Summary
Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.
Abstract
Recente studies van de gehele-cel patch-clamp van neuronen van de substantia gelatinosa (SG) hebben een grote hoeveelheid informatie over de spinale mechanismen die ten grondslag liggen aan zintuiglijke transmissie, Nociceptieve regulering en chronische pijn of jeuk ontwikkeling gegeven. Implementaties van elektrofysiologische opnamen samen met morfologische studies op basis van het nut van acute ruggenmerg segmenten hebben verder verbeterd ons begrip van neuronale eigenschappen en de samenstelling van lokale circuits in SG. Hier presenteren we een gedetailleerde en praktische gids voor de bereiding van segmenten van het ruggenmerg en Toon representatieve geheel-cel opnemen en morfologische resultaten. Dit protocol staat ideale neuronale behoud en in vivo voorwaarden tot op zekere hoogte kan nabootsen. Kortom, de mogelijkheid om het verkrijgen van een in vitro -voorbereiding van de segmenten van het ruggenmerg stabiele stroom en spanning-kogelklem opnames maakt en dus grondig onderzoek naar de eigenschappen van het intrinsieke membraan, lokale circuits kunnen vergemakkelijken en neuronale structuur met behulp van uiteenlopende experimentele benaderingen.
Introduction
De substantia gelatinosa (SG, lamina II van de spinale dorsale hoorn) is een ontegenzeggelijk belangrijk relay center voor het verzenden en regulering van de zintuiglijke informatie. Het is samengesteld uit excitatory en remmende interneuronen, die ingangen van de primaire afferent vezels, lokale interneuronen en de endogene aflopende remmende systeem1ontvangen. In de afgelopen decennia, hebt de ontwikkeling van acuut ruggenmerg segment voorbereiding en de komst van geheel-cel patch-clamp opname ingeschakeld diverse studies over de intrinsieke elektrofysiologische en morfologische eigenschappen van SG neuronen2, 3 , 4 evenals studies van het lokale circuit in SG5,6. Bovendien, met behulp van de in vitro -voorbereiding van het ruggenmerg-segment, onderzoekers kunnen het interpreteren van de veranderingen in neuronale excitabilities7,8, de functie van ion kanalen9,10, en Synaptic activiteiten11,12 onder verscheidene pathologische condities. Deze studies hebben verdiept ons begrip van de rol die SG neuronen in de ontwikkeling spelen en het onderhoud van chronische pijn en neuropatische jeuk.
In wezen, is de belangrijkste voorwaarde om een duidelijke visualisatie van neuronale soma en ideale geheel-cel patchen acute ruggenmerg segmenten gebruiken om de uitstekende kwaliteit van segmenten zodat gezond en analoge neuronen kunnen worden verkregen. Echter, voorbereiding van ruggenmerg segmenten omvat verschillende stappen, zoals het uitvoeren van een ventrale laminectomie en het verwijderen van de pia-arachnoideavilli membraan, dat obstakels bij het verkrijgen van gezonde segmenten kan worden. Hoewel het is niet makkelijk te bereiden segmenten van het ruggenmerg, heeft optreden opnames in vitro op segmenten van het ruggenmerg verschillende voordelen. Vergeleken met cel cultuur preparaten, kunnen ruggenmerg segmenten gedeeltelijk behouden die inherent zijn aan synaptic verbindingen die in staat zijn een fysiologisch relevante. Bovendien kan geheel-cel patch-clamp opname via ruggenmerg segmenten worden gecombineerd met andere technieken, zoals dubbele patch klem13,14, morfologische studies15,16 en eencellige RT-PCR 17. dus, deze techniek biedt meer informatie over het karakteriseren van de anatomische en genetische diversiteit binnen een bepaald geografisch gebied en zorgt voor onderzoek van de samenstelling van lokale circuits.
Hier, voorzien wij een basisnetwerkdiagram en een gedetailleerd beschrijving van onze methode voor de voorbereiding van acute ruggenmerg segmenten en het verwerven van geheel-cel patch-clamp opnames van SG neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen beschreven werden goedgekeurd door de Animal ethiek Commissie van Nanchang Universiteit (Nanchang, PR China, ethische No.2017-010). Alle inspanningen werden geleverd om te minimaliseren van de stress en pijn de proefdieren. Het elektrofysiologische opnames hier uitgevoerd werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT, 22-25 ° C).
1. dieren
- Gebruik Sprague-Dawley ratten (3-5 weken oud) van beide geslachten. Huis van de dieren onder een 12u licht-donker cyclus en hen ad libitum toegang geven tot voldoende voedsel en water.
