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Neuroscience

凝胶神经元全细胞斑块夹的急性脊髓切片的制备

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/58479
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 2, 2,3
1Department of Pain, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 2Department of Pediatrics, First Affiliated Hospital of Nanchang University, 3Center for Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Nanchang University

Summary

在这里, 我们描述了由体外脊髓切片中的明胶 (sg) 神经元制成的全细胞膜片夹记录的基本步骤。该方法可对 sg 神经元的固有膜特性、突触传递和形态表征进行研究。

Abstract

最近的全细胞膜片钳研究从明胶 (sg) 神经元提供了大量的信息, 有关脊柱机制的基础感觉传递, 诱发电位调节, 慢性疼痛或瘙痒的发展。在急性脊髓切片的效用基础上, 实施电生理记录和形态学研究, 进一步提高了我们对 sg 中神经元特性和局部电路组成的认识。在这里, 我们提出了一个详细和实用的指南, 为脊髓切片的制备, 并显示具有代表性的全细胞记录和形态学结果。该协议允许理想的神经元保存, 并能在一定程度上模拟体内条件。总之, 能够获得脊髓切片的体外准备, 可以稳定的电流和电压夹具记录, 从而有助于对固有膜特性、局部电路和神经元结构使用不同的实验方法。

Introduction

胶质 (sg, 脊髓背角的层 ii) 是一个无可争辩的重要中继中心, 用于传输和调节感官信息。它由兴奋和抑制间神经元组成, 接收来自初级传入纤维、局部神经元间和内源性下降抑制系统1的输入。近几十年来, 急性脊髓切片制剂的发展和全细胞膜片夹具记录的出现, 使 sg2的内在电生理和形态特性的各种研究,3 个,4并且地方电路的研究在 sg5,6。此外, 通过体外脊髓切片制剂, 研究人员可以解释神经元兴奋性的变化 7,8, 离子通道9,10, 和突触活动11,12在各种病理条件下。这些研究加深了我们对 sg 神经元在慢性疼痛和神经病理性瘙痒的发展和维持中的作用的理解。

从本质上讲, 实现神经元 soma 的清晰可视化和理想的全细胞修补使用急性脊髓切片的关键先决条件是确保切片的优良质量, 从而获得健康和可修补的神经元。然而, 准备脊髓切片涉及几个步骤, 如进行腹侧椎板切除术和去除皮-蜘蛛核细胞膜, 这可能是获得健康切片的障碍。虽然准备脊髓切片并不容易, 但在体外对脊髓切片进行录音有几个优点。与细胞培养制剂相比, 脊髓切片可以部分保存生理相关条件下的固有突触连接。此外, 使用脊髓切片的全细胞膜片夹具记录可与其他技术相结合, 如双膜片钳13、14、形态学研究15、16和单细胞 rt-pcr17. 因此, 这项技术提供了更多关于特定区域内解剖和遗传多样性特征的信息, 并可以调查当地电路的组成。

在这里, 我们提供了一个基本和详细的描述, 我们的方法准备急性脊髓切片和获取全细胞膜片夹从 sg 神经元。

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Protocol

所描述的所有实验方案均获得南昌大学动物伦理委员会 (南昌, 中国, 道德号 2017-010号)。所有的努力都是为了最大限度地减少实验动物的压力和痛苦。在室温下进行的电生理记录 (rt, 22–25°c)。

