Summary
नोड और notochordal प्लेट माउस भ्रूण है कि कई तकनीकों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है के विकास में क्षणिक संकेत आयोजकों रहे हैं । यहां, हम विस्तार से वर्णन कैसे तकनीकों के दो करने के लिए अपनी संरचना और morphogenesis अध्ययन: 1) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM); और 2) पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF) ।
Abstract
बाद आरोपण माउस भ्रूण gastrulation और morphogenesis की दीक्षा के बाद प्रमुख आकार बदलता है । morphogenesis की एक बानगी क्षणिक आयोजकों का गठन है, नोड और notochordal प्लेट, कोशिकाओं है कि आदिम लकीर के माध्यम से पारित कर दिया है से । इन संकेत केंद्र के समुचित गठन शरीर की योजना और तकनीकों के विकास के लिए आवश्यक है उंहें कल्पना उच्च ब्याज की माउस विकास जीव के लिए कर रहे हैं । नोड और notochordal प्लेट भ्रूण दिवस के आसपास gastrulating माउस भ्रूण के ventral सतह पर झूठ (ई) विकास के ७.५ । नोड एक कप के आकार का संरचना है जिसकी कोशिकाओं को एक एकल पतला पपनी प्रत्येक अधिकारी है । उचित उपसेलुलर स्थानीयकरण और नोड गड्ढे में cilia के रोटेशन बाएं सही विषमता निर्धारित करता है । notochordal प्लेट कोशिकाओं को भी एकल cilia के अधिकारी हालांकि नोड कोशिकाओं की तुलना में कम है । notochordal प्लेट notochord जो somitogenesis और तंत्रिका patterning के लिए एक महत्वपूर्ण संकेत आयोजक के रूप में कार्य करता है रूपों । क्योंकि नोड और notochordal प्लेट की कोशिकाओं को सतह पर क्षणिक मौजूद है और cilia के अधिकारी, वे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । अन्य तकनीकों में सेलुलर स्तर पर इन संरचनाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF) अत्यधिक नोड और notochordal प्लेट में व्यक्त कर रहे हैं कि प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग कर रहा है. इस रिपोर्ट में, हम हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन SEM और माउस भ्रूण के विकास में notochordal प्लेट के WMIF करने के लिए ऊतक के आकार और वंय-प्रकार और gastrulation उत्परिवर्ती भ्रूण में सेलुलर संगठन के आकलन में मदद करते हैं ।
Introduction
Gastrulation और साथ morphogenetic आंदोलनों माउस1भ्रूण को आकार देने के लिए महत्वपूर्ण हैं । morphogenesis के दौरान सेलुलर आकार और संगठन में परिवर्तन सेल भाग्य को विनियमित करने के लिए स्थिति जानकारी हुक्म और भी आगामी संकेत रास्ते ठीक करने के लिए नए गठन रोगाणु परतों1विविधता को अपने कार्यों का प्रदर्शन करने की अनुमति. क्षणिक आयोजन संरचनाओं और सिगनलिंग केन्द्रों जैसे नोड और notochord का गठन विकासात्मक कार्यक्रम2के निष्पादन के लिए आवश्यक है । विकास जीव तकनीक की एक किस्म का इस्तेमाल किया है इन संरचनाओं के morphogenesis अध्ययन, सबसे उल्लेखनीय जिनमें से सेलुलर पत्रकारों और जीने के पूर्व vivo इमेजिंग का उपयोग करने के लिए सेलुलर और सेलुलर व्यवहार 2 में गतिशीलता का पालन है ,3,4. इस रिपोर्ट में, हम इन तकनीकों में से दो के लिए हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल के विवरण का वर्णन पर ध्यान केंद्रित: स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस (WMIF), जो थे और अभी भी नोड के morphogenesis का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई और notochordal थाली, notochord के प्रणेता ।
माउस भ्रूण नोड एक अश्रु के आकार का कप है कि माउस भ्रूण के ventral सतह पर जल्दी देर सिर मोड़ो के आसपास स्थित है gastrulation और morphogenesis (भ्रूण दिवस, ई 7.5-E8)2,5के दौरान चरणों, 6,7. notochordal प्लेट आकृति विज्ञान नोड3से पूर्वकाल से उत्पन्न होती है । नोड और notochordal प्लेट में प्रत्येक कोशिका एक एकल पपनी कि बाहर है, जो अब नोड कोशिकाओं में है, लेकिन जिसकी लंबाई विकास चरण2के साथ बदलता है के लिए बहर की विशेषता है । cilia के रोटेशन नोड गड्ढे में संकेत है कि बाएं सही विषमता निर्धारित करता है के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है4। notochordal प्लेट notochord, संकेतन केंद्र है कि आसंन somites और के पैटर्न के लिए महत्वपूर्ण है के अग्रदूत साबित तंत्रिका ट्यूब3...
