Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache net Schimmel-basierte Methode, dreidimensionale (3D) kardialen Gewebe ohne zusätzliche Gerüst-Material. Human-induzierte pluripotente Stammzellen-Zelle abgeleitet Kardiomyozyten (iPSC-CMs), menschliche kardialen Fibroblasten (TREIBGASEN) und menschliche nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) zu isolieren und verwendet, um eine Zellsuspension mit 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel generieren. Sie sind in eine extrem niedrige Befestigungssystem "hängenden Tropfen", die Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert enthält Co kultiviert. Die Zellen aggregieren und spontan schlagende Sphäroide nach 3 Tagen der kokultur bilden. Die Sphäroide werden geerntet, in einen Roman Formhohlraum entkernt und auf einen Shaker im Brutschrank kultiviert. Die Sphäroide werden Reife Funktionsgewebe ca. 7 Tage nach der Aussaat. Die daraus resultierende mehrschichtige Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroide mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten. Diese neue Methode hat viel versprechende Potenzial als eine reproduzierbare und kostengünstige Methode, um technische Gewebe für die Behandlung der Herzinsuffizienz in der Zukunft zu schaffen.

Einleitung

Das Ziel des aktuellen Herzgewebe Engineering ist, eine Therapie zu ersetzen oder zu reparieren, die Struktur und Funktion des verletzten Herzmuskelgewebe¹zu entwickeln. Methoden zum Erstellen von 3-d-Herzgewebe Modelle präsentiert die wichtigeren kontraktilen und elektrophysiologischen Eigenschaften des nativen Herzgewebe haben^2,3rasch ausgedehnt. Eine Vielzahl von Strategien haben erforscht und in Studien^4,5verwendet worden. Diese Methoden reichen von den Einsatz von speziellen synthetischen und natürlichen bioaktiven Hydrogele, wie Gelatine, Kollagen, Fibrin und Peptide⁶, auf Bio-Tinte Ablagerung Technologien² und Bioprinting Technologien⁷.

Es hat sich gezeigt, dass Gerüst-freie Methoden als Biomaterial-basierte Methoden, ohne die Nachteile der Einbeziehung ausländischer Gerüst Material⁸vergleichbare Gewebe produzieren können. Oren Caspi Et Al. zeigten, dass die Einbeziehung der verschiedenen Arten von Zellen die Generation stark vaskularisierte menschlichen entwickelt Herzgewebe⁹ermöglicht. Kinn Et Al. entwickelt eine 3-d-Druckverfahren für kardiale Patch Kreation aus Sphäroide. Daraus resultierende Patches bestehen aus Herzzellen, Fibroblasten und Endothelzellen in einem 70:15:15 Verhältnis¹⁰. Sphäroide nachweislich wirksame "Bausteine" der Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung, wie sie sind resistent gegen Hypoxie und verfügen über ausreichende mechanische Integrität für Implantation^11,12. Frühere Studien haben gezeigt, verschiedene Herstellungsmethoden für Sphäroid Schöpfung, einschließlich der Verwendungdes der hängenden drop-Methode, Spinner Fläschchen¹³, mikrofluidische Systeme¹⁴und nicht anhaftende Kultur Oberflächen unbeschichtet oder beschichtet mit Agarose Mikro-Gußformen¹⁵. In diesem Protokoll verwenden wir die hängenden Tropfen Gerät, enthält Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert.

Diese Studie stellt eine neuartige und effiziente Gerüst-freie Methode für Herzgewebe Erstellung, manuell die Sphäroide in einen quadratischen Formhohlraum Aussaat und Inkubation des Gewebes auf einen Shaker für Reifung. Unter üblichen statischen Kulturbedingungen ist Sauerstoffdiffusion beschränkt sich auf die äußeren Aspekte der Gewebe-Konstrukt, was zentrale Nekrose. Mit der net Form Tauchen alle Sphäroide ausgesät in die Form jedoch in Medien mit einer Konstanten fluidische Bewegung, so dass für die verstärkte Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus diese Form-basierte Methode ermöglicht die gleichzeitige Erstellung von unterschiedlich großen Gewebe Patches mit minimalem manuellen Aufwand und das resultierende Gewebe kann leicht aus der Form entfernt werden. Diese neuartige Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Erstellung von Gerüst-frei, vielschichtigen kardiale Patches.