1. 动物

  1. 使用 sprague-dawley 大鼠 (3-5周大) 的任何性别。将这些动物以12小时的光暗循环居住, 让它们获得足够的食物和水。

2. 溶液和材料的制备

  1. 解决 方案
    1. 准备人工脑脊液 (acsf) (mm): 117 ncl, 3.6 kcl, 1.2 nah2po 4·2hp4 2H, 2.5 cl 2·2h 2H, 1.2 mgcl 2·6hco2 o, 25 nahco3, 11 d-葡萄糖, 0.4 抗坏血酸, 和 2丙酮酸钠。请参见表 1。
    2. 制备蔗糖 acsf (mm): 240 蔗糖、2.5 kcl、1.25 nah 2H4·22o、0.5 ccl 2·2h 2 o、3.5 mgcl 2·6h 2 o、25纳哈科酸3、0.4 抗坏血酸和2钠丙酮酸.请参见表 2。
    3. 制备 k+基细胞内溶液 (mm): 130 k-葡萄糖酸、5 kcl、10 na 2-磷酸酯、0.5 egta、10 hepes、4 mg-atp 和0.3 锂-gtp。请参见表 3。
    4. 制备 c+基细胞内溶液 (mm):92 csmeso 4, 43 CsMeSO,10 na 2-磷酸胺, 5 四乙胺 (tea)-cl, 0.5 egta, 10 hepes, 4 mg-atp, 和0.3 锂离子-gtp。见表 4。
      注: 所有溶液必须使用蒸馏水制备。acsf 和蔗糖 acsf 在使用前应进行加氢化 (95% o2和 5% co2混合物), 以保持约7.4 的最佳 ph 值, 并且应将这两种溶液的渗透性调整为 300–310 mosm。因为抗坏血酸可能会影响钙通道, 如果你想记录钙电流, 这种剂必须省略。细胞内溶液的渗透性和 ph 值应分别测量和调整为290-300 平方米和7.2-7.3。建议用0.2μm 过滤器过滤细胞内溶液, 并在-20°c 时将溶液存储为1毫升的 aliquots。在 c + 基细胞内溶液中应用 c+和 tea 阻断钾通道, 这有利于利用放大器在记录突触后抑制电流 (ipsc) 时, 将膜电位稳定在 0 mv。
    5. 准备0.05% 的神经生物素488溶液。在 k+基细胞内溶液中溶解2毫克神经生物素 488, 并在需要时使用蒸馏水或蔗糖将渗透性调整为 290-300 mosm。
      注: 1 mm 的蔗糖增加渗透性 1 mosm。
    6. 准备3% 的琼脂作为脊髓阻滞。将7.5 克琼脂溶解在250毫升的纯净水中, 放入玻璃烧杯中, 然后使用微波炉加热, 直至沸腾并清除。旋转溶液, 然后将混合物倒入17.5 厘米 x 10.5 厘米 x 1.8 厘米的塑料盒中进行固化。使用前将琼脂保持在4°c。
    7. 制备4% 的聚甲醛 (pfa) 进行免疫组织化学处理。将40克 pfa 粉末混合到 ~ 800 ml 加热 (约 60°c) 1x pbs 溶液 (130 mm nacl, 7 mLna2 hpo 4, 3 mL nah 2 po 4).通过添加 1 n naoh 下降慢慢调整 ph 值, 直到 pfa 粉末完全溶解。一旦解决方案变得清晰, 用 1x pbs 将总体积调整为1升。在需要时使用 1 n hcl 将 ph 值重新调整为 7.2–7.4, 然后过滤 4% pfa 溶液, 并将其存储在-20°c, 直至使用。
      注意: pfa 是有毒的, 所以需要戴口罩、手套以及安全眼镜。在通风罩内进行 4% pfa 的准备过程。pfa 粉末可以在 ph 值约为9–10的情况下完全溶解。
  2. 仪器
    1. 对于典型的电生理系统, 使用配备红外差分干涉对比度 (ir-dic) 的立式显微镜和高分辨率水浸目标、ccdcmmos 摄像机、膜片钳放大器、微移液器支架和微机械手, 允许微调移液器的位置。移动显微镜也需要一个 xy 阶段。
    2. 将所有设备安装在由法拉第笼包围的隔振台上。将视频监视器连接到摄像机, 观察神经元并可视化微移液器。
  3. 微型移液器
    1. 使用微移液器拉拔器从硼硅酸盐玻璃毛细血管中制作记录电极。典型的移液器电阻范围为 3-6 mω, 当填充细胞内的解决方案。
  4. 阿加尔块
    1. 准备一个1.2 厘米 x 1.5 厘米 x 2.0 厘米的琼脂块。根据需要将块修剪成图1所示的形状。

