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Biochemistry

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli expressando co um RNA quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. O principal produto é uma molécula circular que facilita a purificação de homogeneidade.

Abstract

Com interesse crescente em biologia do RNA e a utilização de moléculas de RNA em sofisticadas aplicações biotecnológicas, limitam-se os métodos para produzir grandes quantidades de RNA recombinante. Aqui, descrevemos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli , com base na expressão co de uma molécula quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. Viroides são relativamente pequenas, não-codificantes, altamente base-emparelhado RNAs circulares que são infecciosas para plantas superiores. O host planta tRNA ligase é uma enzima recrutada por viroides que pertencem à família Avsunviroidae, tais como berinjela viroid latente (ELVd), para mediar a circularização de RNA durante a replicação viroid. Embora ELVd não Replica em e. coli, um precursor do ELVd eficientemente é transcrito pela RNA polimerase de e. coli e processado pelas martelo incorporado ribozimas em células bacterianas, e os monômeros resultantes são circularizou pela ligase do tRNA co expressa atingindo uma concentração notável. A inserção de um RNA de interesse no cadafalso ELVd permite a produção de dezenas de miligramas do RNA recombinante por litro de cultura bacteriana em condições laboratoriais regulares. Uma fração principal do produto do RNA é circular, um recurso que facilita a purificação do RNA recombinante de homogeneidade virtual. Neste protocolo, um correspondente de DNA (cDNA) complementar ao RNA de interesse é inserido em uma determinada posição do cDNA ELVd em um plasmídeo de expressão que é usada, ao longo do plasmídeo para expressar co berinjela ligase do tRNA, para transformar e. coli. Expressão co de ambas as moléculas sob o controle dos promotores constitutivos fortes leva à produção de grandes quantidades de RNA recombinante. O RNA recombinante pode ser extraído as células bacterianas e separa a maior parte dos RNAs bacterianas, aproveitando sua circularidade.

Introduction

Em contraste com DNA e proteínas, protocolos para fácil, eficiente e econômica de produção de grandes quantidades de RNA não são abundantes. No entanto, investigação e indústria demanda quantidade crescente destas biomoléculas para investigar suas propriedades biológicas únicas1, ou para ser empregado em sofisticadas aplicações biotecnológicas, incluindo a sua utilização como altamente específico aptamers 2, agentes terapêuticos3ou pesticidas seletivos4. In vitro a transcrição e síntese química são comumente usados em pesquisas para produzir RNA. No entanto, estes métodos implicam limitações importantes quando grandes quantidades de produtos são necessárias. A alternativa lógica é usar a maquinaria de transcrição endógeno das células vivas, seguido de um processo de purificação para separar os RNAs de interesse dos companheiros celulares. Na sequência desta estratégia, foram desenvolvidos métodos para produzir RNA recombinante em células bacterianas, tais como o laboratório-friendly Escherichia coli5 ou o marinho roxo fototróficas alfa-Proteobacteria Rhodovolum sulfidophilum 6. a maioria dos métodos para produzir RNA recombinante em bactérias dependem a expressão de um andaime nativo de RNA altamente estável, tais como um tRNA ou um rRNA, no qual o RNA de interesse é inserido7. Isso impõe a necessidade de liberar o RNA de interesse fora a molécula quimérico, se a presença de RNA extra é um problema para as aplicações a jusante de8. Outro conceito em biotecnologia de RNA de recombinação é a produção de complexos ribonucleoprotein recombinante que pode ser o produto desejado por si ou usado como uma estratégia de proteção para aumentar a estabilidade do RNA de interesse9, 10. Da mesma forma, a produção de RNAs circulares também tem sido sugerida como uma estratégia para gerar mais estável produtos11.

