskulären Kontrolle ausschließlich neuronale Veränderungen zu untersuchen. Vor kurzem wurde Anfang Neurodegeneration bei diabetischer Retinopathie vor der vaskulären Veränderungen gefunden. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Zum Beispiel eine erhöhte Bildung von advanced Glycation Endprodukte (Alter) und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) beobachtet, die reproduzierbar in C. Eleganszu finden sind. Protokolle, Proben von ausreichender Größe für ein breiteres Spektrum an Untersuchungen zu behandeln sind hier vorgestellt am Beispiel der Studie von Diabetes-induzierte biochemische Veränderungen. In der Regel dieses Protokolls kann nützlich sein für Studien erfordern große C. Elegans Zahlen und in welcher Flüssigkultur nicht geeignet ist.

Einleitung

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Protein-Analysen, wie ein western-Blot oder Massenspektrometrie, erfordern Milligramm des Proteins. Diese Ausbeute erfordert eine großflächige Kultivierung von Hunderten von C. Elegans, die Flüssigkultur oder auf festen Medien übertragen die Nematoden durch Waschen erreicht werden kann. Flüssigkeit und Schubspannung induziert die Expression von epithelialen Natriumkanälen (ENaC), die den osmotischen Stress durch eine erhöhte Aufnahme von Natrium, möglicherweise die Lebensdauer von C. Elegans zu verändern und die Auswirkungen auf metabolische Analysen1 erhöhen könnte . Daher nehmen einige wichtige Schritte in diesem Protokoll für die Platte basierenden Ansatz die Reduzierung von Stress Auswirkungen auf experimentelle Variabilität zu berücksichtigen. Flüssigkultur, auf der anderen Seite beeinflusst den Phänotyp der Nematoden und erschwert die Kultur und die Sammlung von eine genaue Anzahl von Nematoden2. Darüber hinaus reaktiven Substanzen von Medienkomponenten veränderbar und können vor Erreichen der Nematodes ungleichmäßig verteilen. Über die Grenzen der Flüssigkultur bietet dieses Protokoll einen alternativen Ansatz zur Kultivierung großer Proben von C. Elegans.

C. Elegans ist ein Modellorganismus mit einem deutlichen Netzwerk von 302 Nervenzellen, aus denen ein Drittel aller seiner Zellen3. Seit seiner Einführung in die Wissenschaft, viele homologe und ortholog Gene wurden beschrieben, seinen Wert als Modell für die medizinische Forschung zu verstärken. Vor kurzem präsentierte Beweise für neurologische Beeinträchtigung bei diabetischer Retinopathie, vor Gefäßschädigungen,4. C. Elegans fehlt Blutgefäße, sondern enthält ein unterschiedliches neuronales Netzwerk, so dass es ein geeignetes Modell abgesehen von vaskulären, neuronale Veränderungen zu untersuchen. C. Elegans ist daher von besonderem Interesse für das Studium allgemeine Mechanismen der diabetischen Komplikationen. Biochemische Veränderungen im diabetischen Komplikationen betreffen die Bildung von Altersgruppen, die weiter die Bildung von ROS in Reaktion auf Hyperglykämie5 beeinflussen. Altersgruppen finden sich in C. Elegans und tragen zur neuronalen Schaden6. Chronische Krankheiten entstehen oft durch komplexe, Polygene Prozesse erfordern einen multiparametric Ansatz für die Bewertung ihrer zugrunde liegenden Mechanismen, wie hier bei der Bewertung von diabetischen Komplikationen. Dieses Protokoll kann der Einsatz für den Erhalt mehrerer Parameter gleichzeitig, sowie anschließend sein. Erhöhte Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit eines multiparametric Ansatzes können durch Weglassen der morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen der flüssigen und festen Medienkultur erreicht werden.

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Protokoll

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Hinweis: Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1 – 3 ist das wichtigste Protokoll zu C. Elegans auf eine groß angelegte Kultur vorgestellt. Abschnitte 4 und 5 bieten zusätzliche Protokolle für die Beurteilung der beispielhaft Metaboliten in diabetischen Metaboliten auftritt. Abschnitt 1 beschreibt im Detail eine groß angelegte Allgemeinbildung auf Tellern. Abschnitt 2 konzentriert sich auf die Übertragung von großen Mengen von C. Elegans, während Kapitel 3 erklärt die Ernte einer großen Stichprobe. Abschnitt 4 erklärt die Protein-Isolierung aus der Probe und Kapitel 5 beschreibt die Probenvorbereitung für die anschließende flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Analysen.

