Summary
いくつかのテクニックを使用して視覚化することができますマウス初期胚のオーガナイザーをシグナリング過渡では脊索板とノードです。ここでは、我々 は詳細にその構造と形態形成を研究する技術の 2 つを行う方法をについて説明: 1) 走査電子顕微鏡 (SEM);2) 全台紙蛍光 (WMIF)。
Abstract
マウスの着床後胚原腸陥入と形態形成の開始後主要な形状変化を経る。形態形成の特徴一時的な主催者は、ノードおよび原始線条を通過した細胞から、脊索板の形成であります。これらのシグナリング センターの適切な形成はボディ計画の開発に不可欠なそれらを可視化する技術がマウス発達生物学者に関心の高い。ノードと脊索板日 (E) 7.5 開発の周りの gastrulating のマウス胚の腹側表面にうそをつきます。ノードは、そのセルを所有、単一細長い繊毛各カップの形の構造です。適切な細胞内局在とノード ピットで繊毛の回転、左右非対称性を決定します。ノード細胞のそれらより短いとはいえ、脊索板セルは、また孤立線毛を所有しています。脊索板とニューラル パターンの重要なシグナリング主催者として機能する脊索を形成します。ノードや脊索板の細胞一過性の表面にある繊毛を持っているので、彼らは走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して視覚化できます。などのテクニックを使用して視覚化する細胞レベルでこれらの構造はノードと脊索板で高発現している蛋白に対する抗体を用いた全台紙蛍光 (WMIF) です。本報告では、マウス胚組織形状と野生型の細胞組織の評価のために、突然変異体の胚の原腸陥入の SEM およびノードと脊索板の WMIF を実行する私たちの最適化されたプロトコルについて述べる。
Introduction
原腸陥入とそれに伴う形態形成運動マウス胚1を形成するために重要です。細胞の形状と形態形成における組織の変化は、細胞の運命を調節し、また正確に新たに形成された胚芽層1を多様化する彼らの機能を実行するその後のシグナル伝達経路を許可に位置情報を指示します。発達プログラム2の実行は一時的な構造を整理してシグナル センター ノードと脊索などの形成が欠かせません。発達生物学者はこれらの構造は、携帯電話の記者とライブ前のヴィヴォ細胞および細胞レベル下の動作2 のダイナミクスに従うイメージングの使用であるの最も顕著な形態形成を研究するのにさまざまなテクニックを使用しています。 ,3,4。このレポートは、最適化されたプロトコルの詳細を説明するこれらの技術の 2 つの焦点: 走査電子顕微鏡 (SEM) と全台紙蛍光 (WMIF) が、まだノードの形態形成の研究に尽力脊索板、脊索の前駆体。
マウス胚ノードは原腸陥入と形態形成 (萌芽期日、E7.5 E8) 中後期ヘッド倍上旬頃マウス胚の腹側表面にある細胞のティア ドロップ型のカップ2,5、 6,7。脊索板形態学的ノード3から前方は生まれない。ノードと脊索板内の各セルは、節細胞で、長いが、長さが異なる発達段階2外に突き出ている単一の繊毛によって特徴付けられます。ノードのピットで繊毛の回転は、左右非対称性4を決定するシグナリングのために重要であると示されています。脊索板脊索、隣接する体節と覆っている神経管3のパターンの重要なシグナリング センターの前駆体であります。
場所 (表面)、形状 (カップ) と異なる外側の細胞構造 (繊毛) 所有している属性のため SEM 伝統的に使用されているノードと脊索板を視覚化し、研究の形成と構造の2,7. SEM、ノード自体またはその繊毛形成8,9,10と同様、原腸陥入、形態形成に影響を与える突然変異細胞の繊毛の構造の変化を分析する使用もします。SEM は、生体試料11等の外面のトポロジカルな微細構造を調査する電子の集束ビームを利用する手法です。サンプルは通常固定、乾燥し、スパッタ - 金属被覆走査型電子顕微鏡下で観察のステップ 1 で説明するよう。
