Summary
Den noden och notochordal plattan är övergående signalering arrangörer i utveckla musembryon som kan visualiseras med hjälp av flera tekniker. Här beskriver vi i detalj hur du utför två av teknikerna för att studera deras struktur och morfogenes: 1) svepelektronmikroskopi (SEM); och 2) hela mount immunofluorescens (WMIF).
Abstract
Efter implantation mus embryot genomgår stora formförändringar efter inledningen av gastrulation och morfogenes. Ett signum för morfogenes är bildandet av övergående arrangörerna, den noden och notochordal plattan, från celler som har passerat genom den primitiva drag. Ordentlig bildandet av dessa signalering centra är viktigt för utvecklingen av kroppen planen och tekniker att visualisera dem är av stort intresse för mus utvecklingsmässiga biologer. Den noden och notochordal plattan ligga på den ventrala yta gastrulating musembryon runt embryonala dag (E) 7,5 utveckling. Noden är en skålformade struktur vars celler besitter en enda smal cilie varje. Den ordentlig subcellulär lokalisering och rotation av flimmerhåren i noden gropen bestämmer vänster höger asymmetri. Notochordal platta celler besitter också enda cilier om än kortare än de av nod cellerna. Notochordal plattan bildar den ryggsträng som fungerar som en viktig signalering arrangör för somitogenesis och neurala mönster. Eftersom cellerna i den noden och notochordal plattan är övergående närvarande på ytan och besitter cilier, kan de visualiseras med hjälp av scanning electron microscopy (SEM). Bland andra tekniker som används för att visualisera dessa strukturer på cellnivå är hela berget immunofluorescens (WMIF) med hjälp av antikroppar mot de proteiner som uttrycks mycket i nod och notochordal tallrik. I den här rapporten beskriver vi vår optimerade protokoll för att utföra SEM och WMIF på den noden och notochordal plåt i framkallande musembryon till hjälp i bedömningen av vävnad form och cellulära organisation i vildtyp och gastrulation mutant embryon.
Introduction
Gastrulation och medföljande morphogenetic rörelser är avgörande för att forma mus embryo1. Förändringar i cellulära form och organisation under morfogenes diktera positionell information för att reglera cellen öde och även tillåta de efterföljande signalvägar just utföra sina funktioner för att diversifiera den nybildade groddar lager1. Bildandet av övergående organisera strukturer och signalering centra som nod och ryggsträng är nödvändigt för utförandet av den utvecklande program2. Utvecklingsmässiga biologer har använt en mängd olika tekniker för att studera morfogenes av dessa strukturer, mest anmärkningsvärda är användningen av cellulära reportrar och levande ex vivo imaging för att följa dynamiken i cellulär och subcellulär beteende2 ,3,4. I detta betänkande, vi fokuserar på att beskriva detaljerna i våra optimerade protokoll för två av dessa tekniker: scanning electron microscopy (SEM) och hela berget immunofluorescens (WMIF), som var och är fortfarande avgörande för studera morfogenes av noden och notochordal plattan, föregångaren till ryggsträng.
Noden mus embryonala är en droppformad kopp av celler som ligger på ventrala ytan av mus embryot runt början till sena huvud fold stadier under gastrulation och morfogenes (embryonala dag, E7.5-E8)2,5, 6,7. Notochordal plattan utgår morfologiskt anteriorly från nod3. Varje cell i nod och notochordal plattan karakteriseras av en enda cilie som sticker ut på utsidan, som är längre i noden celler men vars längd varierar med utvecklingsstadier2. Rotation av cilier i noden gropen har visat sig vara viktigt för signalering som avgör vänster höger asymmetri4. Notochordal plattan är föregångaren till ryggsträng, signalering centrum som är viktig för mönstringen av de intilliggande thoraxsegmenten och överliggande neuralrörsdefekter3.
På grund av attributen för läge (yta), form (cup) och som har tydliga yttre cellulära strukturer (cilier), har SEM traditionellt använts för att visualisera nod och notochordal plattan och studera deras bildning och struktur2, 7. SEM används också för att studera förändringarna i strukturen av noden själv eller flimmerhår på dess celler i mutationer som påverkar gastrulation, morfogenes, samt flimmerhår bildas8,9,10. SEM är en teknik som använder en fokuserade strålen av elektroner att förhöra den topologiska ultrastruktur av den yttre ytan av material såsom biologiska prover11. Provet är oftast fast, torkas och sedan fräsande-belagda med metaller för observation under ett svepelektronmikroskop som vi beskriver i steg 1.