2. bereiding van de oplossingen en materialen
- Oplossingen
- Bereiden van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) (in mM): 117 NaCl, 3.6 KCl, 1.2 NaH2PO4·2H2O, 2.5 CaCl2·2H2O, 1.2 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 11 D-glucose, 0.4 ascorbinezuur en 2 natrium pyruvaat. Zie tabel 1.
- Bereiden van sacharose-ACSF (in mM): 240 sacharose, 2.5 KCl, 1,25 NaH2PO4·2H2O, 0.5 CaCl2·2H2O, 3,5 MgCl2·6H2O, 25 NaHCO3, 0.4 ascorbinezuur en 2 natrium pyruvaat. Zie tabel 2.
- Bereiden van K+-gebaseerde intracellulaire oplossing (in mM): 130 K-gluconaat, 5 KCl, 10 Na2-phosphocreatine, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP en 0.3 Li-GTP. Zie tabel 3.
- Bereiden van Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing (in mM): 92 CsMeSO4, 43 CsCl, 10 Na2-phosphocreatine, 5 tetraethylammonium (thee) - Cl, 0.5 EGTA 10 HEPES, 4 Mg - ATP en 0.3 Li-GTP. Zie tabel 4.
Opmerking: Alle oplossingen moeten worden voorbereid met gedestilleerd water. ACSF en sacharose-ACSF moet carbogenated (95% O2 en 5% CO2 mengsel) voorafgaand aan het gebruik om een optimale pH van ongeveer 7.4, en de osmolaliteit van deze twee oplossingen moet worden aangepast aan de 300-310 mOsm. Omdat ascorbinezuur calcium kanalen beïnvloeden kon, moet deze agent worden weggelaten als men zou willen opnemen calcium stromingen. De osmolaliteit pH van intracellulaire oplossingen moeten worden gemeten en afgestemd op 290-300 mOsm en 7.2-7.3, respectievelijk. Het is aanbevolen om de intracellulaire oplossingen filteren met filters van 0,2 µm en opslaan van de oplossingen als 1 mL aliquots bij-20 ° C. CS+ en thee worden toegepast in Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing naar blok kalium kanaal, dat bevorderlijk is voor het gebruik van de versterker te houden van het membraan potentiële is stabiel op 0 mV bij het opnemen van remmende postsynaptisch stromingen (IPSCs). - Bereid de oplossing van de neurobiotin 488 0,05%. Los 2 mg neurobiotin 488 in 4 ml K+-gebaseerde intracellulaire oplossing en de osmolaliteit tot 290-300 mOsm aanpassen met behulp van gedestilleerd water of sacharose, indien nodig.
Opmerking: 1 mM van sacharose verhoogt osmolariteit van 1 mOsm. - Voorbereiden op 3% agar als een blok ruggenmerg. Los 7,5 g agar in 250 mL van het gezuiverde water in een bekerglas van glas, en gebruik vervolgens een magnetron te verwarmen tot koken en duidelijk. Swirl van de oplossing en giet het mengsel in een 17,5 x 10.5 cm x 1,8 cm plastic doos voor stolling daarna. Houd de agar bij 4 ° C vóór gebruik.
- 4% paraformaldehyde (PFA) voorbereiden immunohistochemische verwerking. Mix 40 g PFA poeder aan ~ 800 mL verwarmd (ongeveer 60 ° C) 1 x PBS oplossing (130 mM NaCl, 7 mM nb2HPO4, 3 mM NaH2PO4). Breng langzaam de pH door toevoeging van 1 N NaOH druppels tot PFA poeder volledig is opgelost. Zodra de oplossing duidelijk geworden is, pas het totale volume aan 1 L met 1 x PBS. Passen de pH op 7,2 – 7.4 met 1 N HCl wanneer nodig, dan filteren de 4% PFA-oplossing en opslaan bij-20 ° C tot gebruik.
Opmerking: PFA is giftig, dus het is nodig om te dragen maskers, handschoenen, evenals veiligheidsbril. Uitvoeren van het proces ter voorbereiding van 4% PFA binnen een geventileerde kap. PFA poeder kan volledig worden ontbonden bij een pH van ongeveer 9-10.
-
Instrumenten
- Voor een typische elektrofysiologische systeem, gebruik een rechtop Microscoop uitgerust met infrarood differentiële interferentie contrast (IR-DIC) en de doelstelling van een hoge water-onderdompeling, een CCD/CMOS-camera, een patch-clamp-versterker, de houder van een micropipet en een micromanipulator waardoor fijnafstelling van het standpunt van de pipet. Een XY-stadium is ook nodig om het verplaatsen van de Microscoop.