(1) groß angelegte Kultur auf Platten

  1. Im Allgemeinen arbeiten Sie unter sterilen Haube oder in der Nähe einer offenen Flamme, um Kontaminationen zu vermeiden.
  2. Zur Kultur Würmer bis zum jungen Erwachsenen Stadium erreichen Folgen dieser zuvor veröffentlichten Protokoll7 mit den folgenden Anpassungen.
    1. Verwenden Sie lebende OP50 Escherichia coli Bakterien zu füttern die Nematoden und Experimente 400 µM Fluorodeoxyuridine Agar (nicht Ampicillin/FUdR) vorbereiten.
    2. Verwenden Sie für die Vorbereitung einer synchronen Bevölkerung unkonzentrierte OP50, und für Experimente mit den Erwachsenen gelingt, verwenden Sie 3.3 x konzentrierte OP50 durch Entfernen von 70 % des Überstands.
    3. Tägliche Fütterung Intervalle werden empfohlen. Bei der Beurteilung von oxidativen Stress können verschiedene Intervalle und Volumina für die Fütterung die Ergebnisse beeinträchtigen.
    4. Für die Impfung einen Teller mit verschiedenen Nematoden und schneiden Sie es in Stücke von ca. 0,5 x 1 cm2 mit einem Skalpell. Übertragen Sie zwei bis drei Stücke auf Nematoden Wachstumsfugen Medien (NGM) von 60 mm Durchmesser, mit konzentriertem OP50.
    5. Inkubieren Sie die Platten bei der Temperatur für die Belastung (Wildtyp N2 sollten bei 20 ° C kultiviert werden) bis die Eier auf der Platte sichtbar werden.
    6. Die meisten Eier und ausgewachsene Tiere mit 2 mL M9 Puffer waschen Sie ab und sammeln sie in einem 15 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die Federung bei 800 X g für 2 min. Unterdessen bereiten Sie Bleichbad.
    7. Das zentrifugiert Rohr herausnehmen Sie und den M9-Puffer mit einer 10 mL pipettieren. Fügen Sie 10 mL der bleichen Lösung und Mix auf den Wirbel, bis die Erwachsenen Fadenwürmer lysiert werden. Dies dauert in der Regel ca. 5 – 7 min, aber sollte nicht länger als 15 Minuten dauern oder die Eier werden im Experiment nicht voll weiter entwickeln.
    8. Zentrifugieren Sie die Federung bei 800 X g für 2 min. Waschen 3 Mal mit 10 mL M9 Puffer um die Eier aus bleichen Lösung zu löschen.
    9. Fügen Sie jetzt 150 µL der Ei-Suspension auf OP50 Platten. Eine Dichte von 200 bis 300 Eier sollte auf jeder Platte erreicht werden. Warten Sie, bis die Nematoden die adult-Stadium erreicht.
      Hinweis: Die M9-Puffer (pH 7,0) verwendet für die dargestellten Experimente besteht aus folgenden Substanzen: 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4und 86 mM NaCl. Nach dem Autoklavieren die Mischung fügen Sie 1 mM MgSO4. Bleichbad enthält 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl in destilliertem Wasser gelöst.
    10. Bereiten Sie sterile M9 Puffer, sterilen Pipettenspitzen mit einem Schnitt Tipp, waschen Sie die Würmer und 15 mL-Tuben zu sammeln in.
    11. Etwa 1 mL der M9 Puffer auf die Platten auftragen, sanft Verteilen des Puffers durch Schwenken und sanft pipettieren der Nematodes aus der Platte.
    12. Jetzt sammeln Sie die Nematoden in die Röhre. 150 µL einer Aussetzung direkt auf die Platten (entkernt mit OP50) mit der geschnittenen Pipettenspitzen auftragen und bewerten mikroskopisch die Dichte der Nematoden (empfohlen: 50 – 100 Nematoden pro 60 mm Platte).
    13. Wenn sie zu dicht sind, verdünnen Sie das Fahrwerk mit M9 Puffer und unter dem Mikroskop zu bewerten Sie, bis die gewünschte Dichte erreicht ist. Wenn die Ausbeute zu wenig ist, lassen Sie die Würmer niederzulassen oder Zentrifugieren des Aufhängung 10 s bei 800 X g Flüssigkeit zu entfernen.
      Hinweis: Ein Beispiel für eine ausreichende Dichte ist in Figur 1A (makroskopische) und 1 b (mikroskopische) bei 20 X Vergrößerung gegeben. Fortfahren Sie empirisch wie beschrieben.
    14. Denken Sie daran, das die Würmer schnell beruhigen. Um eine gleichmäßige Verteilung zwischen den Platten zu gewährleisten, Invertieren Sie die Röhre nach jedem Stapel Platten (4 – 5 Platten).
      Hinweis: Der Schnitt pipette Tipp sowie das sanfte schwingen und Waschen der Platten, Schubspannung reduziert.

