Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 通过共同表达一个嵌合 rna, 其中包含对病毒性支架和植物 trna 连接酶感兴趣的 rna, 在大肠杆菌中产生大量的重组 rna。主要产品是一个圆形分子, 有利于纯化到均匀性。
Abstract
随着人们对 rna 生物学的兴趣越来越大, 以及 rna 分子在复杂的生物技术应用中的应用, 产生大量重组 rna 的方法是有限的。在这里, 我们描述了一种在大肠杆菌中产生大量重组 rna 的协议, 该协议基于嵌合分子的共表达, 其中含有病毒性支架和植物 trna 连接酶中感兴趣的 rna。病毒是相对较小的, 非编码, 高度基成的圆形 rna, 具有传染性较高的植物。宿主植物 trna 连接酶是一种由属于avsunviroidae 家族的病毒体 (如茄子潜伏性病毒体 (elvd)) 所吸收的酶, 用于在病毒复制过程中介导 rna 循环。虽然 elvd 不在大肠杆菌中复制, 但 elvd 前体被大肠杆菌rna 聚合酶有效转录, 并由细菌细胞中嵌入的锤头核酶进行处理, 由此产生的单体由共表达的 trna 连接酶达到显著浓度。将感兴趣的 rna 插入 elvd 支架, 可在常规实验室条件下每升细菌培养产生数十毫克的重组 rna。rna 产物的一个主要部分是圆形的, 这一特性有助于将重组 rna 纯化到虚拟同质性。在该协议中 , 与感兴趣的 rna 相对应的互补 dna ( cdna ) 入到 elvd cdna 的特定位置 , 在表达质粒中被用来 , 沿着质粒共同表达茄子 trna 连接酶 , 来转化大肠杆菌。在强本构启动子的控制下, 这两种分子的共表达导致大量重组 rna 的产生。重组 rna 可以从细菌细胞中提取, 并利用其循环性从大量细菌 rna 中分离出来。
Introduction
与 dna 和蛋白质相比, 用于轻松、高效且经济高效地生产大量 rna 的协议并不丰富。然而, 研究和工业对这些生物分子的需求越来越大, 以研究其独特的生物特性1, 或用于复杂的生物技术应用, 包括将其用作高度特异性的2、治疗剂3种, 或选择性农药4种。体外转录和化学合成是研究的常用, 以产生 rna。然而, 当需要大量产品时, 这些方法会带来重要的限制。合理的选择是使用活细胞的内源性转录机制, 然后是一个纯化过程, 将感兴趣的 rna 与细胞同伴分开。根据这一策略, 已经开发出在细菌细胞中产生重组 rna 的方法, 如实验室友好的大肠杆菌5或海洋紫色光养的α-α-天菌6. 在细菌中产生重组 rRNA 的大多数方法依赖于本地高度稳定的 rRNA 支架的表达, 如 rrna 或 rrna, 其中插入了感兴趣的 rRNA 7。这就要求有必要释放嵌合分子感兴趣的 rna, 如果额外的 rna 的存在是下游应用的一个问题8。重组 rna 生物技术的另一个概念是生产重组核糖核酸蛋白复合物, 这些复合物本身可能是所需的产物,也可能被用作保护策略, 以提高感兴趣的 rna 的稳定性9, 10个。同样, 还建议将生产圆形区域协定作为生产更稳定产品的战略 11。