क्योंकि स्थान की विशेषताओं (सतह), आकार (कप) और अलग बाहरी सेलुलर संरचनाओं रखने (cilia), SEM पारंपरिक नोड और notochordal प्लेट कल्पना और उनके गठन और संरचना2अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, 7. SEM भी gastrulation, morphogenesis, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से cilia गठन8,9,10का प्रभाव है कि उत्परिवर्तन में अपनी कोशिकाओं पर नोड या cilia की संरचना में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । SEM एक तकनीक है कि इलेक्ट्रॉनों की एक केंद्रित बीम का इस्तेमाल करता है ऐसे जैविक नमूनों11के रूप में सामग्री की बाहरी सतह के टोपोलॉजिकल ultrastructure पूछताछ । नमूना आमतौर पर तय, सूख गया है और फिर धूम-एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए धातुओं के साथ लेपित के रूप में हम चरण 1 में वर्णन ।
WMIF एक दाग तकनीक है जैसे प्रोटीन के रूप में जीन उत्पादों, कल्पना, तीन आयामों (3 डी) में । ऊतकों, अंगों या यहां तक कि पूरे जीवों के WMIF संकेत के वितरण और 3 डी में परिणामी संरचना के आकार के बारे में स्थानिक जानकारी प्रदान करता है । तकनीक नमूना तो यह फ्लोरोसेंट conjugates के साथ दाग फिक्सिंग पर आधारित है । माउस भ्रूण ~ ई 7.5 छोटे और पारदर्शी और इसलिए WMIF प्रोटोकॉल नोड और notochordal प्लेट कल्पना के लिए आदर्श होते हैं । उदाहरण के लिए, प्रतिलेखन फैक्टर Barchyury (टी) नोड और notochordal प्लेट के नाभिक में व्यक्त किया जाता है, और आदिम लकीर में एक हद तक कम करने के लिए, ई 7.5 के आसपास-भ्रूण विकास के E8 और WMIF द्वारा टी के खिलाफ अच्छा काम एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से कर रहे हैं उपलब्ध है और धुंधला प्रक्रिया संभव बनाते हैं । नोड और notochordal प्लेट की कोशिकाओं को भी सीमित शिखर सतहों, जो बाहर का सामना और इस तरह प्रतिदीप्ति-संयुग्मित Phalloidin के साथ दाग हो सकता है की विशेषता है Actin कसना में एफ शिखर निशान । उदाहरण के रूप में इन रिएजेंट का प्रयोग, टी और एफ के संयोजन-Actin WMIF द्वारा धुंधला gastrulating माउस भ्रूण में 3 डी में नोड और notochordal प्लेट का प्रतिनिधित्व प्रदान करता है के रूप में हम चरण 2 8में प्रदर्शन । हालांकि, ऐसे ARL13B या acetylated tubulin के रूप में cilia के मार्करों, के रूप में अच्छी तरह से नोड और notochordal प्लेट के अंय मार्करों के रूप में, जैसे FOXA2, भी माउस भ्रूण3,4के विकास पर WMIF प्रदर्शन किया जा सकता है ।
हमें पता चला है कि striatin-बातचीत प्रोटीन 1 (STRIP1) माउस भ्रूण8में सामांय gastrulation और morphogenesis के लिए आवश्यक है । STRIP1 striatin के एक मुख्य घटक है phosphatases और kinases परिसरों (STRIPAK), जो हम और दूसरों को actin cytoskeleton संगठन8,12में फंसा है बातचीत । Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में एक प्रमुख दोष अक्षीय मध्य त्वक स्तर (नोड और notochordal प्लेट) और antero-पीछे शरीर धुरी के विस्तार के गठन में है । हम SEM और WMIF का इस्तेमाल किया है नोड और जंगली में notochordal प्लेट प्रकार (WT) और Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण का विश्लेषण के रूप में हम प्रतिनिधि परिणाम और इसी आंकड़े में दिखाते हैं ।