2. übertragen von großen Datenmengen Caenorhabditis elegans

  1. Waschen Sie die Nematoden mit ca. 500 µL Puffer M9, je nach Alter und Trockenheit der Platten. Mit dem gleichen Puffer, wiederholen Sie die Nematoden abnehmen, bis die meisten Tiere in der Schwebe gesammelt werden.
  2. Langsam nehmen Sie die Nematoden mit einer geschnittenen Pipettenspitze und übertragen Sie sie auf einem Teller mit OP50 vorbereitet. Lassen Sie die Platte trocken.
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig, nicht viel mehr als die empfohlene Menge anzuwenden. Vor allem in Langzeitexperimente die Platten können es nicht tolerieren und Agar kann brechen, so dass die Nematoden in die Ritzen kriechen.

(3) eine große Ernte Caenorhabditis Elegans Probe

  1. Abhängig von der gewählten Methode beginnen Sie Experimente mit einer ausreichenden Menge von C. Elegans. LC-MS/MS-Analysen Vorbereitung 20 Platten (60 mm x 15 mm) pro Gruppe mit rund 100 Nematoden pro Platte um eine Rendite von mindestens 200 µg Protein pro Probe zu gewährleisten.
    Hinweis: Dieser Teil des Protokolls erfordert keine Arbeiten unter sterilen Bedingungen nicht mehr, da die Nematoden gesammelt und eingefroren werden.
  2. Am Tag der Probenentnahme bereiten Sie Flüssigstickstoff, Snap-die gesammelten Proben Einfrieren vor. Halten Sie unsteril M9-Puffer auf dem Eis, um die Nematoden Stoffwechsel zu verlangsamen.
  3. C. Elegans von den Platten 1 mL der M9 Puffer und sanft wirbeln die Teller abwaschen. Dies vermeidet verstorbenen Nematoden und die meisten Eier sammeln, wenn es vorhanden sind, da sie die Bakterien und Agar verkleben.
  4. Nehmen Sie die Lautstärke und überträgt es auf eine 15 mL-Tube.
  5. Warten Sie nach der Sammlung von das vollständige Beispiel die Nematoden zu begleichen oder den Schlauch kurz bei 800 X g Zentrifugieren und entfernen die meisten des Puffers M9. Waschen Sie die Probe 3 X mit etwa 10 mL der M9 (10 x das Probenvolumen) um alle Bakterien zu entfernen.
    Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle verstorbene Nematoden entfernt sind, Saccharose float ist eine weitere Option. Dies war jedoch nicht geeignet für die angezeigten Experimente15. Saccharose ist in Glucose und Fructose hydrolysiert. In den dargestellten Experimenten wurde die Rolle der Glukose bewertet, biochemische Veränderungen gefunden bei chronischen Diabetes zu fördern. So konnte Saccharose float die Ergebnisse möglicherweise verwechseln.
  6. Bereiten Sie ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL der M9 Puffer und eine leere 1,5 mL Tube für jede Probe. Übertragen Sie die Tablette mit einem Glas pipettieren aus 15 mL Tube auf der leeren 1,5 mL Tube. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine quantitative Übertragung zu gewährleisten.
    Hinweis: Im Gegensatz zu hier während der vorherigen Schritte die Nematoden konzentrierter. Wegen einer möglichen Einhaltung Kunststoff pipettieren Tipps dürfte der Verlust eines großen Teils der Probe. Verwenden Sie daher stattdessen glaspipetten.
  7. Verwenden Sie nach der Übertragung die Glaspipette 1 mL der M9-Puffer von der zweiten 1,5 mL Tube aufnehmen, um die Nematoden aus der Pipette Wand zu spülen. Auch waschen Sie die restlichen Nematoden aus der 15 mL Tube und übertragen Sie sie auf das Probenröhrchen.
  8. Zentrifugieren Sie das Probenröhrchen bei 19.000 X g für 1 min und entfernen Sie so viel überstand wie möglich.
  9. Versiegeln Sie das Rohr mit Parafilm und sofort Snap-Freeze es in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie das Rohr bei-80 ° C bis lysate Vorbereitung.

(4) Protein isoliert für Massenspektrometrie

Hinweis: Die hier beschriebenen Protein-Isolation kann auch für andere Assays (z.B. western-Blot) verwendet werden.