3. 急性脊髓切片的制备

注: 横断或寄生虫脊髓切片按前面所述的18、19、20。

  1. 在心脏灌注和脊髓摘除之前, 准备 ~ 500 毫升蔗糖 acsf 与 95% o- 2 和 5% co2 平衡, 冷却治疗冰寒 (0-4°c) 的溶液.
  2. 冷却冰上的所有解剖工具 (如解剖剪刀、虹膜剪刀、齿形钳、细钳、弯曲钳)。图1显示了急性脊髓切片的制备示意图。
  3. 心肺灌注
    1. 在一次注射聚氨酯 (1.5 g/kg) 后, 等待 2-3分钟, 并通过测试脚趾或尾巴的夹紧反应来评估大鼠的麻醉深度。一旦保持麻醉的手术平面, 将大鼠放在被压碎的冰上的仰角位置。
      注意: 为了产生深刻的麻醉足以在开胸手术中不感知疼痛, 请遵循您当地的 iacuc 指南。
    2. 通过皮肤从小管过程到锁骨的切口 (3-4 厘米), 然后在小灵过程的水平下做一个横向切口。
    3. 用一对弯曲的钳子抓住和提高香形过程, 将隔膜完全暴露出来。通过横切口通过横隔膜, 然后通过胸骨和肋骨之间的胸腔双侧切开胸腔。使用弯曲的钳子抓住的过程, 使胸腔固定, 心脏充分暴露。
    4. 用另一个弯曲的钳子轻轻握住心脏, 然后将 22 g 针插入左心室主动脉弓的底部。
    5. 立即用精细的剪刀切割右心房, 然后通过重力系统开始对冰凉、含氧蔗糖 acsf 进行灌注。
      注意: 快速和足够的心周灌注与冰凉蔗糖 acsf 可以促进脊髓的快速冷却, 而低钠和钙浓度可以帮助减轻兴奋毒性和保护神经元功能。此外, 在进行形态研究时, 清除红血球将有利于减少生物环素的背景染色。只要右心房流出的液体清晰, 大鼠肝脏和爪子的颜色较浅, 灌注就被认为是足够的, 也是令人满意的。22 g 针的尖端应钝化, 以避免心脏和主动脉弓破裂。
  4. 脊髓解剖和切片
    1. 在从尾端到左旋的背部皮肤上做一个纵向切口 (5 厘米), 然后在灌注状态下, 通过脊椎和肋骨两侧的胸腔进行切割。
    2. 在脊椎的尾端进行切割, 用剪刀剪掉周围的组织, 迅速隔离脊椎的腰椎部分。
    3. 将腰椎段转移到含有冰凉蔗糖基 acsf 的玻璃盘子中。与腹侧向上, 使用精细的剪刀切开椎弓根双侧, 并仔细暴露脊髓。隔离2厘米长的脊髓与腰椎增大 (L1–S3), 并将脊椎部分转移到另一个玻璃盘充满冷蔗糖 acsf。
    4. 在解剖显微镜下取出脑膜和皮-蜘蛛核细胞膜。尽快将所有的腹侧和背根剪掉。
    5. 将脊髓放在先前修剪过的琼脂块上。准备横片, 将脊髓的腹侧连接到琼脂上, 让背侧朝向刀片。要准备寄生虫片, 用超胶在垂直方向上将腹侧与琼脂连接, 如图 1所示。然后, 将琼脂块安装到带有超胶的振动体平台上。准备300–500μm 横向或寄生虫片, 前进速度为0.025 毫米, 振动频率为 80 hz。
    6. 使用塑料修剪的移液器将切片转移到存储室中的尼龙网上, 在32°c 下连续氧化 acsf, 在记录前至少30分钟。
      注意: 在切除脑膜和脊髓根时, 要注意避免脊髓受伤, 特别是背角。脊髓应该在腹侧切片。为了获得最佳效果, 切片应快速制备 (15-20分钟内)。脊柱切片的厚度不应超过 600μm, 以满足细胞可见性。此外, 上述技术可用于获得水平脊柱切片。