- Koppel alle apparatuur op een vibratie isolatie tabel omgeven door een kooi van Faraday. Een video-monitor verbinden met de videocamera te observeren de neuronen en visualiseren van de micropipetten.
-
Micropipetten
- Zorg opnemen elektroden van borosilicaatglas haarvaten met behulp van een trekker van de micropipet. De typische Pipetteer weerstand varieert van 3-6 MΩ wanneer gevuld met intracellulaire oplossing.
-
Agar blok
- Bereiden een 1.2 x 1,5 cm x 2,0 cm agar blok. Trim het blok in de vormen die afgebeeld in Figuur 1 zoals vereist.
3. acute ruggenmerg segment voorbereiding
Opmerking: Dwarse of parasagittal segmenten van het ruggenmerg zijn bereid als eerder beschreven18,19,20.
- Voorafgaand aan de transcardial perfusie en ruggenmerg extractie, bereiden ~ 500 mL sacharose-ACSF geëquilibreerd met 95% O2 en 5% CO2 en de ijskoude oplossing afkoelen (0-4 ° C).
- Alle dissectie hulpmiddelen (bijvoorbeeld ontrafeling van schaar, iris schaar, getande pincet, fijne pincet, gebogen verlostang) afkoelen op het ijs. Het diagram van de voorbereiding van acute ruggenmerg segment is afgebeeld in Figuur 1.
- Transcardial perfusie
- Na een enkele injectie (intraperitoneaal, i.p.) van urethaan (1,5 g/kg), wacht 2-3 min, en beoordelen van de diepte van de verdoving van ratten door het testen van teen of staart snuifje reacties. Zodra een chirurgische vliegtuig van de verdoving wordt onderhouden, plaats de rat op crushed ijs in de liggende positie.
Opmerking: Voor de productie van diepgaande verdoving voldoende voor niet-perceptie van pijn tijdens Thoracotomie, volg uw lokale IACUC richtlijnen. - Maken van een incisie (3-4 cm) via de huid van de xiphoid process aan het sleutelbeen, en breng vervolgens een dwarse snede onder het niveau van de xiphoid process.
- Begrijpen en de xiphoid process te verhogen met een paar gebogen pincet om het middenrif volledig bloot te stellen. Maak een dwarse incisie via het middenrif, en vervolgens doorsnijden de ribbenkast tussen het borstbeen en de ribben bilateraal te openen van de borstholte. Gebruik de gebogen verlostang te begrijpen van de xiphoid process zodat de ribbenkast is vastgesteld, en het hart voldoende wordt blootgesteld.
- Houd het hart met een andere gebogen pincet voorzichtig, en voeg vervolgens een naald van 22 G door het linkerventrikel aan de basis van de aortaboog.
- Snijd de juiste atrium met een fijne schaar onmiddellijk en start vervolgens de perfusie van ijskoud, zuurstofrijk sacharose-ACSF via een systeem van de zwaartekracht.
Opmerking: Snelle en voldoende transcardial perfusie met ijskoude sacharose-ACSF kan vergemakkelijken de snelle afkoeling van het ruggenmerg, terwijl lage natrium- en calciumzout concentratie helpen kan verlichten excitatory toxiciteit en beschermen van neuronale functie. Bovendien zou wissen van rode bloedcellen gunstig zijn voor het verminderen van de achtergrondkleuring van biocytin bij het uitvoeren van een morfologische studie. De perfusie wordt beschouwd als voldoende en tevreden, zolang de vloeistof afsluiten van de juiste atrium duidelijk is en de kleur van de rat lever en poten lichtgeel is. De tip van de naald 22 G moet bot te voorkomen bezwijken van het hart en de aortaboog.
- Na een enkele injectie (intraperitoneaal, i.p.) van urethaan (1,5 g/kg), wacht 2-3 min, en beoordelen van de diepte van de verdoving van ratten door het testen van teen of staart snuifje reacties. Zodra een chirurgische vliegtuig van de verdoving wordt onderhouden, plaats de rat op crushed ijs in de liggende positie.
- Ruggenmerg dissectie en snijden
- Maak een longitudinale insnijding (5 cm) op de rug huid van caudal naar rostraal, dan snijden door de ribbenkast tussen de wervelkolom en ribben aan weerszijden in de Braziliaanse deelstaat perfusie.
- Maken een cut caudal eind van de wervelkolom, het gebruik van schaar te knippen weg omliggende weefsels en snel isoleren van de lumbosacrale segment van de wervelkolom.