WMIF は、3 次元 (3 D) でタンパク質などの遺伝子産物を視覚化する染色法です。組織や臓器全体の生物の WMIF は、3 D で得られた構造の形状と信号の分布に関する空間情報を提供します。技術は、蛍光の抱合体と染色サンプルの修正に基づいています。マウス胎 〜 E7.5 は小さいと透明な WMIF プロトコル ノードと脊索板を視覚化するための理想的な。たとえば、Barchyury (T) がノードと脊索板と胚の発育の良い作業抗体 WMIF T E7.5 E8 の周りの原始線条の程度の核で発現は転写因子は、市販利用可能な汚損プロシージャを可能にして。ノードや脊索板の細胞も、外側に直面し、こうして、根尖狭窄部でマーク F アクチンを蛍光標識ファロイジンと汚されることができる収縮頂端表面によって特徴付けられます。T と F アクチンの WMIF による染色の組み合わせ例としてこれらの試薬を使用して、ノードおよび 3 D gastrulating マウス胚における脊索板の表現ステップ 2 8で説明とを提供します。ただし、ノードと脊索板など FOXA2 の他の印と同様、ARL13B またはアセチル化チューブリンなどの繊毛のマーカーは成長マウス胚3,4で WMIF を実行するも使用できます。
私たちは striatin と相互作用する蛋白質 1 (STRIP1) は通常原腸陥入と8マウス胚の形態形成に不可欠なことを示しています。STRIP1 は striatin と相互作用するホスファターゼと私たちと他の人がアクチン細胞骨格組織8,12に関与するキナーゼ複合体 (STRIPAK) のコア コンポーネントです。Strip1変異胚の主要な欠陥は、(ノードと脊索板) 軸中胚葉の形成と前後の体軸の延長です。代表結果と対応する図に示すようにノードおよび野生型 (WT) とStrip1変異胚における脊索板を分析する SEM と WMIF を使いました。
Protocol
動物実験を含むすべての実験は、北ライン ヴェストファーレン (NRW-LANUV) に責任がある権限によって承認されました。
1. マウス胚ノードの電子顕微鏡
- 妊娠中の雌マウスを犠牲 ~ 頚部転位によって E7.5 (2-4 体節期)。手順 1.1 - の図と詳細な説明 1.7 マウス胚研究室マニュアル13で利用可能です。
- 皮膚と mesenteries を介して腹部を開け、はさみおよび微細鉗子を使用して子宮を取り外します。
- 蒸留水で簡単に子宮をすすぎ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 を含む小さなきれいなペトリ皿 (6 cm) に置きます。
- 解剖顕微鏡、微細鉗子を使用して、[には、無料個別 deciduae または着床する子宮の筋肉を削除します。
- 1 組の鉗子で各脱落膜を押し、他のペアを使用して、赤い部分 (将来胎盤) と白い部分 (胚が配置されて) の間縦全層切開を行います。脱落膜の白い部分に沿って垂直方向に表面の穿孔は切開と連続してください。脱落膜を 2 つの半分に水平方向に離れて引っ張るし、慎重に両名の白い部分で胎児をかき出します。
- 新鮮な無菌ろ過 PBS で新しいペトリ皿 (35 mm) に胚を転送します。すべての deciduae/胚に対して繰り返します。
- ライヘルトの膜を削除、胚を巻き込む比較的不透明な膜、いじめによってそれぞれの胚からそれまで好きで胎盤円錐 (赤味がかった注入サイト) から始まる靴下。ジェノタイピング、小さな作品を取る (〜 0.1 mm2) この段階での卵黄嚢の。
- 化学フードと適切な保護 (手袋) を着て、室温で遠心 (1.5 mL) チューブ フィルター滅菌 PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで構成される EM グレード定着剤に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。
- 慎重にチューブから胚を触れることがなくグルタルアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。胚を 3 回洗浄滅菌フィルターの pbs は、室温で 15 分間。
- 5 分間エタノール シリーズで胚を脱水: 50%、70%、85%、100% または無水エタノールで 3 回。エタノールに − 20 ° C で胚を格納したり、次のステップに進みます。