Recentemente desenvolvemos um novo método para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em e. coli que participa em três dos conceitos acima: a inserção de RNA de interesse em um andaime de RNA circular altamente estável e a expressão co do RNA recombinante com uma proteína de interação provavelmente produzir um complexo de ribonucleoprotein estável que se acumula em quantidades notáveis em bacteriana células12. Em contraste com a evolução do anterior, usamos um andaime de RNA completamente alheio a Escherichia coli, ou seja um viroid. Viroides são um tipo muito particular de agentes infecciosos de plantas superiores que são constituídas exclusivamente por um relativamente pequeno (246-401 nt) altamente emparelhado-base de RNA circular13. Curiosamente, viroides são não-codificantes RNAs e, sem a ajuda de suas próprias proteínas, eles são capazes de completar ciclos infecciosos complexos no hospedeiros infectados14. Esses ciclos incluem a replicação de RNA RNA-para nos núcleos ou cloroplastos, dependendo da família viroid —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivamente — movimento através da planta infectada e evasão da resposta defensiva do hospedeiro. Viroides devem ser classificados entre os RNAs mais estáveis na natureza, em consequência de ser um RNA circular nu e ter que sobreviver no ambiente hostil de células vegetais infectados. Esta propriedade pode fazer viroides particularmente apropriada como andaimes para estabilizar a recombinação RNA em abordagens biotecnológicas. Além disso, o novo método baseia-se na expressão co do cadafalso viroid com uma interação da planta. Viroides replicam através de um mecanismo de rolamento-círculo no qual host enzimas são recrutadas para catalisar as diferentes etapas do processo. Notadamente algumas viroides, mais especificamente aqueles que pertencem a família Avsunviroidae15, contêm ribozimas que também estão envolvidas na replicação. Dependendo da espécie de viroid, transcrição de viroid RNAs é mediada pelo host RNA polimerase II ou o cloroplástico nuclear codificado RNA polimerase (NEP). Processamento de Viroid RNA parece ser catalisada por um host tipo III RNase, embora em viroides com ribozimas oligoméricas RNA intermediários Self cleave durante a replicação. Finalmente, os resultante monômeros viroid são circularizou, dependendo da família viroid, pelo ligase do DNA de anfitrião 1 ou o isoform cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima está envolvida na ligadura das formas monoméricas dos viroides da família Avsunviroidae, como berinjela viroid latente (ELVd)18.

No decorrer de um trabalho para analisar os requisitos de ELVd sequência e estruturais que determinam o reconhecimento pela berinjela (Solanum melongena L.) ligase do tRNA, montamos um sistema experimental baseado na expressão co de ambas as moléculas em e. coli 19. notamos que as transcrições de ELVd mais-que-unidade self cleave eficientemente em células de Escherichia coli através da martelo incorporado ribozimas e que eram os monómeros de viroid resultante com 5'-hidroxila e 2', 3'-fosfodiéster termini eficientemente circularizou pelo co expressa berinjela ligase do tRNA. Ainda mais, o RNA circular viroid resultante alcançou uma inesperada alta concentração em Escherichia coli, superiores dos rRNAs endógena12. Ausência de replicação intermediários indicou falta de ELVd de RNA RNA-para amplificação nestas células bacterianas. Curiosamente, inserção de RNAs heterólogos em uma posição específica da molécula viroid teve um efeito moderado na acumulação do circular viroid-derivado RNAs12. Estas observações nos fez imaginar um método para produzir grandes quantidades de recombinante RNAs em bactérias. Neste método, os cDNAs correspondente as RNAs de interesse são inseridos no cDNA a ELVd e o RNA quimérico resultante é expressa em e. coli através de um forte promotor constitutivo. Para o sistema funcionar, e. coli devem ser transformados co com um plasmídeo para expressar a berinjela ligase do tRNA. A transcrição de mais-do que-unidade ELVd-derivado é processada pelas martelo incorporado ribozimas e os monómeros resultantes com o termini apropriado são reconhecidos e circularizou pelo co expressa ligase do tRNA. Deste modo, o RNA de interesse é inserido em um andaime circular muito estável, consistindo da molécula circular viroid. Este RNA recombinante quimérico é provavelmente mais estabilizado no interior das células de Escherichia coli , pela formação de um complexo através da interação com a ligase do tRNA do ribonucleoprotein. Usando este método (Veja o protocolo abaixo), RNA aptamers, gancho de cabelo RNAs e outros RNAs estruturadas facilmente produzidos em quantidades de dezenas de miligramas por litro de cultura de Escherichia coli em condições laboratoriais normais e purificados a homogeneidade tomando vantagem de circularidade12.