4. 全电池膜片记录

  1. 要从 sg 神经元进行全细胞膜片钳记录, 在大多数记录情况下使用 k+基细胞内溶液, 而仅应用 c+为基础的解决方案用于记录突触后电流的抑制。
  2. 轻轻地将脊髓切片移动到记录室, 然后用 u 形铂金线牢固地连接尼龙线进行维护, 以获得最佳切片稳定性。通过重力系统在 rt 中将切片与气泡 acsf 一起稳步注入, 并将灌注率设置为 2-4 mL/min, 以实现足够的氧合。
  3. 使用低分辨率显微镜镜头识别 sg (半透明带) 的区域, 使用高分辨率目标作为目标单元选择健康的神经元, 并将其调整到视频监视器屏幕的中心。
  4. 根据需要将微型移液器填充适当体积的 k+基或 c+基细胞内溶液, 将微移液器插入电极支架, 并确保细胞内溶液与内的银线接触。持有。
  5. 将微型移液器聚焦并使用微机械手将其浸入 acsf, 然后施加温和的正压 (用压力计测量时的 ~ 1 psi), 以迫使微移液器远离任何污垢和碎屑。
  6. 将微型移液器逐渐向目标神经元移动。一旦移液器接近神经元, 在神经元膜上释放出正压, 形成一个巨大的小窝。
  7. 将保持电位更改为-70 mv, 接近细胞的生理静息膜电位 (rmp)。然后, 对微移液器进行瞬态和温和的吸力, 使膜破裂, 并创建良好的整个细胞结构。
    注意: 将切片转移到记录室后, 确保稳定灌注至少 5分钟, 以清除切片表面的碎屑。值得注意的是, 区分健康和不健康的神经元的能力对于良好的密封和稳定的记录至关重要。一个不健康的/死的神经元有一个肿胀或萎缩的外观, 以及一个可见的大核, 而一个健康的神经元的特点是一个三维 (3d) 形状与一个明亮和光滑的膜, 其核心是看不见的。为了实现整个单元配置, 在必要时必须逐步补偿快速或慢速电容。在 rt, 在 k+基溶液和 c + 基细胞内溶液中, 液体结电位分别为 15.1-15.2 mv 和 4.3-4.4 mv.在我们的研究中, 记录的数据没有被纠正液体结电位。
  8. 固有膜特性的记录
    1. 记录被动固有膜特性: 在破门而入后立即记录 rmp (20秒内)。通过测量在 rmp 模式下对去极化电流 (10 pa, 500 ms) 的电压响应来确定神经元输入电阻。
    2. 记录发射特性: 在 rmp 处使用一系列 1 s 去极化电流脉冲 (25–150 pa, 25 pa 增量) 测试电流夹中每个神经元的发射模式。离线测量单个动作电位的阈值、振幅和半宽。
    3. 记录亚阈值电流: 为了评估体细胞亚阈值电流, 在电压夹紧模式下将膜电位保持在-50 mv。然后, 应用从-60 mv 到-120 mv 的1秒持续时间的一系列超极化电压脉冲, 具有 10 mv 的衰减。
    4. 记录兴奋突触后电流 (epsc): 在电压夹紧模式下记录 epsc 与 k+为基础的细胞内解决方案, 保持电位为-70 mv。
    5. 记录 ipsc: 应用基于 c+的蜂窝内解决方案来记录 ipsc。一旦建立了全细胞结构, 将膜电位保持在-70 mv ~ 5分钟, 然后将保持电位逐渐改变为 0 mv。等待几分钟以保持稳定, 然后开始记录 ipsc 事件。
      注意: 只有 rmp 小于-50 mv 并显示超调的神经元才应选择进行进一步研究。我们研究中的串联电阻通常为 10-30 mω, 一旦串联电阻变化超过 20%, 则应排除记录。epsc 可以用 50μm apv 和 20μm cnqx 的浴应用来确认, 而 ipsc 可以用10μm 双核线和1μm 马钱子碱确认。