Protocol
पशु प्रयोगों से जुड़े सभी प्रयोगों को नॉर्थ Rhein Westphalia (LANUV-NRW) में उत्तरदायी अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के माउस भ्रूण नोड
- ग्रीवा विस्थापन से ~ e 7.5 (2-4 somite चरण) में गर्भवती महिला माउस बलिदान । चरण १.१-१.७ के आरेख के साथ एक विस्तृत विवरण माउस भ्रूण प्रयोगशाला नियमावली13में उपलब्ध है ।
- त्वचा के माध्यम से पेट खोलें और mesenteries और कैंची और फाइन संदंश का इस्तेमाल कर गर्भाशय को निकाल दें ।
- आसुत पानी में संक्षेप में गर्भाशय कुल्ला और यह एक छोटे से स्वच्छ पेट्री डिश में जगह (6 सेमी) 1x फॉस्फेट-खारा (पंजाब) युक्त ।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत और ठीक संदंश का उपयोग कर, गर्भाशय की मांसपेशियों को हटाने के लिए व्यक्तिगत deciduae या आरोपण साइटों को मुक्त ।
- संदंश की एक जोड़ी के साथ प्रत्येक decidua पकड़ो और एक अनुदैर्ध्य लाल भाग (भविष्य अपरा) और सफेद भाग के बीच पूर्ण मोटाई चीरा बनाने के लिए अंय जोड़ी का उपयोग करें (जहां भ्रूण स्थित है) । सतही वेध चीरा के साथ निरंतर decidua के सफेद भाग के साथ खड़ी कर. दो हिस्सों में अलग क्षैतिज decidua खींचो और ध्यान से decidua के सफेद भाग में भ्रूण बाहर स्कूप ।
- एक नई पेट्री डिश को भ्रूण हस्तांतरण (३५ mm) ताजा बाँझ-फ़िल्टर्ड पंजाबियों के साथ । सभी deciduae/भ्रूण के लिए दोहराएं ।
- निकालें रीचर्ट की झिल्ली, एक अपेक्षाकृत अपारदर्शी झिल्ली भ्रूण छा, एक भ्रूण से यह चिढ़ा दूर की तरह ectoplacental शंकु (लाल आरोपण साइट) पर शुरू बचा द्वारा । genotyping के लिए, इस स्तर पर जर्दी थैली के एक छोटे से टुकड़ा (~ ०.१ mm2) ले लो ।
- एक रासायनिक डाकू और उचित संरक्षण (दस्ताने) पहने के तहत, उंहें ग्रेड निर्धारण करने के लिए भ्रूण हस्तांतरण एक microcentrifuge में बाँझ-फ़िल्टर्ड पंजाबियों में २.५% glutaraldehyde की रचना (१.५ एमएल) कमरे के तापमान पर ट्यूब । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण ठीक ।
- ध्यान से भ्रूण को छूने के बिना ट्यूब से glutaraldehyde निर्धारण को हटाने और एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें । 15 मिनट के लिए प्रत्येक कमरे के तापमान पर बाँझ-फ़िल्टर किए गए पंजाबियों में तीन बार भ्रूण धो लें ।
- निर्जलीकरण 5 मिनट प्रत्येक के लिए एक इथेनॉल श्रृंखला में भ्रूण: ५०%, ७०%, ८५%, और तीन बार में १००% या निरपेक्ष इथेनॉल । इथेनॉल में-20 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की दुकान या अगले कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना ।
- एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर मशीन में महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) के लिए टोकरी में इथेनॉल में भ्रूण स्थानांतरण । इथेनॉल के साथ चैंबर भरें टोकरी पूरी तरह से कवर करने के लिए ।
- ध्यान से एक 10 डिग्री सेल्सियस पर दस बार के लिए तरल सह2 के साथ निस्तब्धता द्वारा इथेनॉल विनिमय । अंतिम चरण के बाद जब तक चैंबर आधा भरा है तरल सह2 बंद नाली । ४० डिग्री सेल्सियस तक दबाव तक पहुंचता है ८० सलाखों (महत्वपूर्ण बिंदु) और तरल सह गैस के लिए2 परिवर्तन । 10 मिनट के लिए रुको तो धीरे से लगभग ४५ मिनट से अधिक गैस झटका ।