WMIF är en färgning teknik för att visualisera genprodukter, såsom proteiner, i tre dimensioner (3D). WMIF av vävnader, organ eller ens hela organismer ger rumslig information om fördelningen av signalen och formen på den resulterande strukturen i 3D. Tekniken bygger på att åtgärda provet sedan färgning det med fluorescerande konjugat. Mus embryon ~ E7.5 är små och transparent och därför idealisk för WMIF protokoll att visualisera den noden och notochordal tallrik. Till exempel den transkriptionsfaktor som Barchyury (T) uttrycks i kärnor av nod och notochordal tallrik, och i mindre utsträckning i de primitiva strimma, runt E7.5-E8 av embryonal utveckling och bra fungerande antikroppar mot T av WMIF är kommersiellt tillgängliga och göra färgningsproceduren möjligt. Cellerna på den noden och notochordal tallrik kännetecknas också av förträngda apical ytbehandlar, som möta på utsidan och därmed kan färgas med fluorescens-konjugerad Phalloidin till varumärket F-aktin de apikala sammandragningar. Med dessa reagenser som exempel, ger en kombination av T och F-aktin färgning av WMIF en representation av den noden och notochordal pläterar i 3D i gastrulating musembryon som vi visar i steg 2 8. Markörer av cilier, såsom ARL13B eller acetylerade tubulin, samt andra markörer för den nod och notochordal tallrik, såsom FOXA2, kan dock också användas för att utföra WMIF på utveckla mus embryon3,4.
Vi har visat att striatin-interagera protein 1 (STRIP1) är viktigt för normal gastrulation och morfogenes i mus embryot8. STRIP1 är en kärnkomponent i den striatin-interagera fosfataser och kinaser komplex (STRIPAK), som vi och andra har inblandade i aktin cytoskelettet organisation8,12. En större defekt i Strip1 mutant embryon är i bildandet av axial mesoderm (nod och notochordal tallrik) och förlängning av ryggsköldens kropp axeln. Vi har använt SEM och WMIF för att analysera den noden och notochordal tallrik med vildtyp (WT) och Strip1 mutant embryon som vi visar i Representativa resultat och motsvarande siffror.
Protocol
Alla experiment som involverar djurförsök godkändes av de ansvariga myndigheterna i Rhein-Westfalen (LANUV-NRW).
1. svepelektronmikroskopi för noden mus embryonala
- Offra gravida kvinnliga musen på ~ E7.5 (2-4 somite skede) av cervikal dislokation. En detaljerad förklaring med diagram av steg 1,1 - 1.7 finns i mus embryo laboratorium handböcker13.
- Öppna buken genom huden och mesenteries och ta bort livmodern med hjälp av sax och fin pincett.
- Skölj livmodern kort i destillerat vatten och placera den i en liten ren petriskål (6 cm) som innehåller 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Under en dissekera mikroskopet och använder fin pincett, ta bort livmodern musklerna för att frigöra den enskilda deciduae eller implantationsställen.
- Håll varje decidua med ett par pincett och Använd det andra paret för att gör en längsgående fullhudsskador snitt mellan den röda delen (framtida moderkakan) och vita delen (där embryot är belägen). Göra ytliga perforeringar lodrätt längs den vita delen av decidua sammanhängande med snittet. Dra decidua isär horisontellt i två halvor och noggrant ösa ut embryot i den vita delen av decidua.
- Överföra embryot till en ny petriskål (35 mm) med färska steril-filtrerad PBS. Upprepa för alla deciduae och embryon.
- Ta bort Reicherts membran, en relativt ogenomskinlig membran omvärvande embryot, från varje embryo av bråkade det som bort en strumpa som börjar på ectoplacental konen (rödaktig implanteringsstället). För genotypning, ta en liten bit (~ 0,1 mm2) av gulesäcken i detta skede.
- Under en kemisk huva och bär lämpligt skydd (handskar), överföra embryon till EM grade fixativ består av 2,5% glutaraldehyd i steril-filtrerad PBS i en mikrocentrifug (1,5 mL) rör vid rumstemperatur. Fixa embryon över natten vid 4 ° C.