  1. Die gefrorenen Probe fügen Sie die gleichen Volumina von 0,5 mm Zirkonoxid-Perlen und mindestens 2 x die Menge lysate Puffer mit einem Proteinase-Inhibitor-Cocktail hinzu.
    Hinweis: Die abgebildeten Nematoden-Protein-Korrelation-Analysen wurden mit 100 µL Puffer durchgeführt. LC-MS/MS-Proben wurden mit 200 µL Puffer lysiert.
  2. Starten Sie den Homogenisator für 1 min auf Geschwindigkeit 9. Stellen Sie sicher, dass die Proben vollständig lysiert werden. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn sie nicht vollständig lysiert werden.
  3. Zentrifugieren Sie die Proben für 30 min bei 4 ° C bei 19.000 X g. Übertragen Sie den überstand zu einem neuen Schlauch auf dem Eis zu und bei-80 ° C zu speichern Sie, bis weitere Messungen genommen werden sollen.
    Hinweis: Die nicht Denaturierung Puffer für die dargestellten Experimente verwendet besteht aus folgenden Substanzen: 20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1 % Triton-X und 2 mM EDTA.
    Hinweis: Er folgte den Schritten dieses Protokolls und die vorgeschlagenen Skala angewendet haben, sollte die Rendite eines Pellet-Protein von etwa 1.000 Nematoden ca. 500 µg liegen. Mehr Vergleiche finden Sie in Abbildung 2 und die Vertreter Ergebnisse.

(5) Probenvorbereitung für flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie Messungen

Hinweis: Je nach gewünschten Parameter, wird die Probenvorbereitung unterscheiden. Dieses Protokoll setzt auf Methylglyoxal und Altersbestimmung.

  1. Messen Sie intrazelluläre Methylglyoxal Derivatisierung mit 1,2-Diaminobenzene (DB) als zuvor beschriebenen9.
    1. Die Proben mit 20 µL der eiskalte 20 % (wt/Vol) Trichloressigsäure Säure in Natriumchlorid 0,9 % (wt/Vol) und 80 µL Wasser in einem 1,5 mL Röhrchen zu homogenisieren.
    2. Spike der Proben von 5 µL mit internem Standard (13C3-MG, 400 nM), durch Vortexen mischen und anschließend Zentrifugieren sie bei 21.000 X g für 5 min bei 4 ° C.
    3. Die HPLC-Probenfläschchen mit einem Glaseinsatz 200 µL übermitteln Sie 35 µL des Überstands.
    4. Jede Probe, gefolgt von 10 µL 0,5 mm DB 200 mM HCl mit 0,5 mM Diethylenetriaminepentaacetic Säure (DETAPAC) im Wasser fügen Sie 5 µL 3 % Natriumazid (wt/Vol hinzu).
    5. Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt werden.
    6. Analysieren Sie die Proben von LC-MS/MS, wie zuvor beschrieben9.
      Hinweis: Für die Messung des Alters, isolieren Sie die Proteine wie in Abschnitt 4 des Protokolls beschrieben.
  2. Messen Sie die Konzentration des Proteins von dem (aufgetauten) Lysates mit einem Bradford-Test10.
    1. Eine Standardkurve gespickt mit Rinderserumalbumin (BSA) gelöst in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) der folgenden Konzentration Aliquote von 30 µL vorbereiten: 0; 0.1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8; und 1,0 mg/dL.
      Hinweis: Wenn die Probe auf die vorgeschlagene Größe vorbereitet wurde (siehe Schritt 4.1 für die Vorbereitung der lysate mit 200 µL Puffer), die geschätzte Konzentration sollte im Bereich von ca. 2 – 7 mg/mL. In diesem Fall verdünnen Sie die Proben 01:10 mit PBS vor der Messung.
      Hinweis: Für die ersten Versuche mit dieser Methode, es empfiehlt sich, die Proben in verschiedenen Verdünnungen zu messen (1, 01:10 und 1: 100). Da gibt es keine genaue Bestimmung der Anzahl von Nematoden, kann einzelne Forscher die Ausbeute unterscheiden.
    2. Verwenden Sie eine transparente 96-Well-Platte (Polystyrol) und pipette 10 µL jeder standard Konzentration und der Proben in die gewählten Verdünnungen Duplikate in den Brunnen.
    3. Verdünnen Sie das Protein Assay Farbstoff Reagenz Konzentrat 1:5 mit destilliertem Wasser (Aq. Dest.) und jede Probe auf dem Teller 200 µL der Verdünnung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 10 min bei Raumtemperatur.
    4. Messen Sie die Absorption innerhalb von 30 min bei 595 nm mit einem Teller-Lesegerät. Die Proben können von der berechneten Standardkurve interpoliert werden. Weitere Einzelheiten des Verfahrens wurden in der Literatur10ausführlich beschrieben.
  3. Maßnahme im intrazellulären Alter wie oben beschrieben11,12.
    1. Waschen Sie die Gesamt-Protein-Extrakte (ca. 200 µg) 3 X mit Wasser durch Ultrazentrifugation in 10 kDa zentrifugale Filtereinheiten.
    2. Das wiederhergestellte Protein (ca. 100 µL) 10 µL 100 mm HCl und Pepsin (2 mg/mL in 20 mM HCl) 10 µL 10 µL von Thymol (2 mg/mL in 20 mM HCl) hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 24 h.
    3. Neutralisieren und Puffern die Proben bei pH 7,4 durch Zugabe von 12,5 µL 0,5 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,4) und 5 µL von 260 mM KOH.
    4. Fügen Sie 10 µL Pronase E [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)] und 10 µL einer Lösung Penicillin-Streptomycin und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 24 h.
    5. Fügen Sie 10 µL Aminopeptidase [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)] und Prolidase [2 mg/mL in 10 mM-Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,4)], 10 µL und inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 48 h.
    6. Analysieren Sie die resultierende Hydrolysat von LC-MS/MS, wie zuvor beschrieben12.