- सुखाने के लिए सीपीडी के लिए एक आसान विकल्प के रूप में, 30 मिनट के लिए इथेनॉल में भ्रूण को 1:1 के अनुपात में hexamethyldisilazane (HMDS) जोड़ें । तो 30 मिनट के लिए शुद्ध HMDS के लिए भ्रूण स्थानांतरण । एक पिपेट का उपयोग कर तरल पदार्थ से बाहर निकालें और 30 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए उन्हें छोड़ दें ।
नोट: दोनों सुखाने तरीकों हमारे हाथ में समान रूप से अच्छी तरह से काम किया । - एक ठीक ब्रश का प्रयोग करें ventral पक्ष (नोड) के साथ सूखे भ्रूण माउंट के लिए डबल पक्षीय टेप के साथ एक SEM ठूंठ पर ।
- डालें भ्रूण के साथ डिटेल सोने के कण कोटिंग के लिए एक धूम कोटिंग मशीन है, जो लंबी पतली cilia चार्ज करने के लिए पसंद है । 120-150 Å की एक परत लागू करें; समय वर्तमान पर निर्भर है, जो प्रत्येक नमूने के साथ भिंन होगा ।
- एक SEM माइक्रोस्कोप में भ्रूण के साथ लेपित डिटेल प्लेस, निर्वात लागू करते हैं और 1000X से 15, 000X को लेकर आवर्धन पर cilia के साथ भ्रूण नोड और notochordal प्लेट कोशिकाओं का पालन ।
2. माउस नोड और Notochordal प्लेट के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- बर्फ का प्रयोग ठंड ०.०५% 20 के बीच (PBSTw) के साथ, 1.1 चरणों का पालन करें ई 7.75 पर भ्रूण को हटाने और उंहें बर्फ पर एक ३५ mm पेट्री डिश में PBSTw में जगह ।
- एक रासायनिक डाकू और उचित संरक्षण (दस्ताने) पहने के तहत, एक microcentrifuge ट्यूब में पंजाबियों में 4% paraformaldehyde के एक निर्धारण समाधान के लिए भ्रूण हस्तांतरण । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भ्रूण ठीक ।
- ध्यान से भ्रूण को छूने के बिना ट्यूब से paraformaldehyde निर्धारण को हटाने और एक उचित अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें । 5 मिनट के लिए प्रत्येक कमरे के तापमान पर ०.२% ट्राइटन X-१०० (PBSTr) युक्त पंजाब में तीन बार भ्रूण धो लें । एक nutating शेखर पर सभी धोने और अगले मशीन कदम प्रदर्शन करते हैं ।
- पिछले धोने निकालें और 10% गर्मी निष्क्रिय सीरम (माध्यमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों से) के साथ PBSTr युक्त अवरुद्ध समाधान जोड़ने. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutator पर रात को 2 घंटे (या लंबे समय तक) से ब्लॉक ।
- अवरुद्ध निकालें और समाधान अवरुद्ध में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, उदाहरण के लिए एक विरोधी 1:500 कमजोर पड़ने पर टी एंटीबॉडी । 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutator पर रात भर (या अब) मशीन ।
- प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और ०.०२% की अंतिम एकाग्रता के लिए सोडियम azide जोड़कर बाद में उपयोग के लिए इसे बचाने के लिए (1 µ एल के 20% स्टॉक के 1 मिलीलीटर एंटीबॉडी समाधान). एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है ~ 10 बार । PBSTr के साथ दो बार भ्रूण कुल्ला और फिर उंहें 30 मिनट के लिए तीन बार धो 4 डिग्री सेल्सियस पर एक nutator पर प्रत्येक ।