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Protocol

1. plasmídeo construção

  1. Amplificar pelo PCR (ou pela transcrição reversa PCR se a partir de um modelo de RNA) o cDNA correspondente para o RNA de interesse usando as primeiras demão com extensão de 5' para permitir que o assembly para o plasmídeo de expressão. Para evitar mutações indesejáveis, use uma DNA polimerase de alta-fidelidade.
    1. Para inserir o cDNA no plasmídeo de expressão por Gibson montagem20, adicionar as seguintes extensões de 5' para os primers PCR: avanço, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; reversa, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; X representa nucleotídeos homólogos às extremidades terminais do RNA de interesse.
    2. Incubar durante 30 s a 98 ° C, seguido de 30 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 30 s a 72 ° C e uma extensão final de 10 min a 72 ° C.
  2. Digest 100 ng do plasmídeo pLELVd-BZB com 10 U da enzima de restrição do tipo-IIS Bpi por 1 h a 37 ° C, em uma reação de 20 µ l em um 0,5 mL do tubo no buffer G (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50mm NaCl 0,1 mg/mL BSA).
    Nota: Todos os plasmídeos estão disponíveis mediante pedido ao autor correspondente. BPI É equivalente a Bbs eu.
  3. Separe os produtos PCR e digestão por eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TAE (40 mM Tris, pH de ácido acético, EDTA 1 mM, 20 mM 7.2). Manche o gel durante 15 minutos, agitando em 200 mL de brometo de etídio 0,5 µ g/mL. Visualize o DNA usando um transiluminador UV e cortar as bandas correspondentes do cDNA amplificado e o Bpi eu digerido do plasmídeo (2046 bp) usando uma lâmina de bisturi.
    Nota: BPI Eu digestão de pLELVd-BZB também libera um produto de bp 528 correspondente ao repórter de azul e branco de LacZ.
  4. Eluir os DNAs dos fragmentos gel usando colunas de sílica gel (gel kit de recuperação de DNA na Tabela de materiais) e quantificar a concentração de DNA pela análise espectrofotométrica.
  5. Configure uma reação de montagem Gibson usando o cDNA amplificado e o plasmídeo digerido. Use um 3 vezes excesso molar de inserção contra vetor20. Incubar durante 1 h a 50 ° C e purificar os produtos de reação usando uma coluna de sílica gel (DNA limpo & kit de concentrador na Tabela de materiais).
  6. Use os produtos purificados da reação de electroporate competente montagem Gibson Escherichia coli DH5α células. Usando cubetas de eletroporação de 1 mm, aplique as seguintes configurações: 1.500 V e 5 ms. Incubar durante 1 h a 37 ° C em caldo super otimizado com repressão catabolite (SOC; triptona de 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, 0,5 g/L em NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2 glicose de 20 mM, pH 7,0) meio líquido e então propagação para Luria-Bertani (LB; triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, 10 g/L de NaCl) placas de ágar (1,5%) contendo ampicilina de 50 µ g/mL.
    1. Para tela para colônias correspondentes a transformada e. coli clones que provavelmente incorporaram a inserção, 15 min antes do chapeamento as células electroporated, espalhar 30 µ l de 50 mg/mL 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) em dimetilformamida. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
  7. Escolha várias colónias brancas e crescer durante a noite a 37 ° C em meio líquido LB. Purificar plasmídeos usando um miniprep kit (veja a Tabela de materiais) e analisar seus tamanhos por eletroforese em gel de agarose a 1% em tampão TAE.
  8. Selecione o plasmídeo recombinante mais provável com base na migração eletroforética em comparação com o controle pLELVd-BZB. Confirmar a sequência do plasmídeo selecionado pelo sequenciamento utilizando primers 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3' e 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' que ladeiam a fita toda expressão em pLELVd-BZB.
    Nota: Lembre-se que este plasmídeo contém um 528 polylinker bp com o marcador de LacZ é substituído do cDNA de interesse. Mapeamento de restrição pode ajudar a selecionar o plasmídeo recombinante bem.

2. expressão do RNA

  1. Co-electroporate (ver condições no 1.6) o selecionado Escherichia coli estirpe (Escherichia coli BL21 ou um derivado BL21) com o pLELVd-BZB-derivado que contém o cDNA correspondente para o RNA de interesse e do plasmídeo p15LtRnlSm co expressar o berinjela ligase do tRNA. Use o Escherichia coli HT115(DE3), que carece de RNase III21, para expressar RNAs com regiões de longa dupla-hélice.
    Nota: Tanto o RNA de interesse e a ligase tRNA mRNA são transcritas pelo polymerase do RNA de Escherichia coli . Não lysogen DE3 para expressar T7 ARN-polimerase é necessária a estirpe de e. coli , embora a presença desta lysogen tem sem efeitos deletérios.
  2. Após incubação de 1 h a 37 ° C em meio líquido SOC, placa electroporated de bactérias em meio sólido LB, contendo 50 µ g/mL ampicilina e cloranfenicol 34 de µ g/mL. Incubar durante uma noite a 37 ° C.
  3. Escolher uma colônia e inocular um 1L perplexo Erlenmeyer de 250 ml de meio líquido maravilhoso caldo (TB) (12 g/L triptona, 24 g/L de levedura extrato, 0,4% de glicerol, 0,17 M KH2PO4e 0,72 M K2HPO4), contendo 50 ampicilina µ g/mL e cloranfenicol 34 de µ g/mL. Incube a 37 ° C, com agitação vigorosa em 180 rotações por minuto (rpm). Após a inoculação da cultura da colheita bactérias entre 12 e 16 h.