- Het lumbosacraal segment overbrengen in een glazen schotel met ijskoude sacharose gebaseerde ACSF. Gebruiken met de ventrale zijde naar boven, fijne schaar te snijden door de Vertebrale stam bilateraal en bloot het ruggenmerg zorgvuldig. Isoleren van een 2-cm lange ruggenmerg met lumbosacrale uitbreiding (L1-S3) en het spinale gedeelte overbrengen in een andere glazen schotel gevuld met koude sacharose-ACSF.
- Verwijder de hersenvliezen en de pia-arachnoideavilli membraan onder een Microscoop ontleden. Knip alle ventrale en dorsale wortels weg zo snel mogelijk.
- Plaats het ruggenmerg op een eerder bijgesneden agar-blok. Transversale segmenten voor te bereiden, hechten de ventrale zijde van het ruggenmerg aan de agar en laten de dorsale zijde naar het blad. Ter voorbereiding van parasagittal segmenten, voegt u de ventrale zijde met lijm aan de agar in verticale richting zoals afgebeeld in Figuur 1. Vervolgens monteer het blok van de agar naar een platform voor een vibratome met secondelijm. Voorbereiden van 300 – 500 µm dwars of segmenten van de parasagittal met de snelheid van een voorschot van 0,025 mm/s en een frequentie van de trillingen van 80 Hz.
- Gebruik een pipet kunststof-bijgesneden overdracht van de segmenten op nylon gaas in een cupje van de opslag met continu zuurstofrijk ACSF bij 32 ° C gedurende ten minste 30 minuten voorafgaand aan de opname.
Nota: zorg om te voorkomen dat schade aan het ruggenmerg, met name de dorsale hoorn, bij het verwijderen van de hersenvliezen en spinale wortels. Het ruggenmerg moet dorsal-ventrally worden gesneden. Voor de beste resultaten, moeten de segmenten bereid zijn snel (binnen 15-20 min). De dikte van een spinale segment moet niet meer dan 600 µm om te voldoen aan de zichtbaarheid van de cel. Daarnaast kan de techniek hierboven beschreven worden gebruikt om het verkrijgen van horizontale spinale segmenten.
4. geheel-cel Patch-clamp opnames
- Gebruiken om het gedrag van de gehele-cel patch-clamp opnames van SG neuronen, K+-gebaseerde intracellulaire oplossing voor de meeste opname gevallen tijdens het toepassen van Cs+-gebaseerde oplossing alleen voor de opname van remmende postsynaptisch stromingen.
- Een segment van het ruggenmerg zachtjes naar de zaal van de opname en daarna onderhoudt met een U-vormige platina-draad verbonden met nylon draden stevig voor optimale segment stabiliteit. Gestaag perfuse van het segment met geborreld ACSF op RT via een systeem van de zwaartekracht en het tarief van de perfusie vastgesteldop 2-4 mL/min tot voldoende oxygenatie.
- Identificeren van de regio van SG (een doorschijnend band) met behulp van een lens met een lage resolutie Microscoop, een gezonde neuron kiezen met behulp van de hoge resolutie doelstelling als de doelcel en aanpassen naar het midden van het scherm video-monitor.
- Vul een micropipet met een passende omvang van K+-gebaseerd of Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing, zo nodig, de micropipet steek in de elektrode-houder, en ervoor te zorgen dat de intracellulaire oplossing is contact met de zilveren draad binnen de houder.
- Brengen van de micropipet in beeld en dompel het in de ACSF met behulp van een micromanipulator en past u vervolgens een lichte overdruk (~ 1 psi wanneer gemeten met een manometer) te dwingen de micropipet uit de buurt van alle vuil en puin.
- Verplaats de micropipet naar de gerichte neuron geleidelijk. Laat de overdruk zodra de pipet benadert het neuron en een heel klein kuiltje vormen op de neuronale membraan om te vormen van een gigaseal.
- Wijzigen van het bedrijf mogelijkheden om te-70 mV, die dicht bij de fysiologische membraanpotentiaal (RMP) van een cel rust. Vervolgens een voorbijgaande en zachte zuigkracht om de micropipet te scheuren van het membraan en maken van een juiste configuratie van het geheel-cel passen.