- एक प्रतिदीप्ति-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धोने की जगह, प्राथमिक एंटीबॉडी मेजबान प्रजातियों के खिलाफ, पर पतला ~ 1:1000 रातोंरात (या लंबे समय) पर एक nutator पर 4 डिग्री सेल्सियस ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और PBSTr के साथ दो बार कुल्ला, तो PBSTr के साथ 30 मिनट के लिए तीन बार धो लो ।
- 1:500 प्रतिदीप्ति-संयुग्मित phalloidin युक्त PBSTr के साथ पिछले धोने की जगह, एफ Actin दाग, और 1:1000 DAPI, दाग नाभिक के लिए, 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ।
- PBSTr में दो बार कुल्ला और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए PBSTr के साथ एक बार धो लो ।
- पंजाबियों के साथ PBSTr बदलें और बर्फ पर भ्रूण छोड़ दें । तैयार साफ सकारात्मक आरोप स्लाइड (६० x 24 मिमी) और coverslips (24 x 24 मिमी) और जलीय ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मीडिया, उदाहरण के लिए, 1xPBS में ९०% ग्लिसरॉल और एक antifade एजेंट, के लिए भ्रूण माउंट ।
- स्लाइड के स्पष्ट भाग पर एक दूसरे से ~ 15 mm की दूरी पर स्पष्ट टेप के दो टुकड़े रखो । यह पर्याप्त 3 डी अंतरिक्ष (जेड आयाम) में है कि भ्रूण को समतल लेकिन पूरी तरह से उंहें नहीं squishing की अनुमति होगी पैदा करेगा ।
- एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, ध्यान से भ्रूण एक कट P200 पिपेट का उपयोग कर ले जाने के लिए (पर्याप्त स्थान की अनुमति के लिए भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए और क्षतिग्रस्त नहीं) स्लाइड करने के लिए ।
- ठीक संदंश का उपयोग करना, जर्दी थैली के पार्श्व पक्षों पर दो पूर्ण कटौती करने के लिए भ्रूण प्रकट करना । ventral पक्ष के साथ भ्रूण प्लेस (नोड और notochordal प्लेट) ऊपर (नीचे स्लाइड पर तंत्रिका ट्यूब के पृष्ठीय) ।
- भ्रूण पर बढ़ते मीडिया के ५० µ एल जोड़ें । प्लेस 4-5 प्रति स्लाइड भ्रूण । coverslip है कि पहले स्लाइड (ऊपर या नीचे की ओर) को छूने होगा के पक्ष में बढ़ते मीडिया के एक ढाब जोड़ें, तो यह टेप के दो टुकड़े झीनी जगह और यह ठीक संदंश या एक तुला ठीक सुई का उपयोग कर भ्रूण पर धीरे से कम जबकि हवा बुलबुले बनाने से परहेज ।
- एक शोषक पोंछ का उपयोग करके अतिरिक्त बढ़ते मीडिया साफ । इस प्रक्रिया में coverslip को नहीं ले जाने के लिए सावधान रहें ।
- नेल पॉलिश की एक उदार राशि का उपयोग करना, यह चलती बिना coverslip के पक्षों को सील ।
- एक स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
Representative Results
आदेश में WT और Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में नोड के गठन की जांच करने के लिए ~ ई 7.5, हम के रूप में चरण 1 में वर्णित SEM इस्तेमाल किया और 1 चित्र8में दिखाया गया है । बाहर SEM का उपयोग टोपोलॉजी के ultrastructural विवरण काफी जानकारीपूर्ण थे और यह तुरंत स्पष्ट है कि गड्ढे के विपरीत WT भ्रूण में नोड के आकार का था, उत्परिवर्ती भ्रूण एक समतल और अनियमित नोड था । भ्रूण के उच्च आवर्धन नोड कोशिकाओं है कि उंहें स्पष्ट रूप से पहचान पर विशेषता cilia दिखाया । cilia के उत्परिवर्ती में स्पष्ट कम घनत्व नोड पिट संरचना और वक्रता या नोड कोशिकाओं की एक कम संख्या की हानि के कारण हो सकता है । notochordal प्लेट जो नोड से उत्पंन दिखाई भी उत्परिवर्ती भ्रूण में अनियमित था । वे अपने छोटे cilia के साथ पहचाने जाते थे । इसलिए, SEM Strip1 म्यूटेंट8में नोड morphogenesis दोषों को प्रकट करने के लिए महत्वपूर्ण था । हम भी पिछले अध्ययनों में SEM इस्तेमाल किया है म्यूटेंट की भ्रूण नोड में cilia के अभाव दिखाने कि centrioles, जो9cilia के लिए टेंपलेट प्रदान की कमी है ।
सेलुलर स्तर पर Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में अक्षीय मध्य त्वक स्तर गठन दोषों का अध्ययन करने के लिए, हम चरण 2 में वर्णित WMIF के रूप में इस्तेमाल किया और चित्रा 2में दिखाया गया है । इस तकनीक का प्रयोग, नोड और notochordal प्लेट आसानी से एफ Actin और टी धुंधला द्वारा की पहचान की गई । WT नोड और notochordal प्लेट कोशिकाओं को सीमित शिखर डोमेन जहां एफ Actin समृद्ध था, और परमाणु टी धुंधला स्पष्ट था । notochordal प्लेट WT में rostrally बढ़ाया लेकिन कम और उत्परिवर्ती में अनियमित था । आंकड़ों से पता चला है कि एफ Actin संगठन के अक्षीय मध्य त्वक स्तर8सहित उत्परिवर्ती भ्रूण के विभिंन रोगाणु परतों में असामांय है । इस प्रकार, WMIF नोड और Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में notochordal प्लेट गठन में दोषों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी ।
चित्रा 1 . स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी Strip1 उत्परिवर्ती माउस भ्रूण में नोड morphogenesis में दोषों का पता चलता है । शीर्ष WT और Strip1 उत्परिवर्ती ventral भ्रूण नोड्स और notochordal प्लेट्स (Noto)8के SEM विश्लेषण । एक WT भ्रूण की एक कम आवर्धन छवि का एक उदाहरण बाईं तरफ दिखाया गया है । नीचे नोड कोशिकाओं से लंबी monocilia पेश करने वाले शीर्ष पर दिखाए गए नोड्स के केंद्र के उच्च आवर्धन । पूर्वकाल सभी पैनलों में है । स्केल बार्स: 30 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2 . पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण में सेलुलर स्तर पर असामान्य नोड और notochordal प्लेट से पता चलता है । शीर्ष Ventral 3 डी प्रतिपादन (Volocity सॉफ्टवेयर) WT और Strip1 उत्परिवर्ती भ्रूण पर WMIF का एक संयोजन का उपयोग कर प्रतिदीप्ति-संयुग्मित phalloidin (एफ-Actin, लाल) और टी एंटीबॉडी (हरी) धुंधला । नीचे दाग के अधिक उदाहरण उच्च ज़ूम के साथ नोड पर ध्यान केंद्रित कर ऊपर दिखाए गए और DAPI सहित । पूर्वकाल सभी पैनलों में है । स्केल बार्स: 30 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
इस काम में, हम प्रदर्शन कैसे SEM और WMIF करने के लिए माउस भ्रूण नोड और notochordal प्लेट कल्पना । gastrulating माउस भ्रूण के छोटे आकार ~ ई 7.5 और सतह पर इन संरचनाओं की उपस्थिति उन्हें2,7,8वर्णित तकनीकों का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए आदर्श बनाते हैं । ऐसे टी और cilia मार्करों के रूप में अच्छे एंटीबॉडी की उपलब्धता, उत्कृष्ट 3 डी संरचना, संगठन और इन आवश्यक भ्रूण8आयोजकों के गठन पर WMIF का उपयोग कर जानकारी देता है ।