Protokoll

1. Vorbereitung von Kardiomyozyten

1. 6-Well-Platten mit Basalmembran Matrix und Kultur Mensch-induzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) wie zuvor beschrieben¹⁷zu beschichten.
2. HiPSCs in HiPSC-CMs mit der zuvor beschriebenen Methoden¹⁸zu unterscheiden.
3. 16-18 d Post-Differenzierung aussetzen der Herzmuskelzellen durch Spülen jedes gut mit 2 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium, gefolgt von Inkubation mit 1 mL/auch von Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle des Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) über ein gleiches Volumen von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Zelle Medien mit B-27 (RPMI/B-27 Zelle Medien) ergänzt. Pipette rauf und runter um alle eingehalten Zellen zu lockern.
5. Sammeln Sie die abgehängten Herzzellen mit einer serologischen 10-mL-Pipette und übertragen Sie sie auf eine 50 mL konische Rohr.
6. Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur einen Zelle Pellet zu erhalten.
7. Das Pellet in 10 mL RPMI/B-27 Zelle Medien aufzuwirbeln.
8. Kombinieren Sie 20 µL Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.
9. Verwenden Sie eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.

2. Vorbereitung der Fibroblasten

1. Initiieren einer Kultur einer menschlichen kardialen Fibroblasten (HCF) (Erwachsene ventrikuläre Typ)-Zelllinie wie zuvor¹⁶beschrieben.
2. Aussetzen der TREIBGASEN durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur¹⁶. Für ein T175 Fläschchen wurde 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation-Reagenz verwendet.
3. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums mit, dann übertragen Sie die Probe auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu erhalten eine Pellet.
4. Das Pellet in 10 mL von Fibroblasten Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).
5. 20 µL der HCF Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung kombinieren und vorsichtig mischen.
6. Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit des neuen Zellsuspension.

3. Vorbereitung der Endothelzellen

1. Initiieren Sie eine Kultur der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS) Zeile wie oben beschrieben¹⁷. Aussetzen der Mediumwechsel durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 3 min bei Zimmertemperatur¹⁷. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums verwenden, übertragen Sie dann auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur ein Pellet zu erhalten.
   Hinweis: Für eine Flasche T175 war 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz verwendet.
2. Das Pellet in 10 mL von Endothelzellen Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).
3. Kombinieren Sie 20 µL der HUVECS Suspension zu und Färben Sie es mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.
4. Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.

4. Schaffung von hängenden Tropfen Sphäroide

1. Legen Sie die hängenden Tropfen Gerät enthält 850 Mikroporen (jeweils mit einem Durchmesser von 350 µm) in sterilen 6-Well-Platten.
2. Die drei Arten von Zellen zu isolieren, wie oben beschrieben: HiPSC-CMs und TREIBGASEN Mediumwechsel. Kombinieren sie in einem Verhältnis von 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in einem 50 mL konische Röhrchen mit RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL.
3. 4 mL Zellsuspension (2.475.000 Zellen pro mL) in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen Anlage hängen Drop-System (mit Zusammenarbeit von 350 µm Durchmesser) sitzt in einem 6-Well-Platte zu verzichten.
4. Sphäroide bilden sich spontan innerhalb von 12 h der Verzicht auf der Zellsuspension in den hängenden Tropfen Gerät. Kultur für eine Gesamtmenge von 72 h (3 d) bei 37 ° C, 5 % CO₂und 95 % Luftfeuchtigkeit für die Reifung der Sphäroide weiter.
5. Nach 72 h Kultur, Ernte der Sphäroide durch die Poren an der Unterseite der hängenden System indem das Gerät in eine Schale mit Medium und wirbelnden es sanft um die Sphäroide aus der hängenden freizugeben fallen Tropfen Gerät.

5. 3-d-Patch-Erstellung unter Verwendung neuartige Net Form

1. Die Basis, quadratische Bodenplatte Bodennetz und 10 geschichteten Seite Netze montiert sind, um die neuartige Form mit Hilfe von ein paar sterilen Pinzette zu erstellen. Zuerst, stapeln Sie und richten Sie die Base, quadratische Bodenplatte, und unten Sie Netz mit den Eckpfosten. Dann Stapeln und Schicht 10 Seite Netze in wechselnden Richtungen um ein Netz von feinen Edelstahl-Zinken zu erstellen.
2. Spülen Sie die Füllung mit PBS oder Medium zu reduzieren die Oberflächenspannung und übertragen Sie anschließend die zusammengebaute Form auf die Füllung-Basis.
3. Befeuchten Sie die net Kavität mit PBS oder Medium in der gleichen Methode. Füllen Sie langsam die Sphäroide in vorausgesetzten Hohlraum der gewünschten Größe (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm oder 6 x 6 x 1 mm).
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass 120 % des erwarteten Volumens der Sphäroide in den Hohlraum zugeführt wird, so dass die Zelle Aggregate in engen Zusammenhang stehen und statisch bleiben.
4. Montieren Sie die obere Netz und quadratische Deckplatte auf die Eckpfosten und sichern Sie den Stopper und Holding Röhren eine Auswaschung der Sphäroide zu verhindern.
5. Übertragen Sie gefüllte net Schimmel-System auf eine 6-Well-Platte mit 6 mL RPMI/B-27 Zelle Medien oder in einen sterilen Behälter mit genügend Mittel zur Deckung der gesamten zusammengesetzten Form.
6. 7-10 Tage bei 3.000-4.000 X ginkubieren Sie 6-Well-Platte mit dem gefüllten Schimmel-System auf einen schwingenden Shaker.
   Hinweis: Die Dauer der Inkubation wird durch die Größe der kardialen Patches entschieden. Mit größeren Patches müssen die Inkubationszeit für kardiale Patch Reifung erhöht werden.

