Methodenartikel

Neurogenese mit P19 Embryonalkarzinomzellen

DOI:

10.3791/58225

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27. April 2019

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1Department of Experimental Embryology, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences, 2Department of Regenerative Medicine, Maria Skłodowska-Curie Institute - Oncology Center, 3Department of Genomics and Biodiversities, Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die p19 Maus embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) ist weit verbreitet für die Untersuchung des molekularen Mechanismus der Neurogenese mit großer Vereinfachung im Vergleich zur In-vivo-Analyse verwendet. Hier stellen wir ein Protokoll zur Retinosäure-induzierten Neurogenese in der P19-Zelllinie vor.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die P19-Zelllinie, die von einem von Einem Mausembryon abgeleiteten Teratokarzinom abgeleitet wurde, hat die Fähigkeit, sich in die drei Keimschichten zu differenzieren. In Gegenwart von Retinsäure (RA) wird die suspensionskultivierte P19-Zelllinie induziert, um sich in Neuronen zu differenzieren. Dieses Phänomen wird als Neurogenese-Modell in vitro ausgiebig untersucht. Daher ist die P19-Zelllinie sehr nützlich für molekulare und zelluläre Studien im Zusammenhang mit Neurogenese. Protokolle zur neuronalen Differenzierung der in der Literatur beschriebenen P19-Zelllinie sind jedoch sehr komplex. Die in dieser Studie entwickelte Methode ist einfach und wird eine Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen spielen.

Einleitung

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Während der embryonalen Entwicklung wird eine einzellige Schicht in drei separate Keimschichten1,2,3umgewandelt. Um die Forschungsmöglichkeiten von Phänomenen zu erhöhen, die in vivo vorkommen, wurde die Erzeugung dreidimensionaler Aggregate (embryonale Körper) als praktisches Modell entwickelt. Zellaggregate, die auf diese Weise gebildet werden, können verschiedenen Bedingungen ausgesetzt werden, die eine Zelldifferenzierung verursachen, die die Entwicklung des Embryos4,5widerspiegeln. Die p19 murinische embryonale Karzinom-Zelllinie (P19-Zelllinie) wird häufig als zelluläres Modell für Neurogenese-Studien in vitro6,7,8verwendet. Die P19-Zelllinie weist typische pluripotente Stammzellmerkmale auf und kann sich in Gegenwart von Retinsäure (RA) während der Zellaggregation in Neuronen differenzieren, gefolgt von Neuritenwachstum unter anhaftenden Bedingungen. Darüber hinaus ist die undifferenzierte P19-Zelllinie auch in der Lage, unter dem Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO)9,10,11,12muskel- und kardiomyozytenähnliche Zellen zu bilden.

Viele Methoden13,14,15,16 wurden für die neuronale Differenzierung berichtet, aber die Methodik ist manchmal kompliziert und nicht leicht zu erfassen, indem man nur die Beschreibungen liest. Beispielsweise erfordern Protokolle manchmal eine Kombination aus Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medium, ergänzt durch eine Mischung aus Kalbsserum (CS) und fetalem Rinderserum (FBS)13. Darüber hinaus, Medien für die neuronale Entwicklung verwendet werden oft aus neurobasalen und B27 Ergänzungen13,14,15,16. Daher enthalten bestehende Methoden Komplexität in ihrer Vorbereitung und unser Ziel ist es, die Protokolle zu vereinfachen. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass DMEM mit FBS zur Aufrechterhaltung der P19-Zelllinie (DMEM + 10% FBS) sowie zur neuronalen Entwicklung (DMEM + 5% FBS + RA) eingesetzt werden kann. Diese vereinfachte Methode für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie ermöglicht es uns, den molekularen Mechanismus zu untersuchen, wie Neuronen entwickelt werden. Darüber hinaus wird die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit auch mit P19-Zelllinie17,18durchgeführt, und wir glauben, dass die in dieser Studie entwickelte Methode eine Rolle bei der Aufklärung der molekulare Mechanismen bei neuroentwicklungsbedingten Anomalien und neurodegenerativen Erkrankungen.

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Protokoll

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1. Kulturpflege

  1. Kultur der P19-Zelllinie im Wartungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4.500 mg/L Glukose, ergänzt durch 10% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin). Bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.

