Methodenartikel

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

DOI:

10.3791/58157

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17. Juli 2018

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1Cellular Imaging Group, Wellcome Centre Human Genetics, University of Oxford, 2Division of Structural Biology, Wellcome Centre Human Genetics, University of Oxford, 3Dynamic Structural Virology Group, Biocruces Health Research Centre, 4IKERBASQUE, Basque Foundation for Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Zusammenfassung

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Anzahl und Helligkeit ist eine Kalibrierung-freie Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie (FFS) Technik zum Nachweis von Protein Homo-Oligomerisierung. Es kann eingesetzt werden, mit einem herkömmlichen confocal Mikroskop mit digitaler Detektoren ausgestattet. Ein Protokoll für den Einsatz von Technik in Vitro wird mittels einem Use Case gezeigt wo Zahl und Helligkeit zu genau den Oligomeren Stand der mVenus versehenen FKBP12F36V vor und nach der Zugabe der dimerizing Droge AP20187 quantifizieren gesehen werden kann. Die Bedeutung der Verwendung der richtigen Mikroskop Aufnahmeparameter und die korrekten Daten-Vorverarbeitung und Analyse-Methoden werden diskutiert. Insbesondere wird die Bedeutung der Wahl der Immunofluoreszenz Korrektur betont. Diese kostengünstige Methode kann verwendet werden, um Protein-Protein-Interaktionen in vielen biologischen zusammenhängen zu studieren.

Einleitung

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Protein-Protein Interaktionen ich n-vitro-

Traditionell sind die Kristallographie und Kernspinresonanz-Experimenten mit Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) kombiniert die Technologien entschieden, genau zu beschreiben, die dreidimensionale Architektur der Proteine und ihre Funktion durch Ableiten hinterfragen ihre hochauflösende strukturelle Details. Proteine, jedoch sind keine statischen Strukturen und können eine Vielzahl von Konformationsänderungen und Schwingungen in Zeit und Raum zu unterziehen. Deshalb ist die strukturelle Informationen aus kristallographischen oder CryoEM Daten müs....

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Protokoll

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(1) FKBP12 F36V - mVenus Reinigung

  1. Transformieren Sie (DE3) pLysS Zellen mit pET22b Vektor, monomerized menschlichen FKBP12F36V12 und N-terminale His6 und mVenus-Tags (Vektor auf Anfrage erhältlich) enthält. Platte Zellen auf LB-Agar mit 50 µg/mL Ampicillin und 34 µg/mL Chloramphenicol ergänzt.
  2. Transformierte Kolonien in 100 mL LB Starterkultur und wachsen für 16-20 Stunden bei 37 ° C mit schütteln.
  3. Verdünnen Sie dichten Starterkultur (OD600 > (1) 1: 100 in LB-Medium (2 x 500 mL Chargen) und wachsen für 2-3 Stunden zu OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 u/min).
  4. Cool Kulturen auf Eis. Mit 250 µM IPTG induzieren....

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Ergebnisse

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Detrending und Monomeren Helligkeit

Sobald die Daten erhalten hat, kann man die Helligkeit Berechnungen durch, um festzustellen, die Oligomeren Zustand des Proteins des Interesses in der Lösung starten. Auch wenn die Wirkung der Bleiche in Lösung möglicherweise nicht so drastisch wie es sein kann, in Vivo, die Intensität-Ablaufverfolgung wird wahrscheinlich noch nicht stationäre bedeuten, möglicherweise.......

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Diskussion

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N & B ist eine Technik, um Multimerization mit kommerziellen Licht Scannen konfokale Mikroskopen ausgestattet mit digitaler Detektoren erkennen. Dieser Ansatz ist sehr attraktiv im Vergleich zu single Point FCS, FCC und SmFRET weil es kostenlose Kalibrierung und die Berechnung der Helligkeit ist unkompliziert und Konzentration unabhängigen6. Es ist von großer Bedeutung, jedoch für Bleichen und langfristige intensitätsschwankungen zu korrigieren, bevor Sie Helligkeit Berechnungen9.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von Wellcome Trust unterstützt gewähren R.N 105278/Z/14/2 Der Wellcome Trust Centre for Human Genetics wird vom Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2 finanziert. Arbeit in der c.s.-Gruppe wird von Cancer Research UK (C20724/A14414) und des European Research Council unter Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm Grant 647278 der Europäischen Union unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RosettaTM (DE3) pLysS-ZellenNovagen70956-3
AmpicillinSigma AldrichPubChem Substanz-ID 329824407
ChloramphenicolSigma AldrichPubChem Substanz-ID: 24892250
LB StarterkulturQIAGEN
LB mediumQIAGEN
IPTGSigma AldrichPubChem Substance ID 329815691
IMAC-PufferMedicago09-1010-10
EDTA-freie Proteasehemmer Sigma Aldrich11873580001
TALON-HarzClonetech
Nickel-SepharoseGE Healthcare
S200 16/60 SäuleGE Healthcare Healthcare
Glasboden 8-Well-BeobachtungsschaleIbidi80827
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif

Referenzen

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  1. Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
  2. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Analyse der Anzahl und HelligkeitKonfokalmikroskopieFluoreszenzfluktuationsspektroskopieProteinreinigungPhotobleaching KorrekturFKBP12 mVenusDimerisierungsmedikament AP20187kalibrierungsfreie Quantifizierung

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