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Methodenartikel

Vorbereitung einer 68Ga-Label Arginin Glycin Aspartat-(RGD)-Peptid für Angiogenese

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DOI:

10.3791/58218

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7. Januar 2019

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1Division of Applied RI, Korea Institute of Radiological and Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die αvβ3 Integrin ist eine Art von Adhäsion Protein, das hoch auf aktivierten Endothelzellen in der Angiogenese exprimiert wird. Beurteilung der Integritätdes der Integrin ist daher von großem Interesse in der Onkologie. Hier stellen wir eine Methode um 68Ga-markierten Radiopeptides vorzubereiten und eine Methode zur Beurteilung ihrer biologischen Wirksamkeit.

Zusammenfassung

Die αvβ3 Integrin ist ein heterodimerisierenden Adhäsionsmolekül Tumor Zellwanderung und Angiogenese beteiligt. Das Integrin ist in angiogenen Tumor Endothelzellen, überexprimiert, wo es in der Regel eine geringe Konzentration hat. Diese Konkretisierung der αvβ3 macht es einen gültigen Biomarker für Anti-angiogenetische und bildgebenden Drogen. Als funktionelle bildgebende Modalität bietet Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Informationen über biochemische und physiologische in Vivo, wegen seiner einzigartigen hohe Empfindlichkeit im nanomolaren Maßstab ändern. Radiometal-basierte PET-Radiopharmaka haben daher großen Aufmerksamkeit für die nichtinvasive Quantifizierung von Tumor-Angiogenese erhielt. Dieses Dokument enthält eine systemische Protokoll um eine neue Radiometal-mit der Bezeichnung Peptid für die Bewertung der Angiogenese vorzubereiten. Dieses Protokoll enthält Informationen über radiochemische Zuverlässigkeit, Lipophilie Zelle Aufnahme, Serum Stabilität und pharmakokinetischen Eigenschaften. 68Ga-RGD-Peptid ist eines der repräsentativen PET Liganden in Richtung αvβ3 Integrin. Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung einer 68Ga-RGD-Peptid und die Bewertung der biologischen Wirksamkeit.

Einleitung

Angiogenese ist ein biologischer Prozess, der durch die Entwicklung neuer Blutgefäße gekennzeichnet ist. Neben vielen angiogenetischer Faktoren αvβ3 Integrin Invasivität, zugeordnet ist, weil der Integrin wird hoch in angiogenen Tumor Schiffe jedoch fehlt im Normalgewebe1.

Radioaktiven Rezeptorbindung Peptide mit Arginin Glycin Aspartat-(RGD) Domäne, die eine hohe Affinität in Richtung αvβ3 Integrin Rezeptoren hat, gelten als vielversprechende Angiogenese imaging Agents2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. verschiedene Radiopharmaka für PET erstellt wurden und seine biologischen Eigenschaften in verschiedenen Tiermodellen8,9,10,11validiert wurden. Im Sinne eines Radionuklids hat 68Ga mehrere Vorteile gegenüber anderen Radioisotopen. Erstens, es hat eine hohe Zugänglichkeit für die Nutzer und wirtschaftlich vorteilhaft ist, da ein Zyklotron nicht erforderlich ist. Zweitens, 68Ga-basierte Radiopharmaka produzieren hohe räumliche Auflösung im Vergleich zu Single-Photon berechnet Emissionstomographie (SPECT), so dass eine genauere Quantifizierung. Zu guter Letzt kann die 67,71 Minuten Halbwertszeit von 68Ga für die Vorbereitung der kleine Peptide oder Proteine ausreichen.

Um einen stabilen Komplex mit 68Ga zu erzeugen, wurden viele Chelatoren entwickelt. Repräsentative Chelatoren sind 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecanetetraacetic Säure (TETA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-Tetraacetic Säure (DOTA), 1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-Triacetic Säure (NOTA), diethylenetriaminepentaacetic Säure (DTPA) und N, N'-di(2-hydroxybenzyl) Ethylenediamine-N, N'-Diacetic Säure (HBED). NOTA zu einem äußerst stabilen Komplex mit 68Ga (Log Stabilität konstanten 30.98)12,13,14berichtet worden.