2. Unterkultivierungszellen

  1. Wenn Zellen etwa 80 % Zusammenfluss erreichen, entfernen Sie das verbrauchte Medium aus den Zellkulturkolben (Oberfläche 25 cm2).
  2. Waschen Sie die Zellen mit 2 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) frei von Kalzium und Magnesium.
  3. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) auf die Zellmonoschicht geben.
  4. Legen Sie den Kolben 2-3 min in den CO2-Inkubator (37 °C und 5% CO2).
  5. Bewerten Sie die Zellbefestigung an der Kolbenoberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle Zellen getrennt und im Medium schwebend sind.
  6. Fügen Sie 9 ml Wartungsmedium hinzu, um die enzymatische Aktivität von Trypsin zu stoppen.
  7. Setzen Sie die Zellen in Maintenance Medium wieder aus.
  8. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 200 x g und Raumtemperatur (RT).
  9. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml frisches Wartungsmedium in das 15 ml-Rohr ein.
  10. Verwenden Sie die Zellsuspension, um die Zellnummer anhand eines Zellzählers gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
  11. Samenzellen bei 2 x 104 Zellen/cm2 in einem neuen 25 cm2 Kolben.
  12. Fügen Sie das Wartungsmedium bis zu 10 ml hinzu.
  13. Legen Sie den Kolben mit Zellen in den CO2-Inkubator (37 °C und 5% CO2 ) für 2-3 Tage.

3. Trypsin Verdauung

  1. Aspirate Maintenance Medium aus dem Zellkolben. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2 ml Calcium und Magnesium-freiem PBS.
  2. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen.
  3. Den Kolben mit Zellen bei 37 °C für 2-3 min in den CO2-Inkubator stellen.
  4. Verwenden Sie 1 ml Pipette, um die Zellen durch zehnfache Pipettierzellen zu dissoziieren.
  5. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 9 ml Differenzierungsmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4500 mg/L Glukose, ergänzt durch 5% FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 Einheiten/ml Streptomycin) ohne RA zu den Zellen hinzufügen.
  6. Übertragen Sie Zellen für 5 min bei 200 x g und RT in ein 15 ml-Rohr und eine Zentrifuge.
  7. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml Differenzierungsmedium ohne Retinsäure (RA) hinzu. Setzen Sie das Zellpellet wieder auf.
  8. Verwenden Sie die Zellsuspension, um die Zellnummer mithilfe eines Zellzählers gemäß der Anweisung des Herstellers zu bestimmen.

4. Aggregaterzeugung

  1. Fügen Sie 5 l RA (1 mM In 99,8% Ethanol gelöst, bei -20 °C gelagert) zu den 10 ml Differenzierungsmedium hinzu und mischen Sie gut (Endkonzentration von 0,5 m RA).
    HINWEIS: RA ist lichtempfindlich. Eine niedrige Konzentration von EtOH hat keinen Einfluss auf die Zelldifferenzierung19,20,21.
  2. Fügen Sie 10 ml Differenzierungsmedium (mit RA) in das 100 mm unbehandelte Kulturgericht (für Diefederkultur) ein.
  3. Säen Sie die 1 x 106 Zellen in der 100 mm Schale (Dish Oberfläche 56,5 cm2).
  4. Setzen Sie den Kolben mit Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für 2 Tage in den Inkubator, um die Bildung von Aggregaten zu fördern.
  5. Tauschen Sie nach 2 Tagen das Differenzierungsmedium aus. Aspiratmittel, das Aggregate mit einer 10 ml Pipette enthält und bei RT in ein 15 ml-Rohr überträgt.
  6. Lassen Sie die Aggregate durch Schwerkraft für 1,5 min bei RT abgleichen.
  7. Entsorgen Sie den Überstand.
  8. Fügen Sie eine frische 10 ml Differenzierungsmedium mit 0,5 m RA mit einer 10 ml serologischen Pipette.
    ACHTUNG: Pipette die Zellaggregate nicht nach oben und unten.
  9. Säen Sie die Aggregate in neue 100 mm unbehandelte Kulturschale (für Suspensionskultur).
  10. Legen Sie die Platte 2 Tage lang in den Inkubator (bei 37 °C und 5% CO2).

5. Aggregate Dissoziation

  1. Aspirieren Sie die Zellaggregate mit einer 10 ml Pipette.
  2. Übertragen Sie die Aggregate in ein 15 ml Rohr. Lassen Sie die Zellaggregate durch Schwerkraft für 1,5 min abgleichen.
  3. Entfernen Sie den Überstand.
  4. Waschen Sie die Aggregate allein mit DMEM (serum- und antibiotikafrei).
  5. Lassen Sie die Zellaggregate durch Gravitationssedimentation für 1,5 min bei RT absetzen.
  6. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Trypsin-EDTA (0,25%).
  7. Legen Sie die Zellaggregate 10 min in ein Wasserbad (37 °C). Rühren Sie die Aggregate alle 2 min vorsichtig, indem Sie mit einer Hand tippen.
  8. Beenden Sie den Trypsinisierungsprozess, indem Sie 4 ml Wartungsmedium hinzufügen.
  9. Pipette aggregiert 20 Mal mit 1 ml Pipette nach oben und unten.
  10. Zentrifugenzellen für 5 min bei 200 x g und RT.
  11. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 5 ml Wartungsmedium wieder auf.
  12. Bestimmen Sie die Zellennummer mit einem Zellenzähler.