3. purificação e extração do RNA

  1. Para fins analíticos, tome alíquotas de 2 mL da cultura nos pontos de tempo desejado e centrifugar a 14.000 x g por 2 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM de EDTA) pela utilização do vortex.
    1. Adicionar um volume (50 µ l) de uma mistura 1:1 (v/v) de fenol (saturado com água e incubado com Tris-HCl, pH 8.0 pH 8.0) e clorofórmio. Quebrar as células vortexing vigoroso e separar as fases aquosas e orgânicas por centrifugação por 5 min a 14.000 x g.
    2. Cuidadosamente, recupere as fases aquosas (superior) que contém o RNA total bacteriano.
      Nota: As preparações podem ser armazenadas a-20 ° C para posterior análise.
  2. Para fins preparativa, despeje a cultura em um frasco de 250 mL centrífuga e spin-down células a 14.000 x g durante 10 min. Discard sobrenadante. Lave as células por resuspending em 30 mL de água. Transfira para um tubo de centrífuga e spin para baixo as células novamente nas mesmas condições.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de tampão de cromatografia (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 150 mM de NaCl, 0,2 mM EDTA) pela utilização do vortex.
    Nota: Neste momento, as células podem ser congeladas a-20 ° C para prosseguir com a purificação em qualquer outro momento.
  4. Usando uma preparação bacteriana fresca ou descongelada, quebrar células adicionando 1 volume (10 mL) de fenol: clorofórmio (consulte a etapa 3.2) e num Vortex vigorosamente.
  5. Centrifugar durante 10 min a 12.000 x g, recuperar a fase aquosa e extrair novamente com 1 volume (10 mL) de clorofórmio nas mesmas condições.
    Nota: A preparação do RNA pode ser armazenada a-20 º C neste momento.
  6. Purifica ainda mais o RNA total bacteriano por cromatografia de troca aniónica. Filtre a preparação do RNA através de um filtro de seringa µm 45 e carga em uma coluna de diethylethanolamine (DEAE) de 1 mL.
    1. Para a purificação de cromatografia, use um sistema de cromatografia líquida em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Antes de carregar de amostra, equilibrar a coluna com 10 mL de tampão de cromatografia (consulte Etapa 3.3 para composição).
    2. Carregar a amostra e lavar a coluna com 10 mL de tampão de cromatografia. Eluir RNA com 20 mL de tampão de eluição (50 mM Tris-HCl, pH 6,5, 1 M NaCl, 0,2 mM EDTA) e recolher as alíquotas de 1 mL.
      Nota: RNA elutes rapidamente nas fracções iniciais. A coluna pode ser reutilizada para novas purificações. Por isso, lavar a coluna com 10 mL de água e armazenar a 4 ° C em 20% de etanol.
  7. Desde uma parte importante da recombinação que RNA acumula em e. coli em uma forma circular, esta propriedade pode ser lucrada para purificação de homogeneidade12. Separe os RNAs circulares as contrapartes lineares por eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE) combinando não-desnaturação e desnaturação (ureia 8m) condições12,22.

4. RNA análise

  1. Preparar um gel de poliacrilamida de 5% (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide, relação massa) em ureia de 8 M contendo TBE tampão (89 mM Tris, o ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM).
  2. Mix 20 µ l de preparações de RNA com 1 volume (20 µ l) de carga Reserva (98% formamida, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,0025% de azul de bromofenol e 0,0025% xileno cianol), incubar por 1,5 min a 95 ° C, em um bloco de aquecimento e snap cool no gelo.
  3. Carregar as amostras no gel poliacrilamida e executar a eletroforese em condições apropriadas, dependendo das dimensões do gel (por exemplo, executar 140 x 130 x 2 mm géis para 2,5 h a 200 V). Manchar o gel durante 15 min em brometo de etídio 0,5 µ g/mL, lavar com água e visualizar o RNA sob luz UV.