Der Zweck der vorliegenden Studie soll eine prägnante Protokoll für die Entwicklung eines neuen Radiopeptide (Abbildung 1). Als Beispiel erstellen wir 68Ga-Label RGD-Peptide und gegenwärtigen Methoden für die biologische Bewertung von diesen Analoga in einem Xenograft-Modell.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden unter Protokolle vom Korea Institute der radiologischen und medizinische Wissenschaften Animal Studies Committee genehmigt in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Reagenzien und Lösungsmitteln wurden gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. NOTA-RGD-Peptide wurden laut Literatur Methoden15vorbereitet.

Achtung: 68Ga sendet Positronen und Gamma-Strahlen. Alle Experimente, einschließlich der direkten oder indirekten Kontakt mit radioaktiven Stoffen müssen durch ausgebildet und gestattet nur Personal erfolgen. Beim Umgang mit radioaktiver Stoffen sollte angemessene Schutzausrüstung, Abschirmung, Strahlung Dosimeter Abzeichen und Ringe und einen Umfrage-Meter verwendet werden.

(1) enzymatische RGD-Peptide mit 68GaCl3

Hinweis: 68Ga (t1/2 = 68 min, β+ = 89 % und EC = 11 %) wurde von den 68Ga erhalten /68Ge Generator.

  1. Eluieren Sie die 68GaCl3 aus dem Generator mit 4 mL 0,05 M HCl.
  2. Spülen Sie mit Stickstoffgas bei 80 ° C für 30 min trocknen 68GaCl3 (333 kBq, 1 mL) in einer 5 mL Reaktion Phiole.
  3. Fügen Sie eine RGD-Peptid-Lösung (100 µg) in 1 M Natriumacetat (100 µL, pH 5-6), die Reaktion Fläschchen mit 68GaCl3 aus Schritt 1.2.
  4. Erhitzen Sie die Reaktionsmischung bei 80 ° C für 5 min. Kühlen Sie auf Raumtemperatur ab.
  5. Reinigen Sie das Rohprodukt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Verwenden Sie das folgende System: eine C-18 Spalte, einen Durchfluss von 0,5 mL/min, eine gradient Steigung von Acetonitril (5 % - 40 % in 30 min), 1.17%/min und Elution Komponenten: A = 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Acetonitril, B = 0,1 % TFA in Wasser.
    Hinweis: Der HPLC ist mit einer Photodiode Array Detektor und eine Radioaktivität-Detektor ausgestattet. Die 68Ga-RGD-Peptid wurde bei einer Retentionszeit von 12,5 min (Abbildung 2) gesammelt.
  6. Die daraus resultierende 68Ga-RGD-Peptid mit einem Festphasen-Extraktion System zu reinigen.
    1. Übergeben Sie die Lösung durch eine C18-Reverse-Phase-Patrone und waschen mit 2 mL Kochsalzlösung.
    2. Eluieren Sie 68Ga-RGD-Peptid mit 0,7 mL 95 % Ethanol. Entfernen Sie das Lösungsmittel bei 80 ° C unter Stickstoff-Gas für 20 min und rekonstruieren mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor dem Gebrauch.
    3. Die radioaktiven Produkt durch einen Sterilfilter 0,22 µm filtern und in 1 mL steriler Kochsalzlösung zu formulieren.
  7. Überprüfen Sie die radiochemische Ausbeute von Radio-Dünnschichtchromatographie (TLC).
    1. Spot 1 µL auf eine sofortige Dünnschicht Chromatographie Platte (ITLC, 10 cm lang). Entwickeln Sie die Platte in eine Kammer mit Laufmittel (wässrige 0.1 M Zitronensäure, pH 5,0) bis 9 cm entfernt von der Stelle.
      Hinweis: Der Aufbewahrung Faktor für 68Ga-RGD-Peptid ist 0 und des Aufbewahrung Faktors für nicht umgesetztes 68Ga3 + 1.
  8. Berechnen Sie die endgültige spezifische Aktivität aus dem Verhältnis der Radioaktivität, die nicht-Radioaktivität als MBq/Nmol entspricht.
    Hinweis: Nach der Injektion von 100 µL der formulierten 68Ga-RGD-Peptid, HPLC, war die Menge nicht-radioaktiven Komponente aus der Standardkalibrierung Kurve mit nicht radioaktiven Ga-RGD-Peptid berechnet.