我们最近开发了一种新的方法来产生大肠杆菌中的大量重组 rna , 该方法参与了上述三个概念: 将感兴趣的 rna 插入一个高度稳定的圆形 rna 支架, 以及重组 rna 与相互作用的蛋白质, 很可能产生一个稳定的核糖核酸蛋白复合物, 积累在显着的数量在细菌细胞12。与之前的发展不同的是, 我们使用了一个与大肠杆菌完全陌生的 rna 支架, 即病毒。病毒是一种非常特殊类型的高等植物的传染因子, 完全由相对较小 (246-401 nt) 高度基对圆形 rna13组成。有趣的是, 病毒是非编码的 rna, 在没有自己蛋白质帮助的情况下, 它们能够在受感染的宿主14 中完成复杂的感染周期。这些周期包括 rna-rna 在细胞核或叶绿体中的复制, 这取决于病毒科--分别是松足动物科或阿夫松弧虫科--通过受感染的植物移动和躲避宿主的防御反应。病毒必须被列为自然界中最稳定的 rna 之一, 因为它是一个赤裸的圆形 rna, 必须在植物感染细胞的恶劣环境中生存。这种特性可能使病毒体特别适合作为支架, 在生物技术方法中稳定重组 rna。此外, 新方法还基于病毒性支架与相互作用的植物蛋白的共表达。病毒通过滚动圈机制复制, 在这个机制中, 寄主酶被招募来催化这个过程的不同步骤。值得注意的是, 一些病毒, 更具体地说, 属于avsunviroidae 15家族的病毒体含有也参与复制的核酶。根据病毒种的不同, 病毒性 rna 的转录是由宿主 rna 聚合酶 ii 或氯塑核编码 rna 聚合酶 (nep) 介导的。病毒 rna 的处理似乎是由宿主 iii 型 rnase 催化的, 尽管在具有核酶寡聚 rna 的病毒中, 在复制过程中, 病毒的染色体是自裂的。最后, 所产生的病毒物单体是循环的, 这取决于病毒族, 由宿主 dna 连接酶1或氯乙烯基等形态的 trna 连接酶 16,17。这最后一种酶参与了黄曲霉家族中病毒体单体形式的结扎, 如茄子潜伏性病毒(elvd)18。
在分析茄子 (solanum melongena l.) trna 连接酶识别的 elvd 序列和结构要求的过程中, 我们建立了一个基于大肠杆菌中两种分子共表达的实验系统19. 我们注意到, 在大肠杆菌细胞中, 通过嵌入的锤头核酶有效地自我裂解, 由此产生的病毒性单体具有 5 '-羟基和 2 ', 3 '-磷酸二酯末端。通过共表达的茄子 trna 连接酶有效地循环。更重要的是, 产生的圆形病毒 rna 在大肠杆菌中达到了意想不到的高浓度, 超过了内源性 rnas12。复制中间体的缺乏表明这些细菌细胞中缺乏 elvd rna-rna 扩增。有趣的是, 在病毒分子的特定位置插入异源 rna 对圆形病毒性 rna rna 12 的积累有一定的影响.这些观察使我们设想了一种在细菌中产生大量重组 rna 的方法。在这种方法中 , 与感兴趣的 rna 相对应的 cDNAs 入 elvd cDNAs 中 , 由此产生的嵌合 rna 通过一个强大的本构启动子在大肠杆菌中表达。为了使系统发挥作用,大肠杆菌必须与质粒共同转化, 以表达茄子 trna 连接酶。elv 衍生的比单位长的转录是由嵌入锤头核酶处理的, 所产生的具有适当终点的单体由共同表达的 trna 连接酶识别和循环。这样 , 感兴趣的 rna 入到一个非常稳定的圆形支架组成的病毒性圆形分子。这种重组嵌合 rna 很可能通过与 trna 连接酶的相互作用而形成核糖核酸蛋白复合物, 从而在大肠杆菌细胞内进一步稳定。使用这种方法 (见下面的协议), rna 适配体, 发夹 rna 和其他结构性 rna 已很容易地产生的数量达几十毫克每升大肠杆菌培养在正常的实验室条件下, 并纯化到同质化采取循环12的优点.
