Hier beschreiben wir die wesentlichen Schritte für die ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen, die von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) in der in-vitro- Rückenmark-Slice. Diese Methode ermöglicht die innere Membran Eigenschaften, synaptische Übertragung und morphologische Charakterisierung der SG Neuronen untersucht werden.
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Methodenartikel
Vorbereitung der akuten Rückenmark Scheiben auf Whole-Cell Patch-Clamp-Aufnahme in den Neuronen der Substantia Gelatinosa
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ganze Zelle Patch-Clamp-Studien von Neuronen der Substantia Gelatinosa (SG) haben einen großen Bestand an Informationen über die Wirbelsäulen Mechanismen sensorischer Übertragung, nozizeptiven Regulierung und chronische Schmerzen oder Juckreiz Entwicklung zur Verfügung gestellt. Implementierungen von elektrophysiologische Aufnahmen zusammen mit morphologischen Studien basierend auf die Nützlichkeit des akuten Rückenmark Scheiben haben unser Verständnis der neuronalen Eigenschaften und die Zusammensetzung der lokalen Schaltung in SG weiter verbessert. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche und praktische Anleitung für die Zubereitung von Rückenmark Scheiben und zeigen repräsentative ganze Zelle Aufnahme und morphologischen Ergebnisse. Dieses Protokoll ermöglicht ideale neuronalen Erhaltung und in-Vivo -Bedingungen bis zu einem gewissen Grad zu imitieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, die Fähigkeit, eine in-vitro- Vorbereitung des Rückenmarks Scheiben zu erhalten ermöglicht stabile Strom und Spannung-Klemme Aufnahmen und könnte somit detaillierte Untersuchungen in der inneren Membran Eigenschaften, lokalen Schaltung erleichtern und neuronale Struktur mit vielfältigen experimentellen Ansätzen.
Einleitung
Die Substantia Gelatinosa (SG, Lamina II der spinalen Hinterhorn) ist ein unbestreitbar wichtig Relais für Sende- und Regulierung von sensorischen Informationen. Es besteht aus exzitatorischen und inhibitorischen Interneuronen, die Eingänge von den primären afferenten Fasern, lokale Interneuronen und der endogenen absteigenden hemmenden System1erhalten. In den letzten Jahrzehnten konnten die Entwicklung der akuten Rückenmark Slice Vorbereitung und dem Aufkommen der gesamten Zelle Patch-Clamp-Aufnahme verschiedene Studien über die inhärenten elektrophysiologischen und morphologischen Eigenschaften von SG Neuronen2,
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Protokoll
Die Tier Ethik Komitee von Nanchang University (Nanchang, VR China, ethische No.2017-010) stimmten alle experimentelle Protokolle beschrieben. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um den Stress und die Schmerzen der Versuchstiere zu minimieren. Die elektrophysiologischen Aufnahmen, die hier aufgeführt wurden bei Raumtemperatur (RT, 22 – 25 ° C) durchgeführt.
(1) Tiere
- Verwenden Sie Sprague-Dawley Ratten (3 – 5 Wochen alt) beiderlei Geschlechts. Beherbergen Sie die Tiere unter einer 12 h hell-dunkel-Zyklus und Ihnen Sie Ad Libitum Zugang zu angemessener Nahrung und Wasser.
2. Vorbereitung ....
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Ergebnisse
Akuten Rückenmark Scheiben wurden entsprechend dem Diagramm in Abbildung 1dargestellte vorbereitet. Nach dem Schneiden und Wiederherstellung wurde eine Rückenmark-Scheibe zur Aufnahme Kammer übertragen. Gesunde Neuronen wurden identifiziert, basierend auf Soma Auftritt mit IR-DIC Mikroskopie. Als nächstes wurden die Aktionspotentiale der SG Neuronen durch eine Reihe von depolarisierende Stromimpulse (1 s Dauer) ausgelöst wenn Neuronen bei RMP gehalten wurden........
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Diskussion
Dieses Protokolldetails der Schritte für die Zubereitung von Rückenmark Slices, die wir erfolgreich eingesetzt haben, wenn ganze Zelle Patch-Clamp-Experimenten auf der SG Neuronen18,19,20,21. Durch die Implementierung dieser Methode, wir berichteten kürzlich, dass Minocyclin eine zweite Generation von Tetracyclin, inhibitorischen synaptischen Übertragung durch einen präsynaptischen Mechanismus .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr. 81560198, 31660289).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | Zur Herstellung von ACSF und PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Zur Herstellung von ACSF, Saccharose-ACSF und K+-basierter intrazellulärer Lösung |
| NaH2PO4· 2H2O | Sigma | 71500 | Zur Herstellung von ACSF, Saccharose-ACSF und PBS |
| CaCl2· 2H2O | Sigma | C5080 | Zur Herstellung von ACSF und Saccharose-ACSF |
| MgCl2· 6H2 | O Sigma | M2670 | Zur Herstellung von ACSF und Saccharose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Zur Herstellung von ACSF und Saccharose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Zur Herstellung von ACSF |
| Ascorbinsäure | Sigma | P5280 | Zur Herstellung von ACSF und Saccharose-ACSF |
| Natriumpyruvat | Sigma | A7631 | Zur Herstellung von ACSF und Saccharose-ACSF-Saccharose |
| Sigma | S7903 | Zur Herstellung von Saccharose-ACSF | |
| K-Gluconat | Wako | 169-11835 | Zur Herstellung von K+-basierter intrazellulärer Lösung |
| Na2-Phosphokreatin | Sigma | P1937 | Zur Herstellung der intrazellulären Lösung |
| EGTA | Sigma | E3889 | Zur Herstellung der intrazellulären Lösung |
| HEPES | Sigma | H4034 | Zur Herstellung der intrazellulären Lösung |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Zur Herstellung der intrazellulären Lösung |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Zur Herstellung von intrazelluläre Lösung |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Zur Herstellung von Cs+basierter intrazellulärer Lösung |
| CsCl | Sigma | C3011 | Zur Herstellung von Cs+basierter intrazellulärer Lösung |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Zur Herstellung von Cs+-basierter intrazellulärer Lösung Lösung |
| Neurobiotin 488 | Vektor | SP-1145 | 0,05% Neurobiotin 488 könnte für morphologische Studien verwendet werden |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% Agarblock wurde in unserem Protokoll verwendet |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | 4% Paraformaldehyd wurde für die immunhistochemische Verarbeitung verwendet |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagenzien | für die Herstellung von PBS | |
| Mount Deckglas | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1,5 g/kg, i.p. |
| Kapillaren aus Borosilikatglas | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1,5 mm OD, 1,12 mm ID |
| Mikropipettenabzieher | Sutter Instrument | P-97 | Wird für die Vorbereitung von Mikropipetten |
| verwendet Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Schwingungsisolationstisch | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrarot-CCD-Kamera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-Clamp Verstärker | HEKA | EPC-10 | |
| Mikromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y Tisch | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Aufrechtes Mikroskop | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH Meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol Mikroskop | Zeiss | LSM 700 |
Referenzen
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
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Nachdrucke und Genehmigungen