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Ergebnisse

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Hier Kultur Beispiele der Schaffung eines groß angelegten C. Elegans für Anwendungen in der Diabetes-Forschung präsentiert werden. Es ist von Interesse, die Parameter beziehen sich auf ein einziges Tier, anstatt auf die Gesamt-Protein-Konzentration zu normalisieren. In einer Probe, eine kleine Anzahl von Nematoden erfordert kann dies leicht durch zählen der Nematodes erfolgen. Für eine groß angelegte C. Elegans Kultur mit Hunderten von Nematoden pro Versuchsgruppe, diese...

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Diskussion

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Dieses Protokoll stellt einen zuverlässige Ansatz für die großflächige Kultivierung von C. Elegans , quantitative Ergebnisse zu erzielen. Erkenntnisse aus der Literatur konnte repliziert werden, wie in den Vertreter Ergebnissegezeigt. Obwohl dieses Protokoll für die Sammlung von großen Proben von C. Elegans wie eine unkomplizierte Methode scheint, gibt es einige Fallstricke zu berücksichtigen. Über die Synchronisation der Nematoden Bevölkerung beschreibt dieses Protokoll einen Ansatz du...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen des KOLLEGS 1874 "Diabetische mikrovaskulärer Komplikationen" und CRC 1118 "Reaktive Metaboliten als Ursache für diabetischen Spätkomplikationen". C. Elegans Stämme N2 und CL2166 lieferte der CGC, die durch das NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440) finanziert wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
E. coli OP50CGCn/a
C. elegans N2CGCn/a
C. elegans CL2166CGCn/a
Petrischale, 60 mm x 15 mmGreiner One628161
Volumetrische Pipette, Glas, 10 mLNeolabE-0413
Proteinase Inhibitor-Cocktail-TablettenRoche04693124001
Nicht denaturierender Lysatpuffer:
Tris-HCl, pH 8SigmaT3253
Natriumchlorid (NaCl)SigmaS7653
Triton X-100SigmaX-100
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)SigmaE5391
96-Well-Platten, transparenter BodenMarke781611
Infinite M200, PlattenleserTecan30017581
Zirkonoxid-Perlen, 0,5 mmNächster FortschrittZROB05-RNA
Bullet Mixer, Homogenisator NächsterFortschrittBBX24
Pepsin aus der Magenschleimhaut des SchweinsSigmaP6887
ThymolSigmaT0501
Pronase E/ Protease aus Streptomyces griseus SigmaP6911
Penicillin-Streptomycin-LösungSigmaP43339
Prolidase aus SchweineniereSigmaP6675
Aminopeptidase aus Aeromonas proteolyticaSigmaA8200
Amicon Ultra-0.5 ZentrifugalfiltereinheitMerckmilliporeUFC501096
Grundmaterialien für die Plattenkultur sind in der Referenz 6 beschrieben.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
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C elegans Kultivierungplattenbasierte KultivierungNematodenisolationProteinertragsanalyseWestern BlotMassenspektrometrieReduktion der ScherspannungEinfrieren in fl ssigem StickstoffDiabetes ForschungsmodellStudie zu metabolischen Ver nderungen

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