2. in-vitro- zelluläre Aufnahme

Hinweis: Uppsala 87 malignem Gliom (U87MG) menschlichen Glioblastom-Zellen wurden in Dulbeccos modifizierten Adler Medien (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin angebaut. Zellen wurden in 150 mm Schalen bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre des 5 % CO2angebaut. Zellen wurden geerntet oder Teilen von Trypsinization: 0,25 % (w/V) Trypsin und 0,02 % (w/V) Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) mit PBS-Puffer bei 37 ° C für ca. 3-5 Minuten.

  1. U87MG Samenzellen in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/gut.
  2. Inkubation der Zellen mit 68Ga-RGD-Peptid (111 kBq) bei 37 ° C für 30, 60, 90 und 120 min. Vorbereitung Proben in dreifacher Ausfertigung.
  3. Waschen Sie die Zellen 2 X mit 2 mL PBS und Ernte von Trypsinization. Verwenden Sie 0,25 % (w/V) Trypsin und 0,02 % (w/V) Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) mit PBS-Puffer bei 37 ° C für 3-5 Minuten.
  4. Sammeln Sie die Zellsuspension (500 µL) und Maßnahme in einem γ-Zähler.
  5. Berechnen Sie die prozentuale Aufnahme der Verbindung durch die Zellen durch % (zählt in Zellen/Gesamt zählt).

3. in-vitro- Serum-Stabilität

  1. Hinzufügen von 500 µL frisch zubereitete Maus Serum, 500 µL Humanserum und 500 µL PBS. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 2 h.
  2. Bewerten von ITLC in den vorgeschriebenen Zeitintervallen (30, 60, 90 und 120 min.). Vor Ort 1-2 µL Aliquot der Mischung auf die ITLC Platte (mobile Phase: 0.1 M Zitronensäure). Entwickeln Sie die Platte wie in Schritt 1,7.
    Hinweis: 68Ga3 + wird voraussichtlich mit Lösungsmittel vorne bewegen während die beschriftete Verbindung am Ursprung bleiben.

4. Bestimmung der Lipophilie

  1. Das Octanol-PBS-System 68Ga-RGD-Peptid (3,7 MBq, 3,7 µL) hinzufügen (1:1, V/V, total 1 mL).
  2. Mischen Sie die Fläschchen kräftig für 5 min bei Raumtemperatur und Zentrifuge bei 10.000 X g für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. Jede Schicht entnehmen Sie 100 µL Proben und Messen Sie die Radioaktivität mit einem γ-Zähler. Die gemeldeten Log P-Wert basiert auf dem Durchschnitt der drei Proben.

(5) Tumor-Modell

Hinweis: BALB/c nackten Mäusen (6-8 Wochen alt, Weiblich, n = 23) wurden für diese Studie verwendet. Die Mäuse wurden anschließend verwendet für PET-Studien (n = 3) und Bioverteilung (n = 20) wenn der Tumor-Volumen erreicht 200-300 mm3 (1-2 Wochen nach der Implantation).

  1. Laden Sie Tumorzellen in 28 G, 1/2 Zoll Insulinspritzen.
  2. Injizieren Sie U87MG Zellen (5 x 106) in den linken Arm-Region in 100 µL PBS.
  3. Die Maus mit 2 % Isofluran in Sauerstoffgas während Zelle Injektion zu betäuben.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Maus durch den Verlust der Pedal Rückzug reflex folgende kneifen mit der Pinzette zwischen die Zehen des rechten Hinterfuß betäubt worden ist. Nicht unbeaufsichtigt lassen ein Tier bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.

6. in Vivo Quantifizierung von αvβ3 Integrin mittels PET

  1. Die Mäuse mit 2 % Isofluran in Sauerstoff zu betäuben.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Maus durch den Verlust der Pedal Rückzug reflex folgende kneifen mit der Pinzette zwischen die Zehen des rechten Hinterfuß betäubt worden ist. Nicht unbeaufsichtigt lassen ein Tier bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.
  2. Legen Sie den Kopf in der Mitte von der PET-Gantry.
  3. Verabreichen Sie die 68Ga-RGD-Peptid-Lösung (7,4 MBq, 200 µL) an der Xenograft Maus Modell über die Rute Vene für 1 min intravenös.
  4. Zur gleichen Zeit führen Sie einen PET-Scan im Listenmodus (dynamische Scan) für 150 min aus.
    Hinweis: Die PET-Rohdaten wurden durch einen frei definierbaren Zeitraum (d. h., alle 30 min.) wieder aufgebaut. Nach der PET-Scan, ein Mikro-Computertomographie (CT)-Scan (50 "KVP" x-ray, 0,16 mA) wurde für Schwächungskorrektur durchgeführt.