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Protocol
1. 质粒结构
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通过 pcr (如果从 rna 模板开始, 通过逆转录酶 pcr) 放大与感兴趣的 rna 相对应的 cdna, 使用具有 5 ' 延伸的引物, 允许组装到表达质粒中。为避免不需要的突变, 请使用高保真 dna 聚合酶。
- 要在 gibson 组装20的表达质粒中插入cdna, 请在 pcr 引物中添加以下5个扩展: 前进, 5 '-tccccccccccccccctcctccttxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3 ';反转, 5 '-cctcctaggacatgcctgxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx 3 ';x 表示与感兴趣的 rna 末端同源的核苷酸。
- 在98°c 下孵化 30秒, 在98°c 时进行30次循环, 在98°c 时进行 30秒, 在55°c 时进行 30秒, 在72°c 下再孵化 30秒, 最后延长10分钟。
- 在缓冲液 g (10 mm tris-hcl, ph 7.5, 10 mm 2, 50 mm mmmgcl 2, 50 mm nicl) 中, 在37°c 时, 在0.5μl 管中进行20μl 反应, 消化 100 ng plevd-bzb 型 iis限制酶bpi i 的 10 u, 时间为1小时, 0.1 mg/ml bsa)。
请注意:所有质粒均可应要求提供给相应的作者。bpi我相当于bbs i。 - 在 tae 缓冲液 (40 mm tis, 20 mm 乙酸, 1 mm edta, ph 7.2) 中, 用1% 琼脂糖凝胶电泳分离 pcr 和消化产物。在0.5μgml 溴化物的200毫升中晃动, 使凝胶染色15分钟。使用紫外线透射光点可视化 dna, 并使用手术刀切割与扩增 cdna 和bp i 消化质粒 (2046 bp) 相对应的带。
请注意:bpi我消化的 plevd-bzb 也发布了 528 bp 产品对应的 lacz 蓝白记者。 - 使用硅胶柱 (材料表中的凝胶 dna 回收试剂盒) 从凝胶片段中提取 dna 片段, 并通过分光光度法分析量化 dna 浓度。
- 利用扩增的 cdna 和消化的质粒建立吉布森组装反应。使用3倍摩尔多余的插入与矢量20. 在50°c 下孵化 1小时, 并使用硅胶柱 (材料表中的 dna 清洁和选矿器试剂盒) 对反应产物进行纯化。
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使用吉布森组装反应的纯化产物电孔合格大肠杆菌 dh5α 细胞。使用1毫米电穿孔试剂盒, 应用以下设置: 1, 500 v 和 5 ms. 在37°c 孵育1小时的超优化肉汤与分解石抑制 (soc; 20 g\ l 色氨酸, 5 g\ l 酵母提取物, 0.5 g\ l ncl, 2.5 mm kcl, 10 mm mgcl 2, 20 mm 葡萄糖, ph 7.0) 液体介质, 然后扩散到 luria-bertani (lb; 10 gl 色氨酸提取物, 5 g/l 酵母提取物, 10 g/l 氯化钠) 琼脂 (1.5%) 含有50μml 氨匹西林的板。
- 要筛选与可能含有插入物的转化大肠杆菌克隆相对应的菌落, 在电镀电穿孔细胞前 15分钟, 在电镀电穿孔细胞之前, 在中传播30μl 的 5-溴-4-氯-4-氯-β--d-半乳糖苷 (x-gal)。二甲基甲酰胺。在37°c 下连夜孵化板材。
- 选择几个白色菌落, 在液体 lb 介质中在37°c 下生长过夜。使用迷你制备试剂盒 (见材料表) 纯化质粒, 并在 tae 缓冲液中使用1% 琼脂糖凝胶进行电泳分析其大小。
- 选择最可能的重组质粒基于电泳迁移相比, 解与彼得拉维-bzb 控制。使用引物 5 '-cctttttattttatattatataga-3 ' 和 5 '-gatgggggggggggggggggggg-3 ', 在 pLELVd-BZB 中侧置表达盒, 通过测序确认选定质粒的序列。
请注意:请记住, 这个质粒包含一个 528 bp 聚链接器与 lacz 标记, 被替换为 cdna 的利益。限制映射可能有助于选择正确的重组质粒。
2. rna 表达
- 在一起电穿孔 (见条件 1.6) 所选择的大肠杆菌菌株 (大肠杆菌bl21 或 bl21 衍生物) 与 plevd-bzb 衍生物, 其中包含与感兴趣的 rna 和质粒 pLELVd-BZB-derivative 相对应的 cdna, 以共同表达茄子 trna 连接酶。使用缺乏 rnase iii 21 的大肠杆菌HT115(DE3) 来表示具有长双链区域的 rna。
注: 感兴趣的 rna 和 trna 链附酶 mrna 均由大肠杆菌rna 聚合酶转录。大肠杆菌菌株不需要 de3 溶酶原来表达 t7 rna 聚合酶, 尽管这种溶菌素的存在不会产生有害影响。 - 在 soc 液体培养基37°c 孵育1小时后, 板电穿孔细菌在 lb 固体培养基中含有50μgml 氨匹西林和34μgml 氯霉素。在37°c 下过夜。
- 选择一个菌落, 用250毫升的液体非常强的干胶 (tb) 培养基 (12 gl 色氨酸) 接种1升的令人困惑的 erlenmeyer 烧瓶, 24 gl 酵母提取物, 0.4% 甘油, 0.17 m kh kh2po 4, 0.17 m k2 hpo4), 含有50μgml 安匹西林和34μgml 氯霉素。在37°c 下孵化, 以每分钟180转 (rpm) 的速度剧烈晃动。培养接种后收集12至16小时的细菌。
3. rna 的提取和纯化
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为便于分析, 在所需时间点取2毫升培养物, 在 14, 000 x克处离心机 2分钟, 将上清液丢弃, 并通过涡流将细胞重新悬浮在 50μl te 缓冲液中 (10 mm tris-hcl、ph 8.0 和 1 mL edta) 中。
- 加入 1: 1 (vv) 的一容量 (50μl) 的苯酚混合物 (加水饱和, 在 ph 值8.0 时与 Tris-HCl、ph 8.0 平衡) 和氯仿。通过剧烈的涡旋打破细胞, 并在 14, 000 x 克离心5分钟分离水和有机相.