5. 形态研究

  1. 对于形态实验, 使用基于 k+的细胞内溶液, 其中含有0.05% 的神经生物素488。
  2. 在保持至少20分钟的稳定电生理记录后, 在向上方向慢慢取出微移液器, 使细胞膜重新密封并将脊髓切片转移到充满 4% pfa 的容器中。在 rt 的 4% pfa 中固定1小时, 然后在4°C 隔夜修复。
  3. 在 pbs 中冲洗切片, 然后将其浸入50% 的乙醇中30分钟。在 pbs 中再洗三次后, 将原始厚度的切片安装到带有安装介质的幻灯片上。
  4. 使用共聚焦显微镜 (见材料表) 进行图像采集和神经元三维重建。通过具有1.5μm 的 z 堆栈的20x 镜头扫描神经元。

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Representative Results

根据图 1所示的图表制备了急性脊髓切片。切片和恢复后, 脊髓切片被转移到记录室。利用 ir-dic 显微镜, 根据 soma 的外观鉴定了健康的神经元。其次, 当神经元在 rmp 上保持时, 一系列的去极化电流脉冲 (1秒) 激发了 sg 神经元的动作电位。如图 2所示, 在 sg 神经元中观察到的发射模式包括扁桃体发射、延迟发射、杂波发射、初始爆裂、相位爆裂、单尖峰和不情愿发射, 这些都已在前面的研究中进行了描述和分类。

为实现这一准备, 我们还记录了电压夹具中的亚阈值电流和自发出现的电流。图 3 a给出了亚阈值电流的代表性痕迹, 包括超极化激活电流 (i h)、t 型钙电流 (it) 和 a 型钾电流 (ia)。这些电流是通过将细胞保持在-50 mv 并逐渐进入-60 到-120 mv 的10-mv 减少而获得的。我是通过超极化电压步长激活的。然而, it和 ia 被通过超极化前脉冲激活, 从失活中释放, 然后产生去极化电压。图 3 b分别从 sg 神经元记录的3c 显示代表性自发 epsc (sEPSCs) 和 ipsc (sipsc)。利用微型分析软件离线分析了这些突触事件的振幅和频率。

为了表征神经元的形态特征, 应用了寄生虫切片, 因为大多数 sg 神经元具有明显的树突状树的树突状扩散, 并在细胞内溶液中加入神经生物素488。通过共聚焦显微镜成像, 评估了神经元瘤的大小及其树突状过程的范围和尺寸。如前所述, sg 神经元表现出形态上的区别, 可分为中心细胞、径向细胞、垂直细胞、胰岛细胞和未分类细胞。图 4显示了这些细胞的代表性显微图像。

Figure 1
图 1: 急性脊髓切片制备示意图.用尿深度麻醉后, 大鼠经心外灌注与冰凉加加碳蔗糖-acsf。然后快速解剖脊柱, 并进行腹侧椎板切除术。切除脑膜、皮-蜘蛛核细胞膜和附着的脊髓神经根。然后, 脊髓标本被安装在琼脂糖块上。横向或寄生虫切片根据需要用振动体切割。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: sg 神经元的射击模式.射击模式是通过在 rmp 处向 sg 神经元注入一系列1的去极化电流脉冲来确定的。射击模式可分为射击、延迟射击、射门、初始爆裂、相爆、单尖峰和不情愿射击。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: sg 神经元中的电压夹记录.(a) 显示对超极化电流注入的反应的代表性痕迹, 分为 ih、ia和 it.下面的面板显示了电压夹具中亚阈值电流的调用协议。(b) 在没有和存在 50μm apv 和 20μm cnqx 的情况下, 从 sg 神经元记录的 sEPSCs 的代表性痕迹为-70 mv。较低的连续跟踪 (显示在 apv 和 cnqx 的作用之前 (左) 和 (右) (右) 的扩展时间尺度中, 对应于图表记录下方显示的条形图所示的句点。(c) 在10μm 双核线和1μm 马钱子碱的缺失和存在下, 从 sg 神经元记录的 sIPSCs 的代表性痕迹。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 大鼠 sg 神经元的代表性形态.根据共聚焦显微镜图像中显示的 soma 大小和树突性质, soma 神经元可分为中心细胞 (a)、径向细胞 (b)、垂直细胞 (c)、胰岛细胞 (d) 和未分类细胞 (e).v: 腹侧;d: 背侧;r: 根;c: 尾端。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