6. Plattieren von Zellen

  1. Fügen Sie 3 ml pro Bohrgut von Maintenance Medium zu einer 6-Well-Platte hinzu.
  2. Samenzellen in der 6-Well-Kulturplatte mit einer Dichte von 0,5 x 106/well.
  3. Bei 37 °C mit 5% CO2-Konzentration inkubieren.
  4. Säen Sie die Zellen auf Deckglas in 6 Brunnenkulturplatte und führen Sie Immunfärbung mit Anti-MAP2-Antikörper (20% Zusammenfluss). Verwenden Sie 6-Well-Platte, um RNA zu isolieren und RT-PCR für Map2, NeuN, Oct4, Nanogund Gapdh (20% Zusammenfluss) durchzuführen.

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Ergebnisse

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Das vereinfachte Schema des Protokolls für die Neurogenese-Induktion in Der P19-Zelllinie ist in Abbildung 1dargestellt. Um den Charakter der P19-Zelllinie in einem undifferenzierten Zustand und während der Neurogenese zu definieren, wurde die RT-PCR-Methode (Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Die undifferenzierte P19-Zelllinie exprimierte die Pluripotenzgene wie organischekation/carnitin transporter4 (Oct4) und Nanog homeobo...

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Diskussion

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Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Neurogenese mit der P19-Zelllinie. Obwohl viele Berichte in dieser Hinsicht veröffentlicht wurden, eine detaillierte Methodik für Neurogenese Induktion mit P19-Zelllinie bleibt unklar. Darüber hinaus haben wir ein einfaches hochglukose (4.500 mg/L) DMEM-Medium mit 10% FBS für das gesamte Experiment verwendet. Dies ermöglichte es uns, das neurogene Experiment benutzerfreundlich durchzuführen und die Anwendung dieser Methode für die Zukunft zu erweitern.

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die Studie wurde vom National Science Centre, Polen (Grant-Nr. UMO-2017/25/N/NZ3/01886) und KNOW (Leading National Research Centre) Scientific Consortium "Healthy Animal - Safe Food", Entscheidung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulbildung Nr. 05-1/KNOW2/2015

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
6x DNA Loading DyeEURxE0260-01
AgaroseSigma- AldrichA9539
cDNA SynthesekitEURxE0801-02
DAPI (4′,6-Diamidin-2′-phenylindole dihydrochloride)Sigma- Aldrich10236276001Arbeitskonzentration: 1 μ g/mL
DMEM hoher Glukosegehalt (4,5 g/L) mit L-GlutaminLonzaBE12-604Q
Ethanol 99,8 %ChempurCHEM*613964202
Fötales Rinderserum (FBS)EURxE5050-03
MAP2 AntikörperThermo Fisher ScientificPA517646Verdünnung 1:100
PCR-ReaktionskitEURxE0411-03
Penicillin/Streptomycin 10K/10KLonzaDE17-602E
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x konzentriert ohne Ca2+, Mg2+LonzaBE17- 517Q
RetinsäureSigma- AldrichR2625-50MG  gelöst in 99,8 % Ethanol; Lagerung in -20 & Grad; C bis zu 6 Monate
Sekundärer Antikörper (Alexa Fluor 488)Thermo Fisher ScientificA11034Verdünnung 1:500
MagermilchSigma- Aldrich1153630500
TBE PufferThermo Fisher ScientificB52
Triton-X 100Sigma- AldrichT8787-100ML
Trypsin 0,25% - EDTA in HBSS, ohne  Ca2+, Mg2+,mitPhenolrot-BioserenLM-T1720/500
Zellkultur-Kunststoffe
1 mL Serologische PipettenProfilab515.01
10 mL Serologische PipettenProfilab515.10
100 mm Schale für SuspensionskulturCorningC351029
15 mL ZentrifugenröhrchenSigma- AldrichCLS430791-500EA
5 mL Serologische PipettenProfilab515.05
6-Well-PlatteCorningCLS3516
Zellkulturflaschen, Oberfläche 25 cm2Sigma- AldrichCLS430639-200EA

Referenzen

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P19 Zelllinieneuronale DifferenzierungRetins ure BehandlungZellaggregationTrypsinierungImmunf rbungReverse Transkriptions PCRMAP2 ExpressionNeuN ExpressionPluripotenzgene

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