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Representative Results

Para produzir RNA de recombinação em Escherichia coli usando o sistema derivado de ELVd12, o RNA de interesse é enxertado em um andaime de RNA ELVd. Este RNA quimérico é co expressa ao longo da berinjela ligase do tRNA em e. coli. Uma vez processadas, clivado e circularizou, o quimérico RNA circular, do qual o RNA de interesse se projeta, provavelmente forma um complexo com a enzima de berinjela co expressa que atinge notável concentração nas células bacterianas ( de ribonucleoprotein Figura 1). Por conseguinte, o primeiro passo para produzir RNA recombinante usando este sistema consiste em inserir o cDNA correspondente para o RNA de interesse em uma determinada posição na ELVd do cDNA, T245-T246 na variante de sequência de ELVd AJ536613. Plasmídeo pLELVd-BZB, que contém um polylinker nessa posição com dois Bpi reconhecimento de sites e um gene marcador azul/branco de LacZ, facilita esta inserção pelo muito eficiente de método de montagem Gibson20. Seleção de transformado Escherichia coli clones contendo o plasmídeo recombinante desejado é facilitada pela triagem de azul/branco do marcador de LacZ. Plasmídeos em que o duplo Bpi eu digestão incompleta e não poderia incorporar inserir azul provável produzir colônias na presença de X-gal. A Figura 2 mostra a análise eletroforética de vários plasmídeos recombinantes, em que diferentes cDNAs foram inseridos. Estes plasmídeos mostram diferentes migrações quando comparado ao pLELVd-BZB. Nota que pLELVd-BZB contém o marcador de LacZ (528 bp) que é substituído do cDNA correspondente para o RNA de interesse. Então, embora isso depende do tamanho do cDNA inserido, o plasmídeo recombinante normalmente migra mais rápido do que o plasmídeo de controle (Figura 2).

Os pLELVd-BZB-derivados que contêm os cDNAs correspondente as RNAs de interesse são utilizados ao longo de p15LtRnlSm para co-electroporate e. coli. Bactérias co transformadas são selecionadas em placas contendo ampicilina e cloranfenicol. Então, selecionado e. coli clones são cultivadas a 37 ° C, com forte agitação no meio de ricos TB. Sob estas condições de cultura, produção da recombinação que RNA é maximizada12. A presença do RNA recombinante na bactéria pode ser facilmente controlada, quebrando as células com uma mistura de fenol e clorofórmio na presença de um buffer e analisando o RNA, quais partições no buffer aquoso, por desnaturação página. A Figura 3 mostra o brometo de ethidium manchadas de géis de poliacrilamida em quais RNAs totais de Escherichia coli de diferentes clones foram separados. As fotos mostram fortes bandas que correspondem a ELVd vazio e quimérico ELVd formas nas quais diferentes RNAs de interesse foram inseridos. Curiosamente, encontramos uma grande fração do RNA recombinante como forma circular. Usando uma combinação de duas páginas em condições de desnaturação com força iônica alta e baixa, a circularidade da fração principal do RNA recombinante pode ser facilmente observada (Figura 4).