- 臨界点の臨界点乾燥機 (CPD) を乾燥のためのバスケットにエタノールで胚を転送します。バスケットを完全にカバーするエタノールで部屋を埋めます。
- 慎重に 10 ° C で 10 倍の液体 CO2でフラッシュすることにより、エタノールを交換します。商工会議所が半分になるまで、最後のステップ後液体 CO2を切る。40 ° C を熱圧力 80 バー (臨界点) に達すると、液体 CO2ガスに変わるまで。10 分間待ってから、ゆっくりと約 45 分以上のガスを吹き飛ばします。
- 乾燥の CPD に簡単に代わりに、30 分のためのエタノールの胚を 1:1 の比率でヘキサメチルジシラザン (HMDS) を追加します。30 分削除の純粋な HMD にピペットを使用して液体のうち胚の胚を転送し、30 分間乾燥するままにします。
注: 両方の乾燥方法は均等に働いても私たちの手で。 - 両面テープの SEM スタブを乾燥胚腹側 (ノード) でマウントするのに細かいブラシを使用します。
- 長く細い繊毛を充電するため好まれる金粒子コーティング スパッタ コーティング マシンに胚とスタブを挿入します。120-150 の層を適用する Å;時間は各サンプルに異なります電流に依存しています。
- SEM 顕微鏡に胚とコーティングされたスタブを配置、真空を適用し、萌芽期ノードと倍率 1000 倍から 15 に至るまでに繊毛を持つ脊索細胞観察 000 X。
2. 全体のマウント蛍光マウス ノードと脊索板の
- 0.05% で氷冷 PBS を使用してトゥイーン 20 (PBSTw) は、E7.75 で胚を削除し、PBSTw で 35 mm シャーレ氷の上に置いて 1.1 1.7 上記手順に従います。
- 化学のフードと適切な保護 (手袋) を着て、下の微量遠心チューブに PBS で 4% パラホルムアルデヒド固定液に胚を転送します。4 ° C で一晩胚を修正します。
- 慎重にチューブから胚を触れることがなくパラホルムアルデヒド固定液を削除し、適切な廃棄容器に捨てます。0.2% を含む PBS で胚を 3 回洗浄トリトン X-100 (PBSTr) 室温で 5 分間。ならびにシェーカーにすべての洗浄およびインキュベーション、次の手順を実行します。
- 最後の洗浄を削除し、(二次抗体のホスト種) から 10% 熱非動化血清ブロッキング溶液 PBSTr を追加します。2 h からブロックに一晩 (以上) の 4 ° C で nutator
- ブロックを削除し、追加 〜 1 mL ソリューション 1: 500 希釈でたとえば抗体抗 T ブロックで希釈した一次抗体の。4 ° C で nutator の一夜 (またはそれ以上) を孵化させなさい
- 一次抗体を削除し、0.02% (20% 株式抗体溶液の 1 mL を 1 μ L) の最終的な集中にアジ化ナトリウムを追加して後で使用のために保存します。抗体は再利用できる ~ 10 回。PBSTr で 2 回胚を洗い、4 ° C で nutator に各 30 分の 3 回洗い、そして
- 洗浄を置き換えますで希釈した一次抗体のホスト種に対して、蛍光標識二次抗体 ~ 1: 1000 オーバー ナイト (以上) 4 ° C で nutator に
- 二次抗体を削除し、PBSTr、そして PBSTr で 30 分間、3 回洗浄で二回リンスします。
- 最後の洗浄を室温で 1 時間の核を染色する F-アクチンと 1: 1000、DAPI 染色する 1: 500 蛍光標識ファロイジンを含む PBSTr に置き換えます。
- PBSTr で二度洗い、室温で 30 分間 PBSTr で 1 回洗浄します。
- PBS の PBSTr を交換し、氷に胚を残します。水グリセリン ベース土台メディア、たとえば、1xPBS で 90% のグリセロール、胚をマウントするための antifade 試薬と coverslips (24 × 24 mm) きれいな正荷電のスライド (60 × 24 mm) を準備します。
- 距離で明確なテープの 2 つの部分を入れて 〜 15 mm スライドの明確な部分でお互いから。これは、胚を平坦化、それらを完全につぶしになります (Z 軸) の十分の 3 D 空間が作成されます。