Opmerking: Na het overbrengen van het segment in de bedwelmingsruimte opname, zorg ervoor gestage perfusie voor minstens 5 min om duidelijk het puin op het oppervlak van het segment. Het is vermeldenswaard dat de mogelijkheid om het onderscheid maken tussen gezonde en ongezonde/dode neuronen van het allergrootste belang voor de goede afdichting en stabiele opname is. Een ongezonde/dode neuron oogt erg gezwollen of gekrompen, samen met een zichtbare grote kern, terwijl een gezonde neuron wordt gekenmerkt door een 3-dimensionale (3D) vorm met een licht en soepel membraan, en zijn kern onzichtbaar is. Om de configuratie van een geheel-cel, is het essentieel om te compenseren voor snelle of langzame precisiecapaciteit stapsgewijze wanneer dat nodig is. RT, is de vloeibare kruising potentiële berekend 15.1-15,2 mV en 4.3-4.4 mV in K+-gebaseerd en Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing, respectievelijk. In onze studies, werden de geprotocolleerde gegevens niet gecorrigeerd voor vloeibare kruising potentieel. - Opnames van intrinsieke membraan eigenschappen
- Passieve intrinsieke membraan eigenschappen opnemen: Record RMP onmiddellijk (binnen 20 s) na onderbreking in. Bepaal de neuronale input weerstand door het meten van de reactie van de spanning op een depolarizing huidige (10 pA, 500 ms) op RMP in current-clamp modus.
- Record afvuren eigenschappen: Test het afvuren patroon van elk neuron in current-clamp met een reeks van 1 s depolarizing huidige pulsen (25 – 150 pA met 25 pA increment) op RMP. Het meten van de drempel, amplitude en halve-breedte van een enkele actiepotentiaal off line.
- Subthreshold huidige opnemen: om te beoordelen van de somatische subthreshold stromingen, houden het membraan potentiële -50 mV in spanning-clamp modus. Vervolgens het toepassen van een reeks hyperpolarizing spanning pulsen van 1 s duur van -60 mV tot-120 mV, met een 10-mV-verlagende.
- Opnemen van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs): EPSCs van de Record met de K+-gebaseerde intracellulaire oplossing in spanning-clamp-modus op een bedrijf potentieel van-70 mV.
- Record IPSCs: Toepassing Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing voor het opnemen van IPSCs. Zodra de configuratie geheel-cel wordt gevestigd, houden het membraan potentiële-70 mV voor ~ 5 min en wijzig vervolgens het bedrijf potentiële op 0 mV geleidelijk. Wacht een paar minuten voor stabilisatie, en dan beginnen met het opnemen van de IPSC-gebeurtenissen.
Opmerking: Alleen neuronen met een RMP van minder dan-50 mV en tonen overschrijding moeten worden geselecteerd voor verdere studie. De serie weerstanden in onze studie zijn meestal 10-30 MΩ, en een opname moet worden uitgesloten zodra de serie weerstand met meer dan 20 verandert %. EPSCs kon worden bevestigd met de toepassing van een bad van 50 µM APV en 20 µM CNQX, terwijl IPSCs kon worden bevestigd met 10 µM bicuculline en 1 µM strychnine.
5. morfologische studie
- Gebruik voor morfologische experimenten, een K+-gebaseerde intracellulaire oplossing met 0,05% neurobiotin 488.
- Na het handhaven van een stabiele elektrofysiologische opnemen gedurende ten minste 20 minuten, Verwijder langzaam de micropipet in de opwaartse richting om de celmembraan te verzegelen en het ruggenmerg segment overbrengen in een container gevuld met 4% PFA. Bevestigen van de segmenten in 4% PFA RT voor 1 h en vervolgens bij 4° C's nachts.
- Spoel de plakjes in PBS, en hen vervolgens onderdompelen in 50% ethanol voor 30 min. Na de andere drie wast in PBS, monteren van de segmenten in hun oorspronkelijke dikte op dia's met een montage-medium.
- Gebruik een confocal microscoop (Zie Tabel of Materials) voor Beeldacquisitie en neuronale 3D reconstructie. Scan neuronen door een 20 X lens met een z-stapel 1,5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Acute ruggenmerg segmenten opgesteld volgens het schema in Figuur 1afgebeeld. Na snijden en herstel, werd een segment van het ruggenmerg overgeplaatst naar de kamer van de opname. Gezonde neuronen werden geïdentificeerd op basis van soma uiterlijk met behulp van IR-DIC microscopie. Vervolgens werden de mogelijkheden van de actie van SG neuronen ontlokte door een reeks van depolarizing huidige pulsen (1 s duur) wanneer neuronen RMP werden gehouden. Zoals aangegeven in Figuur 2, de vuren patronen waargenomen in SG neuronen opgenomen tonic-vuren, vertraagd-vuren, gap-vuren, initiële-burst, phasic-barsten, single-spike en terughoudend-vuren, die zijn beschreven en gecategoriseerd door eerdere studies.