Dependendo da aplicação a jusante, o total de e. coli RNA preparação que contém o quimérico ELVd-RNA de interesse pode ser o objetivo do protocolo atual. No entanto, quando necessário, a preparação do RNA pode ser purificada mais por cromatografia de troca aniónica. Cromatograma na Figura 5 mostra a retenção eficiente de e. coli RNA na coluna com baixa força iônica (150 mM NaCl) e posterior eluição com alta força iônica (1 M NaCl). A maioria do RNA é coletado em frações 2 e 3. Para purificar o RNA recombinante de homogeneidade, pode tirar partido de circularidade. RNAs circulares estão atrasadas em relação a suas contrapartes lineares em condições22de desnaturação. Estes RNAs podem ser eluídos do gel após coloração de brometo de etídio. O uso de um gel de polyacrylamide solubilizable, tais como aqueles reticulado com N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, facilita a purificação de grandes quantidades de RNA recombinante (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do sistema baseado em viroid para produzir RNA recombinante em e. coli. o cDNA correspondente para o RNA de interesse (a 98 nt-long RNA aptamer espinafre no esquema) é inserido no plasmídeo pLELVd-BZB. Escherichia coli é co transformado com o p15LtRnlSm pLELVd BZB-derivativos e plasmídeo para expressar co berinjela ligase do tRNA. Em E. coli, a transcrição do RNA ELVd-espinafre quimérico é self clivadas (setas vermelhas) pelas viroid martelo ribozimas. O monômero resultante é reconhecido pelo ligase co expressa do tRNA e circularizou. O RNA recombinante consiste de um andaime viroid circular do qual se projeta o RNA de interesse (em verde). Acúmulo do RNA recombinante para grandes quantidades em Escherichia coli provavelmente resulta da estabilização do ribonucleoprotein complexo com ligase do tRNA. Além da divisão ELVd cDNA, plasmídeo pLELVd-BZB contém uma origem de replicação do pUC (pUC ori), um gene de seleção de ampicilina (AmpR), o promotor de lipoproteína murino (lpp) de Escherichia coli e terminator rRNA (rrnC) e o LacZ marcador. Plasmídeo p15LtRnlSm contém uma origem de replicação de p15A (p15A ori), um gene de resistência de cloranfenicol (CmR), o promotor de Escherichia coli lpp e um terminador de transcrição do fago T7, além do berinjela tRNA ligase do cDNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: análise eletroforética de plasmídeo de expressão pLELVd-BZB-derivado que contêm diferentes cDNAs de interesse. Plasmídeos foram separados por eletroforese em um gel de agarose a 1% que estava manchado com brometo de etídio. Pista 1, marcador de DNA com tamanhos em kbp de alguns dos componentes da esquerda; pista 2, pLELVd-BZB; pista 3, derivado de pLELVd-BZB para expressar um ELVd vazio; pistas de 4 a 7, derivados de pLELVd-BZB para expressar o RNA aptamer espinafre (faixa 4), a vinculação de estreptavidina aptamer (faixa 5), um grampo de RNA com um 42 bp double-stranded região contígua (faixa 6) e o 3' Tradução tampão-independente enhancer (CITE) de uma planta vírus (faixa 7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: RNA recombinante produzido em Escherichia coli usando o sistema baseado em viroid. Total de RNAs de Escherichia coli de diferentes clones foram extraídos por tratamento com fenol: clorofórmio e alíquotas separadas por página de desnaturação. Géis corados com brometo de etídio são mostrados. RNAs recombinantes foram produzidos em Escherichia coli (A) BL21(DE3) e (B) HT115(DE3). (A e B) pistas 1, marcador de RNA com tamanhos em nt à esquerda; faixas 2, RNAs de clones de e. coli para expressar um vazio ELVd (333 nt). (A) faixas 3 e 4, RNAs de clones de e. coli para expressar um quimérico ELVd formam contendo o aptamer espinafre (98 nt) e o aptamer de vinculação streptavidin (42 nt), respectivamente. (B) Lane 3, RNAs de um clone de e. coli para expressar uma forma de ELVd quimérico contendo um 42 bp-long double encalhado do RNA. Setas vermelhas apontam para os RNAs circulares recombinantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Circularidade do RNA recombinante produzido em Escherichia coli usando o sistema baseado em viroid. Total RNAs de um clone de e. coli para expressar um ELVd quimérico que contém o aptamer de espinafre foram separados por 2D desnaturação página primeiro sob alta e, em seguida, sob baixa força iônica. Os géis foram corados com brometo de etídio. As setas azuis indicam as direções de migração eletroforética. A seta vermelha aponta para o ELVd-espinafre circular que é seletivamente adiado desde as contrapartes lineares do mesmo tamanho durante as duas separações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Purificação cromatográfica de uma recombinação RNA produzido em Escherichia coli usando o sistema baseado em viroid. Total RNAs de um clone de e. coli que produz um quimérico ELVd-3' CITE (55 nt) foram carregados em uma coluna de cromatografia DEAE que foi lavada na presença de 150 mM de NaCl. RNA foi eluído na presença de 1 M de NaCl. O cromatograma mostra absorbância a 254 nm (linha azul) e condutividade em mS/cm (linha laranja) versus volume. São indicadas as diferentes etapas da separação cromatográfica (regeneração de equilibração, injeção, lavagem, eluição e coluna). Fracções recolhidas também são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Purificação a homogeneidade de uma recombinação RNA produzido em Escherichia coli usando o sistema baseado em viroid. Total RNAs de um clone de e. coli que produz um quimérico ELVd-3' CITE foram primeiro purificado por cromatografia utilizando uma coluna DEAE-Sepharose e então separados por página 2D. Gel de primeira foi executado sob condições (8 M de ureia, tampão TBE) de desnaturação. Após coloração com brometo de etídio, a banda de gel que contém a forma circular do RNA recombinante foi transferida para o topo de um gel de segundo que foi executado sob condição de não-desnaturação (tampão TAE). A acrilamida do segundo gel foi reticulada com N, N'-bis (acryloyl) cystamine, que permitiu a solubilização do fragmento de gel que continha o RNA recombinante puro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Enquanto pesquisava a sequência de ELVd e requisitos de estrutura envolvidos no reconhecimento pela berinjela ligase do tRNA, notamos essa expressão co de ambas as moléculas no host não Escherichia coli levado a uma inesperada grande acumulação de viroid circular formas em células bacterianas19. Entendemos que o grande acúmulo de viroid RNA em e. coli mais provavelmente foi consequência da co, expressando uma molécula de RNA altamente estável, tais como o relativamente pequeno (333 nt), altamente baseada-emparelhado, viroid circular e uma proteína para que este viroid particular exibe alta afinidade. ELVd RNA deve recrutar o ligase do tRNA de anfitrião para mediar sua circularização durante a replicação na planta infectada,17. Embora não tenhamos confirmação experimental, prevemos que ambas as moléculas formam um complexo em e. coli que mais estabiliza o viroid RNA e permite alcançar a notável concentração de 150 mg por litro de bacteriano do ribonucleoprotein cultura que altamente excede aqueles de RNAs endógenos, tais como rRNAs12. Desde que ELVd não Replica em e. coli, nós raciocinou que a inserção de um RNA heteróloga não iria afetar drasticamente a acumulação do RNA viroid-derivado e, na verdade, foi o caso. Esta observação é a base do método para produzir grandes quantidades de recombinante RNA em e. coli que descrevemos aqui. O método utiliza a molécula de RNA circular de ELVd como um andaime no qual é apresentado o RNA de interesse. Para produzir um andaime ELVd circular em e. coli, precisamos expressar um precursor RNA com o domínio duplicado do viroid ribozima. ELVd ribozimas Self cleave muito eficientemente em e. coli e os monómeros viroid resultante são reconhecidos e circularizou pelo co expressa ligase do tRNA. Expressão co o ligase do tRNA é um recurso-chave do sistema. ELVd RNA dificilmente é detectado em e. coli , a menos que esta enzima específica é expressa co12.