- 仔细恢复含有总细菌 rna 的水相 (上部)。
注意: 制剂可存放在-20°c, 以便随后进行分析。
- 为制备目的, 将培养物倒入250毫升离心机瓶中, 以 14, 000 x克的速度将细胞旋转 10分钟, 去除上清液。在30毫升的水中重新悬浮, 清洗细胞。在相同的条件下, 转移到离心管并再次旋转细胞。
- 通过涡流丢弃上清液, 并在色谱缓冲液的10毫升中重新悬浮细胞 (50 mm tris-hcl, ph 值 6.5, 150 mm 氯化钠, 0.2 mm edta)。
请注意:此时, 细胞可以在-20°c 下冷冻, 以便在任何其他时刻进行纯化。 - 使用新鲜或解冻的细菌制剂, 通过添加1体积 (10 毫升) 的苯酚来打破细胞: 氯仿 (见步骤 3.2) 和剧烈涡旋。
- 在 12, 000 x 克的情况下离心 10分钟, 恢复水相, 并在相同条件下用1体积 (10 毫升) 的氯仿重新提取。
请注意:此时 rna 制剂可储存在-20°c。 -
进一步纯化细菌总 rna 的阴离子交换色谱法。通过45μm 注射器过滤器过滤 rna 制剂, 并在1毫升二乙基乙醇胺 (deae) 柱上加载。
- 对于色谱纯化, 请使用流量为 1 ml/min 的液相色谱系统。在样品加载之前, 用10毫升的色谱缓冲液对色谱柱进行平衡 (组合物见步骤 3.3)。
- 用10毫升的色谱缓冲液对样品进行加载和清洗。用20毫升洗脱缓冲液 (50 mm tris-hcl, ph 6.5, 1 m 氯化碳, 0.2 mm edta) 的洗脱 rna, 并收集1毫升的脂肪。
注: rna 在初始分数中迅速磨损。该列可重复使用以进行进一步的纯化。为此, 用10毫升的水清洗柱, 并在20°c 的乙醇中储存。
- 由于重组 rna 的主要部分以圆形形式在大肠杆菌中积累, 因此可以利用这种特性进行纯化, 使其达到均匀性12。通过二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2d page) 将非变性和变性 (8m 尿素) 条件12、22分离圆形 rna。
4. rna 分析
- 在 tbe 缓冲液 (89 mm tris, 89 mm 硼酸,2 mmedta) 中制备5% 聚丙烯酰胺凝胶 (37.1 丙烯酰胺: n, n '-甲基-甲基双酰丙烯酰胺, 质量比), 其中含有 8 m 尿素。
- 将20μl 的 rna 制剂与1体积 (20μl) 的负载缓冲液 (98% 甲酰胺, 10 mm tris-hcl, ph 8.0, 1 mm edta, 0.0025% 溴酚蓝, 0.0025% 二甲苯氰醇), 在95°c 的加热块中孵育1.5 分, 并在冰上冷却。
- 在聚丙烯酰胺凝胶中加载样品, 并根据凝胶尺寸在适当条件下运行电泳 (例如, 在 200 v 时运行 140 x 130 x 2 毫米凝胶2.5 小时)。在0.5μgml 溴化物中涂上15分钟的凝胶, 用水清洗, 并在紫外光下显示 rna。
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Representative Results
为了利用 elvd 衍生系统12在大肠杆菌中产生重组 rna, 将感兴趣的 rna 嫁接到 elvd rna 支架中。这种嵌合 rna 沿着大肠杆菌中的茄子 trna 连接酶共同表达。一旦加工、裂解和循环, 感兴趣的 rna 从其中突出的嵌合性圆形 rna, 很可能与共表达的茄子酶形成核糖核酸蛋白复合物, 在细菌细胞中达到显著的浓度 (图 1)。因此, 使用该系统生成重组 rna 的第一步是将与感兴趣的 rna 相对应的 cdna 插入 elvd cdna 中的特定位置, t245-t246 在 elvd 序列变异的 aj536613 中。质粒 pllvd-bzb, 它包含一个聚链接器在这个位置与两个bpi i 识别位点和 lacz blue/ewinai 标记基因, 促进这种插入由非常有效的吉布森组装方法20。通过对 lacz 标记的蓝白筛选, 促进了含有所需重组质粒的转化大肠杆菌克隆的选择。双 bpi i 消化不完整 , 无法加入插入物的质粒可能会在 x-gal 的存在下产生蓝色菌落。图 2显示了插入不同 cDNAs 的几种重组质粒的电泳分析。与 plevd-bzb 相比, 这些质粒表现出不同的迁移。请注意, plevd-bzb 包含 lacz 标记 (528 bp), 该标记被与感兴趣的 rna 相对应的 cdna 所取代。因此, 尽管这取决于插入的 cdna 的大小, 重组质粒的迁移速度通常快于对照质粒 (图 2)。
含有与感兴趣的 rna 相对应的 cDNAs 的 plevd-bzb 衍生物沿着 p15lrnlsm用于共电培养大肠杆菌。在含有氨匹西林和氯霉素的板材上选择共转化细菌。然后, 选择大肠杆菌克隆生长在37°c 与强搅拌在丰富的结核病培养基。在此培养条件下, 重组 rna 的产生量最大化12。通过在缓冲液中混合使用苯酚和氯仿来分解细胞, 并通过变性 page 来分析在水缓冲液中分离的 rna, 可以很容易地监测重组 rna 在细菌中的存在。图 3显示了不同大肠杆菌克隆的总 rna 被分离的溴化乙酯染色聚丙烯酰胺凝胶。这些图片显示了与空的 elvd 和嵌合 elvd 形式相对应的强波段, 其中插入了不同的 rna 感兴趣。有趣的是, 我们发现重组 rna 的主要部分为圆形。在高离子强度和低离子强度变性条件下, 使用两个 pages 的组合, 可以很容易地观察到重组 rna 主要部分的循环 (图 4)。