组件 分子量 浓度 (mm) 格内
Nacl 58。5 117 6.84
氯化钾 74。5 3。6 0.27
nah2H4·2h2 o 156 1。2 0.19
ccl2·2h2o 44r 2。5 0.37
mgcl2·6h2o 203 1。2 0.24
纳赫科3 84 25 2。1
d-葡萄糖 180元 11 1.98
抗坏血酸 198.11 0。4 0.08
丙酮酸钠 1110 2 0.22

表 1: acsf 的配方。

组件 分子量 浓度 (mm) 格内
Nacl 58。5 117 6.84
氯化钾 74。5 3。6 0.27
nah2H4·2h2 o 156 1。2 0.19
ccl2·2h2o 147 2。5 0.37
mgcl2·6h2o 203 1。2 0.24
纳赫科3 84 25 2。1
d-葡萄糖 180元 11 1.98
抗坏血酸 198.11 0。4 0.08
丙酮酸钠 1110 2 0.22

表 2: 蔗糖 acsf 配方。

组件 分子量 浓度 (mm) mg/100 毫升
k-葡萄糖酸 234。2 1130 3044。6
氯化钾 74。5 5 37.28
钠2-磷酸酯 453.38 10 453.38
egta 380.35 0。5 19.02
hepes 238.31 10 238。3
mg-atp 507.18 4个 202。9
lygtp 523.18 0。3 15。7

表 3: 基于 k+的细胞内溶液的配方。

组件 分子量 浓度 (mm) mg/100 毫升
csmeso4 228 92 2097。6
Cscl 168.36 43 723.95
钠2-磷酸酯 453.38 10 453.38
tea-cl 165.71 5 82.86
egta 380.35 0。5 19.02
hepes 238.31 10 238。3
mg-atp 507.18 4个 202。9
lygtp 523.18 0。3 15。7

表 4: 基于 c+的细胞内溶液的配方。

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Discussion

该协议详细介绍了准备脊髓切片的步骤, 我们在 sg 神经元18、19、20、21上进行全细胞膜片时成功地使用了脊髓切片。通过实施这种方法, 我们最近报告说, 米诺环素, 第二代四环素, 可以显著提高抑制突触传递通过突触前机制在 sg 神经元19。此外, 该制剂可降低 ih 的振幅, 进一步抑制 sg 神经元21的兴奋性。为了支持这些已公布的数据和我们在这里展示的代表性结果, 目前描述的方法适合在广泛的电生理研究中使用。

正如我们前面所指出的, 经心灌注是获得健康标本的关键因素。首先, 我们使用冰凉溶液灌注, 使脊髓可以迅速冷却, 神经元代谢可以减缓 22.其次, 蔗糖取代 acsf 是一种低钠+浓度的 "保护性切割" 溶液, 可以改善被动 na+流入,从而减少通过进水23的神经元水肿。第三, 通过灌注可以最大限度地减少生物细胞素22引起的背景, 因此获得和分析神经元形态是有益的。对于成功的制备, 使用一些抗氧化剂来减少氧化损伤也很重要, 这使得神经元保存24。因此, 在我们的协议中, 我们补充抗坏血酸和丙酮酸钠, 它们是强大的抗氧化剂, 可以有效地改善脊髓切片中的水肿, 在 acsf 和蔗糖 acsf。此外, 根据我们的经验, 我们可以从新生儿以及3-10周大 sd 大鼠中成功获得健康的脊髓切片。因此, 为了使这一协议成功, 我们建议使用小于10周的 sd 大鼠。