Em nosso protocolo, plasmídeo pLELVd-BZB permite inserir o cDNA correspondente para o RNA de interesse pela montagem de Gibson simples e eficiente entre as posições U245 e U246 de ELVd. Este site corresponde ao terminal loop de um grampo de cabelo longo presente na mais provável ELVd conformação24,25. Inserção nesta posição particular deve promover que o RNA de interesse sobressai do cadafalso muito estável formado por ELVd e deve evitar interação intramolecular entre o RNA de interesse e ELVd (Figura 1). Não exploramos o efeito de inserir o RNA de interesse em posições alternativas da molécula ELVd. Plasmídeo p15LtRnlSm permite expressão co da berinjela ligase do tRNA. RNAs são transcritas em ambos Plasmideos sob o controle de um forte constitutiva Escherichia coli promotor, lipoproteína de mureína ou seja (lpp). Isto torna o sistema constitutivo sem necessidade de indução. No entanto, também construímos um plasmídeo semelhante (p15tRnlSm) para expressar a ligase do tRNA sob o controle do polymerase de RNA T7 fago em um sistema inducible do isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Usando este plasmídeo, acumulação do RNA recombinante só ocorre após a indução da expressão de tRNA ligase pela adição de IPTG12. No sistema atual, o RNA de interesse é expressa de um plasmídeo número elevado de cópia com pUC origem de replicação, enquanto a ligase do tRNA é expressa de um plasmídeo número moderado de cópia com origem de replicação de p15A. Se alterar o número de cópia de ambos envolvidos no sistema de plasmídeos melhora acúmulo da recombinação RNA não tem sido explorado até agora. A escala do tamanho do RNA de interesse admitido pelo sistema não foi sistematicamente investigado também, apesar de RNAs pequeno logicamente espera-se que se acumulam a umas concentrações mais elevadas que os maiores.