根据下游应用的不同, 包含感兴趣的嵌合 elvd-rna 的大肠杆菌 rna 制备总量可能是当前协议的目标。然而, 在需要时, rna 制剂可以通过阴离子交换色谱法进一步纯化。图5中的色谱图显示了大肠杆菌 rna在低离子强度 (150 mm 氯化碳) 下的有效保留, 以及随后在高离子强度 (1 m 氯化钠) 下的洗脱。大部分 rna 以分数2和3的成分收集。为了使重组 rna 具有均匀性, 可以利用循环性的优势。在变性条件下, 圆形 rna 相对于线性对应项延迟 22。这些 rna 可以从凝胶中洗脱溴后, 乙二酸溴染色。使用可溶解性聚丙烯酰胺凝胶, 例如与n、n '-bis (丙烯酸酰) 囊胺23交联的凝胶, 有助于纯化大量重组 rna (图 6)。
图 1: 基于病毒的系统的示意图, 以产生重组 rna 在大肠杆菌。与感兴趣的 rna 相对应的 cdna ( 该方案中的 98 nt - long 传奇体菠菜 ) 入质粒 plelvd - bzb 中。大肠杆菌与 plevd-bzb 衍生物和质粒 p15ltrnlsm 共同转化, 共同表达茄子 trna 连接酶。在大肠杆菌中, 嵌合的 elvd-spinach rna 转录物是由病毒状锤头核酶自切 (红色箭头)。所产生的单体通过共同表达的 trna 连接酶和循环识别。重组 rna 由一个圆形病毒性支架组成, 感兴趣的 rna (绿色) 从这个支架中突出。重组 rna 在大肠杆菌中大量积累可能是由于trna 连接酶稳定了核糖核酸蛋白复合物。除了分裂 elvd cdna 外, 质粒 plelvd-bzb 还含有 puc 复制原点 (puc ori)、氨匹西林选择基因 (amppr)、大肠杆菌小鼠脂肪蛋白 (lpp) 启动子和 rrna (rrnc) 终止剂和 lacz标记。质粒 p15ltrnlnm 含有 p15a 复制原点 (p15a ori)、氯霉素耐药基因 (cDNA r)、大肠杆菌 lpp促进剂和噬菌体 t7 转录激活剂, 以及茄子 trna lrna lrna.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 对含有不同 cDNAs 的解基因表达质粒进行电泳分析。用电泳方法分离质粒, 在1% 的琼脂糖凝胶中进行分离, 该凝胶被溴化乙酯染色。车道 1, dna 标记与大小 kbp 的一些成分在左边;车道 2, plevd-bzb;车道 3, plevd-bzb 导数表示一个空的 elvd;4比7车道表达 rna 适配体菠菜 (车道 4)、链球素结合贴剂 (车道 5)、具有连续 42 bp 双链区域 (车道 6) 的 rna 发夹和植物的 3 ' 独立于捕获的翻译增强剂 (cite)病毒 (第7车道)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 使用基于病毒的系统在大肠杆菌中产生的重组 rna。用苯酚法提取不同大肠杆菌无性系的总 rna: 氯仿和脱变性页分离的等价物。凝胶染色溴化乙酯显示。在大肠杆菌(a) BL21(DE3) 和 (b) HT115(DE3) 中产生重组 rna。(a和b) 车道 1, rna 标记, 大小在 s 在左侧;车道 2, rna 从大肠杆菌克隆来表达一个空的 elvd (333 nt)。(a) 从大肠杆菌克隆的 rna 来表达一个嵌合的 elvd 形式, 分别包含附位器菠菜 (98 nt) 和链霉素结合器 (42)。(b) 车道 3, rna 从大肠杆菌克隆来表达一个嵌合的 elvd 形式, 其中包含一个42英镑长的双链 rna。红色箭头指向圆形重组 rna。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 使用基于病毒的系统在大肠杆菌中产生的重组 rna 的循环。从大肠杆菌克隆的总 rna 来表达含有注入菠菜的嵌合 elvd, 首先在高离子强度下, 然后在低离子强度下, 用二维变性页分离。凝胶被溴化物染色。蓝色箭头指示电泳迁移的方向。红色箭头指向圆形 elvd-spinach, 在两个分离过程中, 该圆形 elvd-spinach 有选择地从相同大小的线性对应处延迟。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 利用基于病毒的系统对大肠杆菌中产生的重组 rna 进行色谱纯化。从大肠杆菌克隆产生嵌合 elvd-3 ' cite (55 nt) 的总 rna 被加载到 deae 色谱柱上, 在 150 mm nacl 的存在下进行了清洗。rna 在 1 m 氯化钠存在的情况下被洗脱。色谱显示在 254 nm (蓝线) 和电导率在 mscm (橙色线) 相对于容量。指出了色谱分离的不同步骤 (平衡、注射、洗涤、洗脱和柱再生)。