- Försiktigt bort glutaraldehyd fixeringsvätskan från röret utan att vidröra embryona och kasta i en lämplig avfallsbehållare. Tvätta embryona tre gånger i steril-filtrerad PBS, 15 min varje vid rumstemperatur.
- Torkar embryona i en etanol-serien för 5 min varje: 50%, 70%, 85% och tre gånger i 100% eller absolut etanol. Lagra embryon vid −20 ° C i etanol eller fortsätta direkt till nästa steg.
- Överföra embryon i etanol till korgar för kritisk punkt torkning (CPD) i en kritisk punkt hårtork maskin. Fyll i kammaren med etanol att täcka korgarna helt.
- Utbyte av etanol genom att försiktigt spola med flytande CO2 för tio gånger på 10 ° C. Rinna av flytande CO2 efter det sista steget tills kammaren är halvfullt. Värm upp till 40 ° C tills trycket når 80 barer (den kritiska punkten) och den flytande CO2 ändras till gas. Vänta 10 min sedan långsamt blåsa av gasen över ca 45 min.
- Som ett lättare alternativ till fortbildning för torkning, lägga till hexamethyldisilazane (HMDS) i förhållandet 1:1 till att embryon i etanol i 30 min. Sedan överföra embryon till ren HMDS för 30 min. ta bort embryon ur vätskan med pipett och låt dem torka i 30 min.
Obs: Båda torkningsmetoder fungerade lika bra i våra händer. - Använd en fin pensel och montera de torkade embryona med den ventrala sidan (nod) upp på en SEM påbörjad med dubbelhäftande tejp.
- Infoga stubbar med embryon i en fräsande bestrykningsmaskin för guld partikel beläggning, som är att föredra att debitera lång tunn flimmerhåren. Applicera ett lager av 120-150 Å; tiden är beroende av den aktuella, som varierar med varje prov.
- Placera de belagda stubbar med embryon i ett SEM Mikroskop, tillämpa vakuum och iaktta de embryonala nod och notochordal platta celler med cilier vid förstoringar alltifrån 1000 X till 15, 000 X.
2. hela Mount immunofluorescens mus nod och Notochordal tallrik
- Med iskall PBS med 0,05% Följ Tween-20 (PBSTw), steg 1,1-1.7 ovan ta bort embryon på E7.75 och placera dem i PBSTw i en 35 mm petriskål på is.
- Under en kemisk huva och bär lämpligt skydd (handskar), överföra embryon till en fixativ lösning av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i en mikrocentrifug rör. Fixa embryon över natten vid 4 ° C.
- Försiktigt bort PARAFORMALDEHYD fixeringsvätskan från röret utan att vidröra embryona och kasta i en lämplig avfallsbehållare. Tvätta embryona tre gånger i PBS som innehåller 0,2% Triton x-100 (PBSTr) under 5 minuter i rumstemperatur. Utföra alla wash och nästa inkubationsstegen på en nutating shaker.
- Ta bort den sista tvättningen och Lägg blockerande lösning innehållande PBSTr med 10% Värmeinaktiverade serum (från värdarter av sekundär antikropp). Block från 2 h till över natten (eller längre) på en nutator vid 4 ° C.
- Ta bort blockering och lägga till ~ 1 mL av den primära antikroppen utspätt i blockering lösning, till exempel en anti-T antikropp vid spädning 1: 500. Inkubera över natten (eller längre) på en nutator vid 4 ° C.
- Ta bort den primära antikroppen och spara den för senare användning genom att lägga till natriumazid till en slutlig koncentration av 0,02% (1 µL 20% lager 1 ml av antikropp lösning). Antikroppen kan återanvändas ~ 10 gånger. Skölj embryona två gånger med PBSTr och sedan tvätta dem tre gånger under 30 minuter varje på en nutator vid 4 ° C.
- Ersätta tvätten med en fluorescens-konjugerad sekundär antikropp, mot primär antikropp värd arten, utspätt till ~ 1: 1000 över natten (eller längre) på en nutator vid 4 ° C.
- Ta bort sekundära antikroppen och skölj två gånger med PBSTr och sedan tvätta tre gånger för 30 min med PBSTr.