- 解剖顕微鏡の下で慎重にスライドする (転送して破損していない胎児に十分なスペースを許可する) にカット P200 ピペットを用いた胚に移動します。
- 微細鉗子を使用して、胚を展開する卵黄嚢の横側に 2 つの完全カットを作る。(スライド上を神経管の背側)を腹側 (ノードと脊索板) を持つ胚を配置します。
- 胚にメディアをマウントの 50 μ L を追加します。スライドあたり 4-5 胚を配置します。まずタッチ スライド (上部または下部側)、テープの 2 つの部分をまたぐ配置し空気泡を作成を回避しながら微細鉗子または曲がった細い針を用いた胚の上にゆっくりと下ろします、coverslip の側にメディアのマウントを塗りを追加します。
- 吸収のワイプを使用して余分なマウント メディアをクリーニングします。プロセスで、coverslip を移動しないように注意してください。
- マニキュアの寛大な量を使用して、それを移動することがなく、coverslip の側面をシールします。
- 走査型共焦点顕微鏡の下で観察します。
Representative Results
WT とStrip1変異胚内のノードの形成を調べるために 〜 E7.5、ステップ 1 に記載されていると図 18に示すように SEM を使いました。SEM を使用して外部のトポロジの微細構造の詳細が非常に有益と WT 胚のピット状ノードとは異なり変異体の胚が平坦化され、不規則なノードはすぐに明らかだった。胚の高倍率は、それらを明確に識別されるノード細胞の特性の繊毛を示した。突然変異体の繊毛の明白な低密度は、ノード ピット構造および曲率またはノード細胞の数を減らすの損失に起因する可能性があります。ノードから発せられる表れる脊索板も突然変異体の胚に定期的だった。彼らは彼らの短い繊毛を特定しました。したがって、SEM はStrip1変異体8ノード形態の欠陥を明らかにすることが重要だった。また使いました SEM 従来繊毛9のテンプレートを提供する由来を欠いていた突然変異体の胚のノードに繊毛の不在を表示します。
細胞レベルでStrip1変異胚軸中胚葉形成欠陥を調査するには、手順 2 に記載されている、図 2に示すように WMIF を使用しました。この手法を使用して、ノードと脊索板が簡単に識別 F アクチンと T 染色により。WT ノードと脊索細胞が収縮する F アクチンが濃縮された、明らかにされた T 染色性が核アピカル ドメイン。脊索板、WT に吻方に延長が短く、不規則な突然変異体に。データは、F-アクチン組織が変異胚軸中胚葉8などのさまざまな細菌層の異常を示した。したがって、WMIF は、ノードの欠陥とStrip1変異胚における脊索板形成に関する研究に尽力しました。
図 1.Strip1変異マウス胚におけるノードの形態形成における欠陥を明らかにする走査電子顕微鏡観察します。(Top)WT とStrip1変異腹壁胚ノードと脊索板 (能登)8の SEM 解析。WT 胚の低倍率画像の例は、左側に表示されます。(下)上節細胞から突出して長い monocilia を明らかに示すようなノードの中心の高倍率。前方は、すべてのパネルを。スケール バー: 30 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.全台紙蛍光Strip1変異胚の異常なノードと細胞レベルで脊索のプレートを示しています。(Top)腹側の 3 D レンダリング (ソフトウェア Volocity) WMIF WT とStrip1変異胚蛍光標識ファロイジン (F アクチン、赤) と T (グリーン) 抗体染色の組み合わせを使用して。(下)染色以上のズームを持つノードに焦点を当て、DAPI を含む上記のより多くの例。前方は、すべてのパネルを。スケール バー: 30 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
今回、マウス胚ノードと脊索板を視覚化する SEM および WMIF を実行する方法を示します。Gastrulating マウス胚の小型 ~ E7.5 と表面にこれらの構造の存在は、それらが技術説明2,7、8を使用して研究に最適。T と繊毛のマーカーなどの良い抗体の可用性は、構造、組織、これらの本質的な萌芽期主催者8の形成 WMIF を使用して優れた 3 D 情報を与えます。