Uma das razões por que a produção de RNA recombinante in vivo não é fácil é provavelmente devido a intrínseca baixa meia-vida de moléculas de RNA. Nosso sistema não é alheio a este problema. Na verdade, em uma tarde Escherichia coli crescendo fase, acúmulo de RNA recombinante começa a diminuir para praticamente desaparecer12. Isso força um para encontrar a janela certa para colher as células. Observamos, porém, que esta janela é grande o suficiente para tornar o sistema amigável. No entanto, observou-se também que a janela ideal depende de vários fatores incluindo o particular Escherichia coli estirpe, meio de cultura, condições (agitação, volume do frasco, aeração, etc..) e a fase fisiológica das bactérias a crescer usado para iniciar a cultura líquida. É recomendável começar a produção de RNA recombinante usando fresco Escherichia coli colônias de uma placa inoculada no dia anterior e cultivadas a 37 ° C. Placas de armazenar na geladeira faz com que a janela de colheita mais imprevisível. Obtivemos os resultados mais consistentes, iniciando culturas líquidas com bactérias colhidas a partir de uma placa com um palito. O uso de uma pre-cultura líquido, particularmente se saturado, também conduz à variabilidade no protocolo de produção.

Em relação a purificação, tratamento de células bacterianas com fenol: clorofórmio é uma maneira muito eficaz para quebrar as células e permite a recuperação quantitativa do RNA total bacteriana na fase aquosa. Dependendo da aplicação a jusante do RNA recombinante, esta fase aquosa ou a preparação que resulta da precipitação do RNA partir desta fase aquosa com um álcool pode ser o suficiente. Se mais purificação é necessário, é recomendável cromatografia de troca aniónica usando uma coluna de troca de ânion DEAE (Figura 5). Esta etapa de purificação permite a remoção eficiente de DNA e metabólitos bacterianos que também particionado em fase aquosa. Se o aplicativo a jusante do RNA recombinante requer purificação de homogeneidade, o sistema viroid-derivado oferece uma clara vantagem quando comparado a outros métodos. Desde uma fração principal do RNA recombinante é produzida como uma forma circular, pode tirar partido desta propriedade para separá-lo da maior parte dos RNAs bacterianas. RNAs circulares experimentam um atraso na migração eletroforética em condições no que diz respeito as contrapartes lineares do mesmo tamanho22de desnaturação. Este atraso é mais pronunciado quando o RNA é electrophoresed sob baixa força iônica. Na prática, lata de RNAs circular também foram separadas por página desnaturação bidimensional em alta e baixa força iônica (Figura 4). Após a separação eletroforética, o RNA recombinante deve ser eluído do gel. O uso de um cross-linker reversível de acrilamida, tais como N, N'-bis (acryloyl) cystamine23, facilita a recuperação, particularmente quando purificar grandes quantidades de RNA (Figura 6). Finalmente, se o aplicativo a jusante do RNA produzido exige separação do RNA de interesse do cadafalso viroid, nosso protocolo não oferece nenhuma vantagem específica para métodos anteriores. O RNA de interesse deve ser extirpado da molécula quimérico usando algumas das estratégias descritas anteriormente, tais como o uso das ribozimas, DNAzymes ou, possivelmente, mais eficiente, o uso de RNase H guiado por dois oligonucleotídeos de DNA7. Tentando evitar esta última etapa de purificação pesado, temos trabalhado na tentativa de reduzir o tamanho do cadafalso viroid, embora com sucesso parcial. Fomos capazes de produzir quantidades notáveis de RNA recombinante usando formulários viroid eliminado (175, 215 e 246 nt) mas aumentar as exclusões do cadafalso viroid correlacionados com diminuindo acúmulo12.

Em suma, um protocolo é descrito aqui para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em e. coli que, a nosso conhecimento, melhora o rendimento dos métodos publicados anteriormente. O protocolo é baseado de co expressão em e. coli do RNA de interesse inserido em um andaime viroid (ELVd) e a berinjela ligase de tRNA, a enzima que circularizes este viroid em plantas infectadas. Uma característica distintiva do nosso protocolo é essa recombinação que RNA é produzido principalmente como uma forma circular, uma propriedade que facilita a purificação de homogeneidade para aplicações a jusante. Usando este protocolo dezenas de miligramas de recombinação que RNA pode ser facilmente produzido por cada litro de cultura de Escherichia coli em condições laboratoriais regulares.

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Disclosures

Os autores declaram que a tecnologia descrita neste protocolo foi patenteado (nos patente no. EP14382177.5, PCT/EP2015/060912).

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP do espanhol Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co-financiado fundos do FEDER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

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References

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Bioquímica edição 141 RNA recombinante RNA circular viroid ligase do tRNA RNA aptamer Escherichia coli
Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em <em>Escherichia coli</em>
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Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

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