Summary
icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间经历核细胞质转移。这个事件的分子机制尚不清楚。本文介绍了共聚焦显微镜作为量化1型单纯疱疹病毒感染 icp0 运动的工具, 为定量分析 icp0 在未来的机械研究中的移位奠定了基础。
Abstract
单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 的感染细胞蛋白 0 (icp0) 是一种直接的早期蛋白, 含有 rg-3 泛素连接酶。它负责宿主限制性因子的蛋白酶体降解和随后的病毒基因激活。icp0 包含一个规范的核本地化序列 (nls)。它在新合成后立即进入原子核, 并主要在原子核中执行其抗主机防御功能。然而, 在感染后期, icp0 仅在细胞质中发现, 这表明在1型单纯疱疹病毒感染期间发生了核细胞质间的移位。据推测, icp0 的移位使 icp0 能够根据其在不同感染阶段的亚细胞位置调节其功能。为了描述 icp0 核细胞质迁移的生物学功能和调控机制, 我们改进了免疫荧光显微镜法, 以监测 icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间的贩运情况。该协议包括免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像和核与细胞质分布分析。该协议的目标是将在时间过程中拍摄的稳态共聚焦图像调整为整个裂解感染过程中 icp0 运动的定量文档。我们提出, 该方法可以推广到定量分析核与细胞质定位的其他病毒或细胞蛋白, 而不涉及实时成像技术。
Introduction
单纯疱疹病毒 1 (hsv-1) 可引起多种轻度至重度疱疹疾病, 包括唇部疱疹、生殖器疱疹、间质角膜炎和脑炎。一旦感染, 该病毒建立在神经节神经元的终身潜伏性感染。有时, 病毒可以通过各种原因重新激活, 如发烧、压力和免疫抑制1, 导致复发性疱疹感染。感染细胞蛋白 0 (icp0) 是对裂解和潜伏性1型单纯疱疹病毒感染至关重要的关键病毒调节剂。它通过抵消宿主固有的抗病毒防御 2,3,使下游病毒基因转化.icp0 具有 e3 泛素连接酶活性, 针对几个细胞因子进行蛋白酶依赖性降解3。它还与各种细胞通路相互作用, 以调节其活动, 并随后抵消宿主抗病毒限制3。据悉, icp0 位于不同的亚细胞隔间, 因为感染进行 3,4,5。该蛋白质具有富含赖氨酸的核定位信号 (nls), 位于500至 506-6 残留物处。在早期 hsv-1 感染的早期重新合成后, icp0 立即被输入细胞核。它首先被探测到在一个称为核域 10 (nd10)7的动态核结构。icp0 的 e3 泛素连接酶活性触发 nd10 组织者蛋白、早幼粒细胞白血病 (pml) 蛋白和斑点蛋白 100 kda (sp100)8、9、10的降解。在源蛋白丢失后, nd10 核体被分散, icp0 被分散填充整个核 4,11。
有趣的是, 病毒 dna 复制开始后, icp0 从细胞核中消失。它仅存在于细胞质中, 表明在 hsv-1 感染后期发生了核-细胞质转移的4,12。dna 复制的要求意味着一种晚期病毒蛋白可能参与促进1型 hsv-1 icp04,12的细胞质移位。显然, icp0 在感染期间在不同隔间之间的贩运使 icp0 能够以时空的方式调节其与各种细胞通路的相互作用, 从而协调其多重功能, 以微调裂解和潜伏性1型 hsv-1感染13。为了更好地理解 icp0 的多功能和 icp0 功能域在整个裂解感染过程中的协调, 我们仔细地剖析了动态 icp0 移位12的分子基础。为了进行先前报道的12个机械研究, 我们应用免疫荧光染色方法, 在共聚焦显微镜下观察 icp0 亚细胞在不同感染状态下的定位。我们还开发了一个定量协议, 利用共聚焦软件分析 icp0 的核与细胞质分布。在不同的生化处理12下, 对感染 hsv-1 型 hsv 病毒的细胞在整个感染阶段进行了列表,并分析了 icp0 运动的趋势。在这里, 我们描述了记录 icp0 在1型单纯疱疹病毒感染中的易位的详细协议。我们建议将这种方法作为研究其他病毒或细胞蛋白的核与细胞质移位的一般方法, 当活体成像技术不适用时, 可以作为活体成像的替代方法:标记方法、信号强度或蛋白质丰度等问题。
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Protocol
1. 细胞播种和病毒感染
- 在病毒感染前 20-24小时, 种子 5 x 10 4 人类胚胎肺成纤维细胞或其他细胞将在生长介质中的4井11毫米交错滑块上进行检查 (dulbecco 的改性鹰介质 (dmem) 补充10% 的胎儿牛血清 (fbs))。用5% 的二氧化碳 (co2) 在37°c 下培养细胞。
注: 每口井在感染时应该有70-80% 的细胞融合。 - 第二天, 去除生长培养基, 并在 4-10 pfu 细胞的范围内用中199中的病毒感染细胞。在37°c 下培养感染病毒的细胞1小时。在潜伏期继续晃动滑梯。