マウス萌芽期の開発の非常に急速なペースで進行、ノードと脊索板のみ一過性胚の表面に存在して、のでタイミングはこれらの実験2,3の成功に不可欠。たとえば、2-4 体節胚は長い線毛を成熟したノード ピットの SEM 解析に適しています。はるか以前またはそれ以降の胚 (たとえば、12 h の前に、または後) には、ノードを表面上に存在できない場合があります。WMIF はこの点でもう少し柔軟、構造自体は、開発時にも一時的なタイミングは、ここでは研究者の興味に依存します。
試薬の純度はまたこれらの技術の成功に不可欠特に胚に固執する通常 SEM. 小さな不純物による微細構造を調査結果、巨大なアーティファクト。
SEM の 1 つの胚の固定の 2 つの異なる方法をテストしている 1x PBS で半分 Karnovsky の定着剤 (2.5% グルタルアルデヒド、2% パラホルムアルデヒドと 0.1 M cacodylate バッファー) と単純な 2.5% グルタルアルデヒドを使用します。グルタルアルデヒドと PBS 定着剤手順 1 で説明されているように使うことが望ましい、ただし、我々 と他の人も使用して半分 Karnovsky の定着剤正常に SEM のため
また臨界点乾燥機または HMD のステップ 1 に記載されてを使用して、サンプルの質に差が見られなかったし14は別途報告し SEM のための胚を乾燥の 2 つの方法を比較しました。
我々 は 1% 低融点アガロースの最終的な洗浄ステップが 35 mm ガラス底皿の上にマウントされた後に胚を埋め込むと、それからそれをトッピング テスト ステップ 2 〜 10 μ L のメディアをマウント。この埋め込みメソッドが動作し、胚の元の 3 D 構造と関連付けられた構造を保持ただし、多光子顕微鏡は通常共焦点顕微鏡はそのまま胚に深く達することができないので、供試体をイメージする必要 (~ 1 mm)。
これらの 2 つの手法を使用してノードと脊索のプレートの構造正常な開発の間に、これらの構造の形成に欠陥を示す突然変異体の相補的な情報を与えることと考えています。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ヘモグロビンは、医学部とケルン大学の SFB829 からスタートアップの資金によってサポートされます。DFG によってサポートされて C.X. BA 5810/1-1 を与えます。CECAD 研究センター、メモリアルスローンケタ リングがんセンター (ニューヨーク、米国) のイメージング施設に感謝したいと思います。ホアキン グレゴ ベッサ (スペイン国立マドリッド、スペイン心血管研究センター) は、WMIF の胚を取り付けに関する彼の洞察力を感謝いたします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,1,3,3,3 Hexamethyldisilazane (HMDS) | Carl Roth | 3840 | |
| Anti-T antibody | R&D Systems | AF2058 | |
| Critical Point Dryer | Blazers Union | CPD 020 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Glutardialdehyde solution 25% | Merck | 1042390250 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | |
| SEM coating unit PS3 | Agar Aids for Electron Microscopy | PS3 | |
| SEM microscope Quantum FEG 250 | ThermoFisher Scientific (FEI) | Quantum FEG 250 |
References
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