还指出了收集的分数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 利用基于病毒的系统纯化大肠杆菌中产生的重组 rna 的均匀性。从产生嵌合 elvd-3 ' cite 的大肠杆菌克隆中的总 rna 首先用 deae-sepharose 柱进行色谱纯化, 然后用 2d page 分离。在变性条件下运行第一凝胶 (8m 尿素, 缓冲 tbe)。在使用溴化乙酯染色后, 含有重组 rna 圆形形式的凝胶带被转移到在非变性条件下运行的第二凝胶 (缓冲 tae) 的顶部。第二凝胶的丙烯酰胺与n, n '-bis (丙烯酸酰) 半乳糖胺交联, 使含有纯重组 rna 的凝胶片段增溶。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在研究茄子 trna 连接酶识别所涉及的 elvd 序列和结构要求时, 我们注意到, 这两种分子在非宿主大肠杆菌中的共同表达导致了病毒性循环的意外大量积累在细菌细胞19形成。据我们了解,大肠杆菌中病毒性 rna 的大量积累很可能是共同表达高度稳定的 rna 分子的结果, 例如相对较小 (333 nt)、高度基成对的圆形病毒, 以及一种蛋白质。特定的病毒性表现出很高的亲和力。elvd rna 必须在受感染植物17的复制过程中介导宿主 trna 连接酶的循环。虽然我们没有实验确认, 但我们预计这两个分子都会在大肠杆菌中形成核糖核酸蛋白复合物, 进一步稳定病毒 rna, 并使细菌达到每升150毫克的显著浓度高度超过内生 rna 的文化, 如 rrna12。由于 elvd 不会在大肠杆菌中复制, 我们推断, 插入异源 rna 不会极大地影响病毒来源 rna 的积累, 事实上, 情况就是这样。这项观察是我们在这里描述的在大肠杆菌中产生大量重组 rna 的方法的基础。该方法使用 elvd 的圆形 rna 分子作为一个支架, 在其上显示感兴趣的 rna。为了在大肠杆菌中产生一个圆形 elvd 支架, 我们需要用病毒性锤头核酶的重复域来表达前体 rna。elvd 核酶在大肠杆菌中非常有效地自我裂解, 由此产生的病毒性单体通过共同表达的 trna 连接酶得到识别和循环。trna 连接酶的共表达是该系统的一个关键特征。在大肠杆菌中几乎没有检测到 elvd rna, 除非这种特殊的酶被共同表达12。
在我们的协议中, 质粒 plelvd-bzb 允许通过简单而高效的 gibson 组件在 elvd 的 u245 和 u246 位置之间插入与感兴趣的 rna 相对应的 cdna。这个网站对应于一个长发夹存在于最可能的 elvd 构象 24,25的终端循环.插入到这个特定的位置必须促进感兴趣的 rna 从 elvd 形成的非常稳定的支架突出, 并且必须避免感兴趣的 rna 和 elvd 之间的分子内相互作用 (图 1)。我们还没有探讨在 elvd 分子的替代位置插入感兴趣的 rna 的效果。质粒 p15ltrnlsm 可同时表达茄子 trna 连接酶。rna 在两个质粒中被转录, 在本构强大肠杆菌启动子 (即 murein 脂蛋白 (lpp) 的控制下。这使得系统在不需要感应的情况下构成。然而, 我们也建立了一个类似的质粒 (p15trnlsm) 来表达在噬菌体 t7 rna 聚合酶控制下的 trna 连接酶在异丙基β-d-1-硫代丙基糖苷 (iptg) 诱导系统。利用该质粒, 重组 rna 的积累只有在诱导 trna连接酶表达后, 加入 iptg12。在目前的系统中, 感兴趣的 rna 是从具有 puc 复制来源的高拷贝数质粒中表达的, 而 trna 连接酶则来自一个具有 p15a 复制来源的中等拷贝数质粒。改变系统中涉及的两个质粒的复制数量是否能提高重组 rna 的积累, 目前还没有探索过。该系统所承认的感兴趣的 rna 的大小范围也没有得到系统的研究, 尽管从逻辑上讲, 小的 rna 预计会积累到比较大的 rna 更高的浓度。
重组 rna 在体内产生不容易的原因之一很可能是由于 rna 分子固有的半衰期较低。我们的制度与这个问题并不陌生。事实上, 在大肠杆菌生长后期, 重组 rna 的积累开始减少, 几乎消失 12.这迫使一个人找到正确的窗口来收获细胞。不过, 我们注意到, 这个窗口足够大, 可以使系统友好。然而, 我们也观察到, 最佳窗口取决于许多因素, 包括特定的大肠杆菌菌株、培养基、生长条件 (搅拌、烧瓶体积、通风等) 以及细菌的生理阶段用来开始液体培养。我们建议使用前一天接种并在37°c 下生长的新鲜大肠杆菌菌落开始重组 rna 生产。把盘子放在冰箱里会使收获窗口变得更加不可预测。我们通过从带牙签的盘子里采摘的细菌开始液体培养, 获得了最一致的结果。使用液体预培养, 特别是饱和的液体预培养, 也会导致生产协议的可变性。