Uitvoering van deze voorbereiding, we ook subthreshold stromingen en spontaan opkomende stromingen opgenomen in spanning klem. Representatieve sporen van subthreshold stromingen, met inbegrip van hyperpolarisatie-geactiveerde stroom (ikh), T-type calcium huidige (IT) en A-type kalium huidige(Ia),zijn gegeven in figuur 3A. Deze stromingen werden verkregen door het ingedrukt houden van de cellen bij -50 mV en geleidelijk aan-120 intensivering in 10-mV verlaagt van -60 mV. Ikh werd geactiveerd door hyperpolarizing spanning stappen. Echter waren ikT en IA geactiveerd door hyperpolarizing prepulses uit inactivatie volgde met een depolarized spanning. Figuur 3B 3 C Toon vertegenwoordiger spontane EPSCs (sEPSCs) en IPSCs (sIPSCs) opgenomen van SG de neuronen, respectievelijk. De amplitude en frequentie van deze synaptic gebeurtenissen kunnen worden geanalyseerd met behulp van de mini analysesoftware off line.
Karakteriseren neuronale morfologische kenmerken, werden parasagittal plakjes toegepast, omdat de meeste van de SG neuronen aanzienlijk rostrocaudal verspreiding van dendritische bomen hebben en neurobiotin 488 aan intracellulaire oplossingen toevoegde. De grootte van de neuronale soma en de omvang en de dimensies van hun dendritische processen werden geëvalueerd na confocale microscopie imaging. Zoals eerder gemeld, SG neuronen Toon morfologische verschillen en kunnen worden onderverdeeld in Centraal cellen, radiale cellen, verticale cellen, eilandjecellen en niet-geclassificeerde cellen. Representatieve microfoto van deze cellen worden weergegeven in Figuur 4.
Figuur 1: Diagram voor acute ruggenmerg segment voorbereiding. Ratten zijn na diep wordt verdoofd met urethan (i.p.), transcardially geperfundeerd met ijskoude carbogenated sacharose-ACSF. De wervelkolom is dan snel ontleed, en wordt een ventrale laminectomie uitgevoerd. De hersenvliezen, pia-arachnoideavilli membraan en bijgevoegde spinal zenuwwortels worden verwijderd. Vervolgens is het ruggenmerg model gemonteerd op een agarose blok. Gekanteld of parasagittal plakjes worden gesneden met een vibratome zo nodig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: afvuren patronen van SG neuronen. Afvuren patronen worden bepaald door het injecteren van een reeks van 1 s depolarizing huidige pulsen in een neuron SG op RMP. De bakken patronen kunnen worden ingedeeld als tonic-vuren, vertraagd-vuren kloof-vuren, initiële-burst, phasic-barsten, single-spike en terughoudend-vuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Voltage-clamp opnamen in SG neuronen. (A) representatieve sporen weergegeven: het antwoord op de huidige injectie geclassificeerd als ik hyperpolarizingh, IA en IT. Het onderste paneel toont het dat protocol voor sub drempel stromingen in spanning-klem. (B) vertegenwoordiger sporen van sEPSCs opgenomen van SG neuronen op-70 mV in de afwezigheid en aanwezigheid van 50 μM APV en 20 μM CNQX. Lagere opeenvolgende sporen, die zijn opgenomen in een uitgebreide tijdschaal voor (links) en onder (rechts) het optreden van APV en CNQX, correspondeert met een periode die is aangegeven met een balk hieronder de opname van de grafiek weergegeven. (C) vertegenwoordiger sporen van sIPSCs opgenomen van SG neuronen in de afwezigheid en aanwezigheid van 10 μM bicuculline en 1 μM strychnine bij 0 mV. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: vertegenwoordiger morfologie van rat SG neuronen. Volgens soma maten en dendriet eigenschappen weergegeven in confocale microscopie beelden, kunnen SG neuronen worden ingedeeld als de centrale cel (A), radiaal cel (B), verticale cel (C), eilandje cel (D) en niet-geclassificeerde cel (E ). V: de ventrale; D: dorsal; A: rostraal; C: caudal. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Moleculair gewicht | Concentratie (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1.98 |
| Ascorbinezuur | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Natrium pyruvaat | 110 | 2 | 0.22 |
Tabel 1: Recept voor ACSF.