7. Ex Vivo Bioverteilung

  1. Injizieren Sie 68Ga-RGD-Peptid (0,37 MBq, 200 µL) in die Vene der Schweif von Xenograft-Maus-Modell. Die Maus mit 2 % Isofluran in Sauerstoffgas während der Injektionen zu betäuben.
    Hinweis: Nackte Mäusen BALB/c, wie in Abschnitt 5 beschrieben wurden in vier Gruppen eingeteilt und zu verschiedenen Zeitpunkten geopfert (n = 5 pro Gruppe).
  2. Wachen Sie die Mäuse sofort nach der Verabreichung von 68Ga-RGD-Peptid und bei 30, 60, 90 und 120 min. Steroidtherapie mit Kohlendioxid Euthanasie zu opfern.
    Hinweis: Das Gewebe des Interesses wurden extrahiert. Ausgewählte Ziele waren Blut, Muskeln, Herz, Lunge, Leber, Milz, Magen, Darm, Nieren, Knochen und Tumor.
  3. Wiegen Sie das Gewebe und Messen Sie die Radioaktivität mit einem γ-Zähler.
    Hinweis: Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz injizierte Dosis pro Gramm Gewebe (% ID/g) ausgedrückt.

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Ergebnisse

Das Chelat von 68GaCl3 mit der NOTA-RGD-Peptid war einfach, und die radiolabeling Ausbeute betrug 99 %. Reaktion Verunreinigungen wurden erfolgreich entfernt, wie in Abbildung 2dargestellt. Die radiochemische Reinheit von 68Ga-RGD-Peptid war größer als 99 %, und spezifische Aktivität am Ende der Synthese war 90-130 MBq/Nmol (Abbildung 3).

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Diskussion

In der vorliegenden Studie, wir eingeführt, ein Protokoll, um eine Radiopeptide Ausrichtung αvβ3 Integrin und seine biologische Bewertung vorzubereiten. Traditionelle Arzneimittel-Entwicklung beinhaltet ein kompliziertes Verfahren. Es erfordert eine große Menge an Referenzmaterial und eine relativ lange Bewertung Zeit. Obwohl die vorgeschlagenen Methodik der zarten Evaluierungsprozess nicht ersetzen kann, kann dieses System zu screening-Zwecken verwendet werden. Diese vorgeschlagene System erheblich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von einem Nuclear Research und Development Program des National Research Foundation of Korea (NRF) Zuschusses gefördert durch die koreanische Regierung (Nr. 2017M2A2A6A02019904) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
68Ga/68Ge GeneratorITGCompany-10mCi 
ChlorwasserstofflösungSigma-aldrich84429
NatriumacetatSigma-aldrichS2889
C18 UmkehrphasenkartuscheWasserWAT020515
0,22-μmu; m SterilfilterMillliporeSLGV033RS
Radio-TLC-ScannerBioscanAR2000
ITLC-PapierAgilentSGI001
ZitronensäureSigma-aldrich251275
HPLC Waters-Waters1525 System bestehend aus binärer Pumpe, Fotodiodenarray (Waters 2998), Radioaktivitätsdetektor (Raytest, Gabi)
AcetonitrilJ.T. Baker14-650-359
TrifluoressigsäureSigma-aldrich302031
modifizierten Eagle-Medien von Dulbecco Thermo FisherScientific 11965092
fötales RinderserumThermo Fisher Scientific16000044
T175 Kolben CorningCLS431080
Trypsin-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200072
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15240112
Γ-ZählerPerkinWizard 3
Insunlin SpritzeBecton Dickinson326105
SpritzenpumpeHarvard Apparatur70-4500
Mikro-PET/CTSiemens Inveon-
Elmer-1480

Referenzen

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