- Ersätta den sista tvättningen med PBSTr som innehåller 1: 500 fluorescens-konjugerad phalloidin, färga F-aktin och 1: 1000 DAPI, för att färga kärnor, för 1 h i rumstemperatur.
- Skölj två gånger i PBSTr och tvätta en gång med PBSTr för 30 min i rumstemperatur.
- Ersätt PBSTr med PBS och lämnar embryona på is. Förbered rena positivt laddade bilder (60 x 24 mm) och coverslips (24 x 24 mm) och vattenhaltiga glycerol-baserade montering media, exempelvis 90% glycerol i 1xPBS och ett antifade reagens, montera embryon.
- Lägg två bitar av genomskinlig tape på ett avstånd av ~ 15 mm från varandra på den klara delen av bilden. Detta kommer att skapa tillräckligt 3D-rymden (i dimensionen Z) som skulle tillåta plattas embryon men inte fullständigt Mosa dem.
- I dissekera Mikroskop, flytta försiktigt embryon med skurna P200 pipett (för att tillåta tillräckligt med utrymme för embryot att överföras och inte skadad) i bilden.
- Med fin pincett, göra två full nedskärningar på laterala sidorna av gulesäcken att veckla upp embryot. Placera embryot med den ventrala sida (nod och notochordal tallrik) upp (dorsala av neuralrörsdefekter ned på bilden).
- Tillsätt 50 µL av montering media på embryot. Plats 4-5 embryon per bild. Lägg en klick av montering av media på sidan av täckglaset som kommer först tryck i bilden (övre eller nedre sida), sedan placera den gränsöverskridande två bitar av tejp och sänk ner den sakta på embryon med fin pincett eller en böjd fin nål samtidigt undvika skapar luftbubblor.
- Ren överskott montering media med en absorberande torka. Var noga med att inte flytta täckglaset i processen.
- Med en generös mängd av nagellack, täta sidorna av täckglaset utan att flytta den.
- Observera i skanning confocal Mikroskop.
Representative Results
För att undersöka bildandet av noden i WT och Strip1 mutant embryon på ~ E7.5, vi använde SEM som beskrivs i steg 1 och visas i figur 18. Ultrastrukturella detaljerna av utanför topologi använder SEM var ganska informativ och det stod omedelbart klart att de muterade embryona till skillnad från noden pit-formade i WT embryon hade en tillplattad och oregelbundna nod. Högre förstoring av embryon visade karakteristiska flimmerhår på noden celler som identifierat dem otvetydigt. Flimmerhåren i mutant skenbara lägre densitet kan tillskrivas förlusten av nod grop struktur och krökning eller ett lägre antal nod celler. Notochordal plattan som visas som härrör från noden var också oregelbundna i mutant embryon. De var identifierbar med sin kortare cilier. SEM var därför viktigt att avslöja nod morfogenes defekter i Strip1 mutanter8. Vi har också använt SEM i tidigare studier för att Visa avsaknad av cilier i noden embryonala av mutanter som saknade centrioles, som tillhandahåller mallen för flimmerhåren9.
För att studera de axiella mesoderm bildandet fabrikations- Strip1 mutant embryon på cellnivå, använde vi WMIF som beskrivs i steg 2 och visas i figur 2. Med denna teknik, var den noden och notochordal plattan lätt identifieras genom F-aktin och T färgning. WT-nod och notochordal platta celler har förträngda apikala domäner där F-aktin berikas, och nukleär T färgning var tydlig. Notochordal plattan extended rostrally i WT men var korta och oregelbundna i mutant. Data visade att F-aktin organisation är onormal i olika groddar lager av muterade embryon inklusive den axiella mesoderm8. Således bidrog WMIF till att studera defekter i nod och notochordal tallrik formation i Strip1 mutant embryon.