| Component | Moleculair gewicht | Concentratie (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | 117 | 6.84 |
| KCl | 74,5 | 3.6 | 0.27 |
| NaH2PO4·2H2O | 156 | 1.2 | 0.19 |
| CaCl2·2H2O | 147 | 2.5 | 0.37 |
| MgCl2·6H2O | 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glucose | 180 | 11 | 1.98 |
| Ascorbinezuur | 198.11 | 0.4 | 0.08 |
| Natrium pyruvaat | 110 | 2 | 0.22 |
Tabel 2: Recept voor sacharose-ACSF.
| Component | Moleculair gewicht | Concentratie (mM) | mg/100 mL |
| K-gluconaat | 234,2 | 130 | 3044.6 |
| KCl | 74,5 | 5 | 37.28 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabel 3: Recept voor K+-gebaseerde intracellulaire oplossing.
| Component | Moleculair gewicht | Concentratie (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097.6 |
| CsCl | 168.36 | 43 | 723.95 |
| Na2-Phosphocreatine | 453.38 | 10 | 453.38 |
| THEE-Cl | 165.71 | 5 | 82.86 |
| EGTA | 380.35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238.31 | 10 | 238.3 |
| Mg-ATP | 507.18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523.18 | 0.3 | 15,7 |
Tabel 4: Recept voor Cs+-gebaseerde intracellulaire oplossing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze gegevens van het protocol van de stappen voor het voorbereiden van ruggenmerg segmenten, die we met succes gebruikt hebben bij het uitvoeren van geheel-cel patch-clamp experimenten op SG neuronen18,19,20,21. Door de uitvoering van deze methode, die we onlangs gemeld dat minocycline, een tweede generatie van tetracycline, kunnen sterk remmende synaptische transmissie versterken via een presynaptische mechanisme in SG neuronen19. Daarnaast kan deze agent verlagen de amplitude van Ih en verder remmen de prikkelbaarheid van SG neuronen21. Ter ondersteuning van deze gegevens en de representatieve resultaten dat we hier laten zien, de momenteel beschreven methode is geschikt voor gebruik in een brede waaier van elektrofysiologische studies gepubliceerd.
Zoals we eerder opgemerkt, is transcardial perfusie een cruciaal element voor het verkrijgen van gezonde exemplaren. Ten eerste, we gebruiken ijskoude oplossing voor perfusie zodat het ruggenmerg kan snel worden afgekoeld en de neuronale stofwisseling vertraagd22kan worden. Tweede, sacharose-gesubstitueerde ACSF, een 'beschermende snijden' oplossing met lage nb+ concentratie, kan verbetering van de passieve+ Na-instroom en dus afnemen neuronale oedeem door water binnenkomst23. Ten derde is het gunstig ophalen en analyseren van neuronale morfologie, omdat perfusie de achtergrond veroorzaakt door biocytin22 minimaliseren kan. Voor de succesvolle voorbereiding is het ook belangrijk te gebruiken sommige antioxidanten om de oxidatieve schade, waarmee neuronale behoud24. Vandaar, in ons protocol, we aanvullen ascorbinezuur en natrium pyruvaat, die zijn krachtige antioxidanten en effectief, in zowel ACSF als sacharose-ACSF oedeem in segmenten van het ruggenmerg kan verzachten. Ook in onze ervaring, kunnen we verkrijgen gezonde ruggenmerg segmenten met succes van neonatale evenals 3 – 10 weken oude SD ratten. Dus voor dit protocol om succesvol te zijn, raden we SD ratten die minder dan 10 oud weken.
Terwijl het uitvoeren van 'ventrale' laminectomie en het verwijderen van de hersenvliezen en spinale zenuwen, moet geduldig en voorzichtig om te voorkomen dat snijden, uitrekken of splitsing van het ruggenmerg. In sommige studies, segmenten van het ruggenmerg met bijgevoegde dorsale wortels zijn gebruikt om te evalueren van de synaptische transmissie SG neuronen ontvangen ook25,26. De procedure voor het verwijderen van pia-arachnoideavilli membraan is van technische moeilijkheden in dit geval, en het vereist veel geduld.