关于纯化, 用苯酚处理细菌细胞: 氯仿是一种非常有效的方法来打破细胞, 并允许在水相中定量回收细菌的全部 rna。根据重组 rna 的下游应用, 这种水相或从这个水相沉淀 rna 的制备与酒精可能是足够的。如果需要进一步纯化, 我们建议使用 deae 阴离子交换柱进行阴离子交换色谱 (图 5)。这一净化步骤可以有效去除 dna 和细菌代谢物, 这些物质也在水相中分离。如果重组 rna 的下游应用需要纯化到均匀性, 则与其他方法相比, 病毒衍生系统具有明显的优势。由于重组 rna 的主要部分是作为一种圆形形式产生的, 因此可以利用这种特性将其与大量细菌 rna 分离。与相同尺寸22的线性对应相比, 圆形 rna 在变性条件下的电泳迁移出现延迟.当 rna 在较低的离子强度下进行电泳时, 这种延迟就会更加明显。在实际应用中, 在高离子强度和低离子强度下, 循环 rna 也可以通过二维变性 page 进行分离 (图 4)。电泳分离后, 重组 rna 必须从凝胶中洗脱。使用可逆转的丙烯酰胺交联剂, 如n, n '-bis (丙烯酸酰) 囊胺23, 促进了恢复, 特别是在净化大量 rna 时 (图 6)。最后, 如果所生产的 rna 的下游应用要求从病毒性支架中分离感兴趣的 rna, 我们的协议不会为以前的方法提供任何特殊的优势。感兴趣的 rna 必须使用前面描述的一些策略从嵌合分子中删除, 例如使用核酶、dnazymes 或最有效地使用 rnase h, 由两个 dna 寡核苷酸7引导。为了避免这最后一个繁琐的净化步骤, 我们一直在努力缩小病毒性脚手架的大小, 尽管取得了部分成功。我们能够产生显着数量的重组 rna 使用病毒样缺失的形式 (175, 215 和246亚尔), 但增加删除的病毒性支架与减少积累 12相关。
总之, 这里描述了一个协议, 以产生大量的重组 rna 在大肠杆菌, 据我们所知, 提高以前公布的方法的产量。该协议是基于在大肠杆菌中的共同表达的感兴趣的 rna 插入到一个病毒性 (elvd) 支架和茄子 trna 连接酶, 在受感染的植物中循环这种病毒样的酶。我们的协议的一个显著特点是重组 rna 主要是作为一种圆形形式产生的, 这种特性有助于下游应用的均匀性纯化。使用该协议, 在常规实验室条件下, 每升大肠杆菌培养可轻松生成数十毫克重组 rna。
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Disclosures
作者声明, 本协议中描述的技术已获得专利 (美国专利号)。ep14382177.5, pc/ep2015/60912)。
Acknowledgments
这项工作得到了西班牙创新大学 ciencia 部长的 BIO2017-83184-r 和 bio2017-91865-exp 赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
| Bpi I | Thermo Scientific | ER1011 | |
| Agarose | Conda | 8010 | D1 low EEO |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086,1000 | |
| Acetic acid | PanReac AppliChem | 131008.1214 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134-500G | |
| Ethidium bromide | PanReac AppliChem | A1152,0025 | 1% |
| Zymoclean Gel DNA Recovery | Zymo Research | D4001 | |
| NanoDrop | ThermoFisher Scientific | ND-3300 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England BioLabs | E2621S | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4003 | |
| Eporator | Eppendorf | 4309000019 | |
| Escherichia coli DH5α | Invitrogen | 18265-017 | |
| Tryptone | Intron Biotechnology | Ba2014 | |
| Yeast extract | Intron Biotechnology | 48045 | |
| NaCl | PanReac AppliChem | 131659.1211 | |
| Agar | Intron Biotechnology | 25999 | |
| Ampicillin | PanReac AppliChem | A0839,0010 | |
| X-gal | Duchefa | X1402.1000 | |
| N,N-Dimethylformamide | PanReac AppliChem | 131785.1611 | |
| NucloSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 22740588.250 | |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Novagen | 69387-3 | |
| Escherichia coli HT115(DE3) | Ref. Timmons et al., 2001 | ||
| Chloramphenicol | Duchefa | C 0113.0025 | |
| Glycerol | PanReac AppliChem | 122329.1211 | 87% |
| KH2PO4 | PanReac AppliChem | 131509.1210 | |
| K2HPO4 | PanReac AppliChem | 122333.1211 | |
| HCl | PanReac AppliChem | 131020.1211 | |
| Phenol | Scharlau | FE04791000 | 90% |
| Chloroform | PanReac AppliChem | A3691,1000 | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiTrap DEAE Sepharose FF column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5055-01 | |
| ÄKTAprime plus liquid chromatography system | GE Healthcare Life Sciences | 11001313 | |
| Acrylamyde | PanReac AppliChem | A1089,1000 | 2K |
| N,N’-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279-100G | |
| Urea | PanReac AppliChem | 146392.1211 | |
| Boric acid | PanReac AppliChem | A2940,1000 | |
| Formamide | PanReac AppliChem | A0937,2500 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026-5G | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| N,N′-Bis(acryloyl)cystamine | Sigma-Aldrich | A4929-5G |
References
- Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
- Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
- Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4 (2017).
- Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
- Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).
- Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
- Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
- El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
- Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).
- Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
- Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).
- Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
- Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F.
- Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
- Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
- Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
- Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
- Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
- Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
- Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
- Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
- López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).