6. Entfernen des Patches aus der neuartigen Net Form

1. Entfernen Sie das Schimmel-System aus den Medien und legen Sie es auf die sterilisierten Umgang mit Matte in eine sterile 10-cm-Schüssel.
2. Entfernen Sie das halteröhrchen, Stopper, quadratische Deckplatte und im besten Netz. Schieben Sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette heraus die geschichteten Seite Netze eins nach dem anderen. Nach Decannulation wird ein intakter Herz Patch oben auf das Bodennetz erhalten.
3. Das Bodennetz mit dem Patch mit sterilen Pinzette Abholung und transfer das Bodennetz in eine 35-mm-Schale mit 5 mL RPMI/B27 Medien. Lösen Sie vorsichtig den Patch von net unten durch das Netz langsam umschwenken, in der Schale oder mit einem sterilen Zelle Schaber. Nach der Loslösung von der Bodennetz kann das Herzgewebe mit RPMI/B27 Medien kultiviert werden.
4. Weiter zu den frei schwebenden 3-d-kardiale Patch in der 35-mm-Schale zu inkubieren. Funktionale synchron schlagen kann bereits 24 Stunden nach der Entnahme aus der Form beobachtet werden.
5. Nach dem Entfernen des Patchs aus dem net Werkzeug, zu beobachten, dass seine Form mit Integrität und der Intensität der synchron schlagen steigt mit der Zeit erhalten bleibt.
   Hinweis: Die 3-d-net Schimmel-basierte kardiale Patches ausgestellt elektrische Integration der Komponente Cardiospheres nach Decannulation. Wir beobachteten eine Tracht Prügel-Frequenz von 60 bis 80 Schlägen pro Minute, die länger als 60 Tage beibehalten.

Ergebnisse

In unseren Experimenten haben wir eine Zellsuspension 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL verwendet. Nach dem Erstellen der Zellsuspension, verzichtet wir 4 mL Zellsuspension in jede Vertiefung der Dateianhang Ultra low Drop Aufhängesystem, wie unter Punkt 4.3 des Protokolls beschrieben. Die Verwendung des Behangs fundsystem führte die spontane Bildung von Hunderten Sphäroide nach 3 Tagen der Ku...

Diskussion

Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Reproduzierbarkeit und die Wirksamkeit der daraus resultierenden vielschichtigen Herzgewebe. Im Bereich der kardialen Gewebetechnik ist eines der aktuellen Ziele zu identifizieren, eine Methode um schlagen, vielschichtig und funktionale 3-d-kardiale Patches zu konstruieren. Wir berichten über eine effiziente und reproduzierbare Methode vielschichtigen kardialen Gewebe durch manuelle Direktsaat der Sphäroide bestehend aus Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten in eine neuar...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Humane kardiale Fibroblasten (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 besteht aus Basalmedium	Sciencell	2331	HCF-Kulturmedium
Humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit	Lonza	CC5035	HUVEC Kulturmedium
E8 Medien	Invitrogen	HiPSC-Nährmedium
Geltrex	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzym (1X)	Thermo Fisher	12604013	Trypsin und Zelldissoziationsreagenz
RPMI-Medien	Invitrogen	11875093	RPMI-Medien mit B-27-Supplement sind hiPSC-CM-Kulturmedium
B-27-Supplement (50x)	Thermo Fisher	17504044	RPMI-Medien mit B-27-Supplement sind hiPSC-CM-Kulturmedium
Trypanblau Lösung, 0,4 %	Thermo Fisher	15250061
Neuartige Netzform	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
Hängende Fallplatte	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6-Well-Platten	Sigma-Aldrich	CLS-3516