Dit segment bereiden techniek ook kent een aantal beperkingen. Een duidelijk nadeel is dat hoewel acute segmenten overvloedige synaptic verbindingen behouden, kon het niet de werkelijke situatie weerspiegelen en pakken wat er precies gebeurt in vivo. Dus, hebben sommige studies uitgevoerd in vivo opnames die normaal uitgevoerd 'blinde'27,28,29. Echter deze aanpak in vivo is technisch uitdagend, en het is moeilijk te zeggen of een opname wordt uitgevoerd vanuit het soma of dendriet zonder voldoende ervaring. Een andere beperking van onze huidige werkwijze is dat sucrose-ACSF volstaat wellicht niet voor neuronale behoud bij de voorbereiding van de segmenten van de veroudering van knaagdieren. Een bijgewerkte aanpak met behulp van N-methyl-D-glucamine als invaller nb+ heeft voorgesteld, en deze geoptimaliseerde methodologie kan verbetering van morfologische en functionele behoud van neuronen in acute segmenten30,31 3332, ,. Ten slotte, SG neuronen tonen verschillende morfologische en elektrofysiologische eigenschappen3. Het lijkt moeilijk om het interpreteren van de gegevens die zijn verkregen uit geheel-cel opnamen terwijl u uitkijkt over de heterogeniteit. Deze beperking kan worden omzeild door verdere verificatie van de morfologische details van neuronen5 opgenomen of het gebruik van transgene muizen, die onderzoekers kunnen helpen identificeren specifieke neuronen20,34. Optogenetics, een nieuwe tool waarmee een subpopulatie van cellen35, kunnen bovendien worden gecombineerd met geheel-cel patch-clamp opname te bestuderen van de rol van specifieke ionenkanalen of eiwitten en te onderzoeken bepaalde neuronale circuit.
Over het algemeen is deze voorbereiding techniek een ideale manier om te onderzoeken het elektrofysiologische, morfologische, farmacologische en biologische kenmerken van SG neuronen, aangevuld met patch-clamp opname, immunefluorescentie kleuring, specifieke agonisten of antagonisten en de eencellige RT-PCR-techniek. Bovendien, deze aanpak kan worden toegepast samen met gekoppelde patch-clamp opnamen of optogenetics, en het is dus een waardevol instrument voor het verlichten van de neuronale micro schakelingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81560198, 31660289).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma | S7653 | Used for the preparation of ACSF and PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF, and K+-based intracellular solution |
| NaH2PO4·2H2O | Sigma | 71500 | Used for the preparation of ACSF, sucrose-ACSF and PBS |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| MgCl2·6H2O | Sigma | M2670 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Used for the preparation of ACSF |
| Ascorbic acid | Sigma | P5280 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sodium pyruvate | Sigma | A7631 | Used for the preparation of ACSF and sucrose-ACSF |
| Sucrose | Sigma | S7903 | Used for the preparation of sucrose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Used for the preparation of K+-based intracellular solution |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P1937 | Used for the preparation of intracellular solution |
| EGTA | Sigma | E3889 | Used for the preparation of intracellular solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Used for the preparation of intracellular solution |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Used for the preparation of intracellular solution |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| CsCl | Sigma | C3011 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Used for the preparation of Cs+-based intracellular solution |
| Neurobiotin 488 | Vector | SP-1145 | 0.05% neurobiotin 488 could be used for morphological studies |
| Agar | Sigma | A7002 | 3% agar block was used in our protocol |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | 4% paraformaldehyde was used for immunohistochemical processing |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Reagents | Used for the preparation of PBS | |
| Mount Coverslipping Medium | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1.5 g/kg, i.p. |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1.5 mm OD, 1.12 mm ID |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | Used for the preparation of micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Infrared CCD camera | Dage-MIT | IR-1000 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| X-Y stage | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| PH meter | Mettler Toledo | FE20 | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM 700 |
References
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents. Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).
- Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn. The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).
- Grudt, T. J., Perl, E. R. Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn. The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).
- Lu, Y., et al. A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia. Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).
- Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents. The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).
- Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).
- Zhang, L., et al. Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord. Molecular Brain. 7, 25 (2014).
- Kopach, O., et al. Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn. Pain. 152 (4), 912-923 (2011).
- Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain. Pain. 151 (1), 87-96 (2010).
- Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice. European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).
- Alles, S. R., et al. Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits. Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).
- Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat. The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).
- Lu, Y., Perl, E. R. Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II). The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).
- Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression. The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).
- Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach. Pain. 151 (2), 475-488 (2010).
- Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice. Brain Research. 1368, 91-101 (2011).
- Hu, T., et al. Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons. Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).
- Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn. Neuroscience. 319, 183-193 (2016).
- Peng, S. C., et al. Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons. Neuroscience. 358, 146-157 (2017).
- Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons. Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).
- Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Rice, M. E. Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices. Methods. 18 (2), 144-149 (1999).
- Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn. European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).
- Tian, L., et al. Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine. Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).
- Funai, Y., et al. Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms. Pain. 155 (3), 617-628 (2014).
- Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis. PLoS One. 10 (5), e0125147 (2015).
- Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording. The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825 (2018).
- Li, J., Baccei, M. L. Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).
- Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons. Pain. , (2018).
- Cui, L., et al. Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).
- Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors. Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).
