Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Niere Kortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel um die native Niere extrazelluläre Matrix (ECM) strukturelle und biochemische Zusammensetzung behalten zu fabrizieren. Den Fertigungsprozess und ihre Anwendungen werden beschrieben. Schließlich ist eine Perspektive auf die Verwendung dieses Hydrogel zur Niere-spezifische zelluläre und Geweberegeneration und Bioingenieurwissenschaften Unterstützung diskutiert.
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Methodenartikel
Herstellung einer Niere Cortex extrazelluläre Matrix abgeleitet Hydrogel
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Aktuelle synthetischen Hydrogelen bieten robuste mechanische Unterstützung für in-Vitro Zellkultur aber fehlen die notwendigen Protein und Liganden Zusammensetzung physiologischen Verhalten von Zellen zu entlocken. Dieses Manuskript beschreibt ein Herstellungsverfahren für eine Niere Kortex ECM-abgeleitete Hydrogel mit richtige mechanische Robustheit und unterstützende biochemischen Zusammensetzung. Das Hydrogel ist von mechanisch Homogenisieren und Gefäss-decellularized menschliche Niere Kortex ECM hergestellt. Die Matrix bewahrt native Niere Kortex ECM Protein Verhältnisse Gelierung zu physiologischen mechanische Steifigkeit ermöglicht. Das Hydrogel dient als Substrat auf die Nieren Rinde gewonnenen Zellen unter physiologischen Bedingungen aufrechterhalten werden können. Darüber hinaus kann die Hydrogel-Zusammensetzung manipuliert werden, um eine kranke Umwelt-Modell ermöglicht die Zukunftsstudie von Nierenerkrankungen.
Einleitung
Extrazellulärer Matrix (ECM) bietet wichtige biophysikalische und biochemische Hinweise um Gewebe Homöostase. Die komplexen molekularen Zusammensetzung regelt die strukturelle und funktionelle Eigenschaften des Gewebes. Strukturproteine Zellen mit räumliches Vorstellungsvermögen und Adhäsion und Migration1. Gebundene Liganden interagieren mit Oberfläche Zellrezeptoren, Zelle Verhalten2zu kontrollieren. Niere ECM enthält eine Fülle von Molekülen, deren Zusammensetzung und Struktur variiert je nach anatomischen Lage, Entwicklungsstufe und Krankheit Staat3,4. Rekapi....
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Protokoll
Menschliche Nieren wurden durch LifeCenter Nordwesten nach ethischen Leitlinien durch die Association of Organ Procurement Organizations lokalisiert. Dieses Protokoll folgt Tiere Pflege und Zelle Kultur genannten Richtlinien von der University of Washington.
1. Vorbereitung des menschlichen Nierengewebe
- Vorbereitung der Decellularization Lösung
- Ein 5000 mL-Becherglas und eine 70 x 10 mm Stir Bar zu sterilisieren.
- Mix 1: 1000 (Gewicht: Volumen) Natrium Dodecyl-Sulfat (SDS) in autoklaviert deionisiertes Wasser in den Becher geben. Lassen Sie die Lösung auf einem Teller rühren ca. 200 u/min für 24 h oder bis die SD....
