Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Lentiviren sind effiziente Vektoren für gen-Lieferung für Säugerzellen. Nach Transduktion Lentivirale Genom ist stabil in das Host-Chromosom integriert und werden an die Nachkommen weitergegeben. Daher sind sie ideale Vektoren für die Schaffung von stabilen Zelllinien, in Vivo Lieferung von Indikatoren und Transduktion Einzelzelle befruchtete Eier transgene Tiere zu erstellen. Aber Maus befruchtete Eier und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen Lentivirale gen Lieferung bildet. Lentiviren sind zu groß, um die Zona durchdringen und werden in der Regel durch Mikroinjektion von viralen Partikel in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen geliefert. Der Bedarf an hochqualifizierten Technologen und spezialisierte Ausrüstung hat die Verwendung von Lentiviren für gen-Lieferung an Mäuseembryonen minimiert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Maus, die befruchteten Eier durch Perforation der Zona mit einem Laser permeabilizing. Laser-Perforation führt nicht Schäden an Embryonen und Lentiviren Zugriff auf embryonale Zellen für gen Lieferung ermöglicht. Ausgestrahlt Embryonen können entwickeln sich zu Blastozysten in-vitro- und wenn bei pseudopregnant Mäusen implantiert in transgenen Welpen entwickeln. Die in diesem Protokoll verwendeten Laser ist effektiv und einfach zu bedienen. Gene stabil von Lentiviren geliefert in embryonalen Mauszellen integrieren und Keimbahn übertragbare sind. Dies ist eine alternative Methode zur Erstellung von transgenen Mäusen, die keine Mikromanipulation erfordert und Mikroinjektion von befruchteten Eiern.
Einleitung
Diese Methode bietet detaillierte Anweisungen für die Zona Pellucida der Maus befruchtete Eier permeabilizing embryonale Zellen von Lentiviren gen Lieferung zugänglich zu machen. Lentiviren sind naturgemäß für effiziente gen Lieferung für Säugerzellen ausgelegt. Sie trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und ihre Gastgeber Chromosomen1das Lentivirale Genom integrieren. Das Lentivirale Wirtszellen ist leicht durch Pseudotyping der rekombinanten Lentivirus mit vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G), aufgrund der breiten Tropismus des VSV-G Protein2erweitert. Nach Transduktion Lentivirale Gene stabil inte....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Alle tierischen Verfahren und Behandlungen, die in diesem Protokoll verwendeten wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der NIH/NIEHS Tierbetreuung und vom Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (ACUC) am NIH/NIEHS, Tier-Protokoll 2010-0004 genehmigt wurden.
1. Vorbereitungen
- Vorbereitung/Kauf rekombinante nicht propagieren Lentiviren tragen Ihre gen von Interesse. In dieser Studie, Lentivirus SBI511 mit dem Ausdruck schalenlose grün fluoreszierendes Protein (CopGFP; abgekürzt GLP) aus eine Dehnung Faktor-1a-Promoter für Transduktion verwendet wurde. Standard-Protokolle2 wurden verwendet, um zu produzier....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Entwicklung von isoliert/ausgestrahlt Maus befruchteten Eiern kann unter dem Mikroskop täglich (Abbildung 1) überprüft werden. Gesunde Embryonen entwickeln sich zu Blastozysten innerhalb von 3 – 4 Tagen. In diesem Protokoll entwickeln 60 – 70 % der unbehandelten Embryonen sich zu Blastozysten23. Aus 114 Laser perforiert ausgestrahlt Embryonen, 54 entwickelte sich zu Blastozysten (Höhe von 47 %) und 46 Blastozysten ausgedrückt GFP (46/5.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die Fähigkeit der Lentiviren, in deren Wirtsgenom integrieren macht sie einen idealen Vektor für stabile gen Lieferung. Lentivirale Vektoren können bis zu 8,5 Kilobase paar (Kbp) des genetischen Materials führen, die zellspezifische oder induzierbaren Promotern, Selektionsmarker oder fluoreszierende Moieties aufnehmen können. Eingearbeitete genomische Material kann als Bestandteil ihrer Wirtsgenom replizieren und zu äußern oder zu gewünschten Zeitpunkten deaktivieren geregelt werden. Diese Vektoren ermöglichen räumlich-z.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch die Intramural Research Program des National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt. Wir sind dankbar, Dr. Robert Petrovich und Dr. Jason Williams für kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Ratschläge. Wir möchten auch anerkennen und Dr. Bernd Gloss, der Ko-Kern, Flow Cytometry Anlage, die Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Center und die vergleichende Medizin Zweig Einrichtungen des NIEHS für ihre technische Beiträge danken. Wir möchten danken Mr David Goulding aus dem vergleichenden Medizin Zweig und Frau Lois Wyrick des Imaging Center bei NIEHS für die uns mit Fotos u....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CD510B-1-Plasmid | System Biosciences | CD510B-1 | zur Verpackung des Lentivirus, das EF1a-copGFP exprimiert |
| Dimethylpolysiloxan | Sigma | DMPS5X | zur Kultivierung von Embryonen |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | zur Entfernung von Kumuluszellen |
| XYClone Laser Hamilton | Thorne Biosciences | Perforation von befruchteten Mauseiern | |
| Gerät für den nicht-chirurgischen Embryotransfer (NSET) | ParaTechs | 60010 | NSET von Embryonen |
| KSOM medium | Millipore | MR-020P-5F | Kultivierung von Embryonen |
| Zusammensetzung von KSOM: | mg/100mL | ||
| NaCl | 555 | ||
| KCl | 18,5 | ||
| KH2PO4 | 4,75 | ||
| MgSO4 7H2O | 4,95 | ||
| CaCl2 2H2O | 25 | ||
| NaHCO3 | 210 | ||
| Glukose | 3,6 | ||
| Na-Pyruvat | 2.2 | ||
| DL-Milchsäure, Natriumsalz | 0.174mL | ||
| 10 mM EDTA | 100µ L | ||
| Streptomycin | 5 | ||
| Penicillin | 6,3 | ||
| 0,5 % Phenolrot | 0,1 ml | ||
| , L-Glutamin | 14,6 | ||
| MEM Essentielle Aminosäuren | 1 | ||
| mL MEM, nicht essentiell AA | 0,5 mL | ||
| BSA | 100 | ||
| M2 medium | Millipore | MR-015-D | Kultivierung von Embryonen |
| Zusammensetzung von M2: | mg/100mL | ||
| Calciumchlorid | 25,1 | ||
| Magnesiumsulfat (wasserfrei) | 16,5 | ||
| Kaliumchlorid | 35,6 | ||
| Kaliumphosphat, einbasisch | 16,2 | ||
| Natriumbicarbonat | 35 | ||
| Natriumchlorid | 553,2 | ||
| Albumin, Rinderfraktion | 400 | ||
| D-Glukose | 100 | ||
| Na-HEPES | 54,3 | ||
| Phenolrot | 1,1 | ||
| Brenztraubensäure | 3,6 | ||
| DL-Milchsäure | 295 |
Referenzen
- Sakuma, T., Barry, M. A., Ikeda, Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochemical Journal. 443 (3), 603-618 (2012).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 12 Unit 12 10 (2007).
- Lois, C., ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