在进行 "腹侧" 椎板切除术并切除脑膜和脊髓神经时, 应耐心小心, 避免割断、拉伸或分裂脊髓。在一些研究中, 脊髓切片与附加背根已被用来评估突触传递 sg 神经元接受外周 25,26。在这种情况下, 去除皮-蜘蛛核细胞膜的过程是技术难题, 需要很大的耐心。

这种切片制备技术也有一些局限性。一个明显的缺点是, 尽管急性切片保持了丰富的突触连接, 但它无法反映真实状态, 也无法解决体内到底发生了什么。因此, 一些研究在体内进行了通常进行的 "盲人"27、28、29 的记录。然而, 这种体内方法在技术上具有挑战性, 在没有足够经验的情况下, 很难判断是否从 soma 或树突中进行了录音。我们目前的方法的另一个局限性是, 蔗糖 acsf 可能不足以保存神经元时, 准备切片从老化啮齿类动物。提出了一种以 n-甲基-d-拉卡明为 na+替代品的更新方法, 该优化方法可显著改善急性切片 30、31 中神经元的形态和功能保存. ,32,33。最后, sg 神经元表现出不同的形态和电生理特性3。在忽略异质性的同时, 似乎很难解释从全细胞记录中获得的数据。通过进一步验证记录神经元5的形态细节或使用转基因小鼠,可以帮助研究人员识别特定神经元20,34, 这可能会避免这种限制。此外, 光遗传学, 一个新的工具, 允许控制细胞35的亚群, 可以结合全细胞膜片夹具记录, 以研究特定离子通道或蛋白质的作用, 并研究特定的神经元电路。

总体而言, 这种制备技术是研究 sg 神经元的电生理、形态、药理和生物学特性的理想方法, 并辅以膜片钳记录、免疫荧光染色、特异性激动剂或拮抗剂, 以及单细胞 rt-pcr 技术。此外, 这种方法可以与配对的膜片钳记录或光遗传学一起应用, 因此它是一个有价值的工具, 照亮神经元微电路。

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Disclosures

提交人声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了国家自然科学基金的资助 (81560198、31660289号)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma S7653 Used for the preparation of ACSF and PBS
KCl Sigma 60130 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution
NaH2PO4·2H2O Sigma 71500 Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS
CaCl2·2H2O Sigma C5080 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
MgCl2·6H2O Sigma M2670 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
NaHCO3 Sigma S5761 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
D-Glucose Sigma G7021 Used for the preparation of ACSF
Ascorbic acid Sigma P5280 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sodium pyruvate Sigma A7631 Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF
Sucrose Sigma S7903 Used for the preparation of sucrose-ACSF
K-gluconate Wako 169-11835 Used for the preparation of K+-based intracellular solution
Na2-Phosphocreatine Sigma P1937 Used for the preparation of intracellular solution
EGTA Sigma E3889 Used for the preparation of intracellular solution
HEPES Sigma H4034 Used for the preparation of intracellular solution
Mg-ATP Sigma A9187 Used for the preparation of intracellular solution
Li-GTP Sigma G5884 Used for the preparation of intracellular solution
CsMeSO4 Sigma C1426 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
CsCl Sigma C3011 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
TEA-Cl Sigma T2265 Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution
Neurobiotin 488 Vector SP-1145 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies
Agar Sigma A7002 3% agar block was used in our protocol
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing
Na2HPO4 Hengxing Chemical Reagents Used for the preparation of PBS
Mount Coverslipping Medium Polyscience 18606
Urethan National Institute for Food and Drug Control 30191228 1.5 g/kg, i.p.
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments TW150F-4 1.5 mm OD, 1.12 mm ID
Micropipette puller Sutter Instrument P-97 Used for the preparation of micropipettes
Vibratome Leica VT1000S
Vibration isolation table Technical Manufacturing Corporation 63544
Infrared CCD camera Dage-MIT IR-1000
Patch-clamp amplifier HEKA EPC-10
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285
X-Y stage Burleigh GIBRALTAR X-Y
Upright microscope Olympus BX51WI
Osmometer Advanced FISKE 210
PH meter Mettler Toledo FE20
Confocol microscope Zeiss LSM 700

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References

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