क्योंकि माउस भ्रूण विकास बहुत तीव्र गति से आगे बढ़ता है और नोड और notochordal प्लेट भ्रूण की सतह पर ही क्षणिक रूप से मौजूद हैं, समय इन प्रयोगों की सफलता के लिए आवश्यक है2,3. उदाहरण के लिए, 2-4 somite भ्रूण लंबे cilia के साथ एक परिपक्व नोड गड्ढे के SEM विश्लेषण के लिए अच्छा कर रहे हैं । बहुत पहले या बाद में भ्रूण (उदाहरण के लिए, 12 घंटे पहले या बाद में), नोड सतह पर मौजूद नहीं हो सकता है । WMIF इस संबंध में थोड़ा और लचीला है लेकिन संरचनाओं खुद भी विकास के दौरान क्षणिक रहे है और इस मामले में समय शोधकर्ताओं के हितों पर निर्भर करता है ।
रिएजेंट की शुद्धता भी इन तकनीकों की सफलता के लिए आवश्यक है, विशेष रूप से SEM द्वारा ultrastructure की जांच में । छोटे अशुद्धियां कि भ्रूण के लिए छड़ी आमतौर पर विशाल कलाकृतियों में परिणाम है ।
हम आधा है Karnovsky निर्धारण (२.५% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde और ०.१ एम cacodylate बफर) और 1x पंजाब में एक सरल २.५% glutaraldehyde का उपयोग कर SEM एक के लिए भ्रूण निर्धारण के दो अलग तरीकों का परीक्षण किया है । हम चरण 1 में वर्णित के रूप में glutaraldehyde और पंजाब निर्धारण का उपयोग करना पसंद करते हैं, तथापि, हम और दूसरों को भी आधा Karnovsky के निर्धारण सफलतापूर्वक SEM के लिए इस्तेमाल किया है ।
हम भी SEM के लिए भ्रूण सुखाने के दो तरीकों की तुलना में है और एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर या HMDS के रूप में चरण 1 में वर्णित का उपयोग करके नमूने की गुणवत्ता में कोई अंतर नहीं पाया और14कहीं और सूचना दी ।
चरण 2 के लिए, हम परीक्षण 1% कम पिघलने agarose में अंतिम धुलाई चरणों के बाद भ्रूण embedding एक ३५ mm ग्लास पर घुड़सवार-नीचे पकवान और फिर यह के साथ टॉपिंग ~ 10 µ बढ़ते माध्यम के एल । यह एंबेडिंग विधि काम करती है और भ्रूण और संबद्ध संरचनाओं के मूल 3d संरचना को बरकरार रखता है; हालांकि, एक multiphoton माइक्रोस्कोप छवि के लिए आवश्यक नमूना है क्योंकि एक नियमित रूप से फोकल माइक्रोस्कोप बरकरार भ्रूण (~ 1 मिमी) में गहरी के रूप में नहीं पहुंच सकता ।
हम मानते है कि इन दो तकनीकों का प्रयोग सामांय विकास के दौरान और म्यूटेंट में जो इन संरचनाओं के गठन में दोष दिखाने के दौरान नोड और notochordal प्लेट की संरचना पर पूरक जानकारी देता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
H.B. चिकित्सा संकाय और कोलोन विश्वविद्यालय के SFB829 से स्टार्टअप फंडिंग द्वारा समर्थित है । C.X. DFG अनुदान बीए 5810/1-1 द्वारा समर्थित है । हम CECAD अनुसंधान केंद्र और मेमोरियल Sloan Kettering कैंसर सेंटर (ंयूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका) में इमेजिंग सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । हम Joaquín Grego-Bessa (हृदय अनुसंधान के लिए स्पेनिश राष्ट्रीय केंद्र, मैड्रिड, स्पेन) WMIF के लिए भ्रूण बढ़ते पर अपनी अंतर्दृष्टि के लिए धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
References
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