Figur 1 . Svepelektronmikroskopi avslöjar brister i noden morfogenes i Strip1 mutant musembryon. (Överst) SEM analyser av WT och Strip1 mutant ventrala embryonala noder och notochordal plattor (Noto)8. Ett exempel på en låg förstoring bild av ett WT embryo visas till vänster. (Botten) Större förstoring av centrera av noderna visas på topp avslöjar den långa monocilia projicering från noden cellerna. Anterior är upp i alla paneler. Skala barer: 30 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 . Hela berget immunofluorescens visar onormal nod och notochordal plattan på cellnivå i Strip1 mutant embryon. (Överst) Ventrala 3D rendering (Volocity programvara) av WMIF på WT och Strip1 mutant embryon med en kombination av fluorescens-konjugerad phalloidin (F-aktin, röd) och T antikropp (grön) färgning. (Botten) Fler exempel på färgningen visas ovan med fokus på noden med högre zoom och inklusive DAPI. Anterior är upp i alla paneler. Skala barer: 30 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Discussion
I detta arbete visar vi hur du utföra SEM och WMIF för att visualisera mus embryonala nod och notochordal tallrik. Den lilla storleken på gastrulating musembryon ~ E7.5 och förekomsten av dessa strukturer på ytan gör dem idealiska att studera med hjälp av tekniker beskrivs2,7,8. Tillgången på bra antikroppar, såsom T och flimmerhåren markörer, ger utmärkt 3D-information med hjälp av WMIF på struktur, organisation och bildandet av dessa väsentliga embryonala arrangörerna8.
Eftersom musen embryonal utveckling fortsätter i mycket snabb takt och den noden och notochordal plattan är endast övergående finns på ytan av embryot, är timing viktigt för att lyckas med dessa experiment2,3. Exempelvis är 2-4 somite embryon bra för SEM-analys av en mogen nod grop med långa cilier. I mycket tidigare eller senare embryon (exempelvis 12 h före eller efter), kan noden inte vara närvarande på ytan. WMIF är lite mer flexibla i detta avseende men strukturer själva är också övergående under utveckling och tidpunkten i detta fall beror på forskarnas intressen.
Renhet av reagenser är också viktigt för att lyckas med dessa tekniker, särskilt i sondera ultrastruktur av SEM. Tiny föroreningar som fastnar embryona oftast resultera i enorma artefakter.
Vi har testat två olika metoder för embryo fixering för SEM ett med halv Karnovskys fixativ (2,5% glutaraldehyd, 2% PARAFORMALDEHYD och 0,1 M cacodylate buffert) och en enklare 2,5% glutaraldehyd i 1 x PBS. Vi föredrar att använda glutaraldehyd och PBS fixativ som beskrivs i steg 1, men vi och andra har också använt den halva Karnovskys fixativ framgångsrikt för SEM.
Vi har också jämfört två metoder för torkning embryon för SEM och fann ingen skillnad i kvaliteten på provet med hjälp av en kritisk punkt torktumlare eller HMDS som beskrivs i steg 1 och redovisas på annat håll14.
För steg 2, vi testade inbäddning embryon efter sista tvätt stegen i 1% agaros som låg smälttemperatur monterad på en 35 mm glasbotten maträtt och sedan toppade det med ~ 10 µL monteringsmedium. Denna inbäddning metod fungerar och bevarar den ursprungliga 3D-strukturen för embryot och associerade strukturer. multiphoton Mikroskop krävs dock att bilden preparatet eftersom regelbundna confocal Mikroskop inte kan nå så djupt in i de intakta embryona (~ 1 mm).
Vi tror att använda dessa två tekniker ger kompletterande information om strukturen på noden och notochordal plattan under normala utveckling och mutanter som visar defekter i bildandet av dessa strukturer.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
H.B. stöds av start finansiering från den medicinska fakulteten och SFB829 av universitetar av Cologne. C.X. stöds av DFG bevilja BA 5810/1-1. Vi vill tacka Imaging faciliteterna på CECAD research center och Memorial Sloan Kettering Cancer Center (New York, USA). Vi tackar Joaquín Grego-Bessa (spanska National Center för kardiovaskulär forskning, Madrid, Spanien) för hans insikt om montering embryon för WMIF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
References
- Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).
- Lee, J. D., Anderson, K. V. Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse. Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).
- Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions. Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).
- Yoshiba, S., et al. Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2. Science. , (2012).
- Jurand, A. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).
- Poelmann, R. E. The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo. Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).
- Sulik, K., et al. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).
- Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).
- Bazzi, H., Anderson, K. V. Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).
- Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- McMullan, D. Scanning electron microscopy 1928-1965. Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).
- Bai, S. W., et al. Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration. BMC Biology. 9, (2011).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Harb Lab Press. , (2014).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186, Pt 1 84-87 (1997).