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Ergebnisse
KECM Hydrogel stellt eine Matrix für Niere Zellkultur mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung als die native Niere Mikroumgebung. Um das Hydrogel zu fabrizieren, ist Cortex nierengewebe mechanisch isoliert aus eine ganze Niere Orgel und gewürfelte (Abbildung 1). Decellularization mit einem chemischen Reinigungsmittel (Abbildung 2A.1-a. 3), gefolgt von Spülungen mit Wasser Spülmittel Partikel (
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Diskussion
Matrizen liefern wichtige mechanische und chemische Signale, die Zelle Verhalten steuern. Synthetische Hydrogele sind in der Lage, komplexe 3-dimensionale Musterung unterstützen, aber nicht die vielfältigen extrazelluläre Signale in physiologischen Matrix Mikroumgebungen gefunden. Hydrogele native ECM abgeleitet sind ideale Materialien für in Vivo und in Vitro Studien. Frühere Studien haben decellularized ECM Hydrogele verwendet, um synthetische Biomaterialien zur Vermeidung Host Immunreaktionen
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten die Lynn und Mike Garvey Imaging Laboratory am Institut für Stammzellen und Regenerationsmedizin und LifeCenter Nordwesten anzuerkennen. Sie möchten auch die finanzielle Unterstützung der National Institutes of Health Zuschüsse, UH2/UH3 TR000504 (, j.h.) und DP2DK102258 (um Y.Z), NIH T32 Ausbildung Grant DK0007467 (R.J.N.), und ein uneingeschränkter Geschenk aus Nordwesten Niere Zentren zu erkennen an der Niere-Forschungsinstitut.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Präparation von Nierengewebe | |||
| 5000 mL Becherglas | Sigma-Aldrich | Z740589 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| steril H2O | Autoklaviered DI H2O | ||
| Rührstab (70 x 10 mm) | Fisher Science | 14-512-128 | |
| 500 mL Vakuumfilter | VWR | 97066-202 | |
| Rührplatte | Sigma-Aldrich | CLS6795420D | |
| 1000 mL Becher | Sigma-Aldrich | CLS10031L | |
| Pinzette | Sigma-Aldrich | F4642 | Jede ähnliche Pinzette kann verwendet werden |
| Scherengriff-Hämostatklemme | Sigma-Aldrich | Z168866 | |
| Präparierschere | Sigma-Aldrich | Z265977 | |
| Skalpellgriff, Nr. 4 | VWR | 25859-000 | Jeder ähnliche Skalpellgriff kann verwendet werden |
| Skalpellklinge, Nr. 20 | VWR | 25860-020 | Jede ähnliche Skalpellklinge kann verwendet werden |
| Rührstab (38,1 x 9,5 mm) | Fisher Science | 14-513-52 | |
| Saugfähiges Unterlage | VWR | 82020-845 | |
| Petrischale (150 x 25 mm) | Corning | 430597 | |
| Autoklavierbarer Biohazard-Beutel | VWR | 14220-026 | |
| Steriles Zellsieb (40 μm) | Fisher Science | 22-363-547 | |
| Wasser | HyClone | SH30529.03 | |
| 30 mL Freistehendes Röhrchen | VWR | 89012-778< | |
| stark> Herstellung von ECM Gel | |||
| Polytron | PCU-20110 | ||
| Gefriertrockner | Labconco | 7670520 | |
| 20 mL Glasszintillationsfläschchen und Kappe | Sigma-Aldrich | V7130 | |
| Rührstab (15,9 x 8 mm) | Fisher Science | 14-513-62 | |
| Pepsin aus der Magenschleimhaut von Schweinen | Sigma-Aldrich | P7012 | |
| 0,01 N HCl | Sigma-Aldrich | 320331 | Verdünnen auf 0,01 N HCl mit Zellkulturwasser |
| Nieren-ECM Gelierung | |||
| 1 N NaOH (steril) | Sigma-Aldrich | 415413 | Wasser in Zellkultur auf 1 N verdünnen |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| 15 mL Konisches Röhrchen | ThermoFisher | 339651 | |
| Zellkulturmedien | ThermoFisher | 11330.032 | Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium: Nährstoffmischung F-12 (DMEM/F12) |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum 100X | Life Technologies | 15240-062 | |
| Insulin, Transferrin, Selen, Natriumpyruvatlösung ( ITS-A) 100X | Life Technologies | 51300-044 | |
| 1 mL Spritze | Sigma-Aldrich | Z192325 | |
| Mikroskopspatel | Sigma-Aldrich | Z193208 |
Referenzen
- Lelongt, B., Ronco, P. Role of extracellular matrix in kidney development and repair. Pediatric Nephrology. 18 (8), 731-742 (2003).
- Yue, B. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. Journal of Glaucoma. 23, S20-S23 (2014).
- Miner, J. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