- 1小时孵育后, 去除中 199, 补充生长培养基。
注: 干扰不同感染阶段的药物可以在此步骤或病毒吸收之前添加。 - 在37°c 下用 5% co2 对感染病毒的细胞进行不同长度的感染期的培养。
2. 固定和渗透
- 在适当的感染时间, 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 快速清洗感染细胞 3次, 并添加200μl 的4% 对苯二甲醛在 pbs 中新鲜制备。在室温下将细胞用甲醛培养 8-10分钟, 以固定每口井中的细胞。
- 吸入甲醛, 用200μl 的 pbs 清洗井3次。第三次清洗后完全吸气 pbs。
- 在每口井中加入 100μl 0.2% 非离子表面活性剂, 使细胞渗透5–10分钟。
- 吸收非离子表面活性剂, 并用200μl 的 pbs 清洗井3次。
3. 免疫荧光染色
- 完全吸气 pbs, 并在每口井中添加200μl 的阻滞剂 (1% 的牛血清白蛋白 (bsa) 和5% 的马血清在 pbs 中), 并在室温下孵育1小时或4°c 过夜。
- 在阻断缓冲液中加入实验测定的原代抗体 (兔抗 icp0 多克隆抗体12) 浓度, 并在室温2小时或4°c 过夜时培养原代抗体。
- 用阻塞性缓冲液清洗 3次, 孵育10分钟。加入亚历克莎594共轭山羊抗兔二级抗体 (1:400 在阻塞缓冲液中稀释), 并在室温下孵育幻灯片1小时。然后用阻塞缓冲液在10分钟间隔内清洗幻灯片3次。
- 最后用 pbs 清洗滑块一次, 去除残留的 bsa 和马血清。
- 加入一滴防褪色安装介质, 加入 4 ', 6-二胺-2-苯丁胺 (dapi), 安装幻灯片, 并用透明指甲油用盖板密封。
4. 共聚焦成像
- 使用共聚焦显微镜, 将亚历克莎590的波长设置为590-650 纳米, dapi 的波长设置为410–520纳米。选择 1024 x 1024 的图像格式和8的线平均, 以获得高分辨率图像。
- 在共聚焦显微镜下对4井滑块上的每口井进行分析。获取100x 目标下的代表性单元格图像, 如图 1和图 2所示。
- 对于计数大量的单元格, 拍摄40x 目标下的连续字段的图像。
注: 它需要5-10 张图像, 从每次感染的每个时间点积累超过200个感染细胞。 - 在每个实验中, 为所有样品拍摄具有恒定共聚焦参数的照片, 需要进行比较。
5. 核与细胞质分布分析
- 使用共聚焦应用软件打开项目。选择一个需要为 icp0 的核与细胞质分布的细胞制成表格的图像。
- 单击顶部菜单中的 "数量" 选项卡, 然后从工具菜单中选择 "排序 roi"。
- 通过从顶部菜单中选择 "绘制线", 在要分析的单元格上绘制一条纵线。
注: 直方图将显示 icp0 和 dapi 的沿直线的荧光强度。在直方图中, 蓝线表示 dapi 像素并标记原子核的边界, 而红线表示 icp0 像素。 -
在背景染色的基础上, 建立了 icp0 强度的恒定阈值, 以分析每个实验中 icp0 亚细胞分布。
- 如图 2所示, 如果平均红色信号低于核区域的阈值, 但高于蓝色边界以外的阈值, 则将红色信号归类为主要位于细胞质中。
- 如果红色信号在整个原子核的阈值以上, 并超越蓝色信号的边界, 将红色信号分组为细胞核加细胞质定位。
- 如果红色信号在原子核的阈值以上, 但平均低于蓝色信号的边界, 将红色信号分组为核定位。
- 在不同的感染时间对每个样本中的200多个感染细胞进行制表, 并在条形图中绘制图表, 以说明 icp0 根据时间的移动情况 (图 3)。
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Representative Results
为了了解1型单纯疱疹病毒感染期间 icp0 贩运的分子基础和生物学功能, 我们采用免疫荧光显微镜法分析 icp0 在不同感染阶段的亚细胞分布。图 1显示了随着感染的进展而具有独特 icp0 定位的代表性细胞。为了量化 icp0 的核细胞质转移, 我们通过将受感染细胞分为三类来分析 icp0 相对于细胞核的分布: 核定位、细胞质定位和核加细胞质定位 (图 2)。为了了解 icp0 在感染过程中贩运所需的要素, 我们跟踪 icp0 在不同感染阶段的野生类型或突变体 hsv-1 的运动情况。图 3显示了 icp0 在不同感染时间点的亚细胞分布的列表结果示例。
图 1: 1 型单纯疱疹病毒感染期间 icp0 的动态贩运.在4井滑块上生长的 hel 细胞在 10 pfu 细胞处被原型 hsv-1 (f 菌株) 感染。在感染后1、5和 9小时 (hpi) 时, 细胞被固定、渗透, 并对兔抗 icp0 和小鼠抗 pml 原代抗体产生反应, 然后对亚历克莎594共轭抗兔和亚历克莎488同配抗小鼠二级抗体反应。在100x 目标下进行成像。近尾血细胞白血病 (pml) 蛋白作为 nd10 核体的标记蛋白, 由于感染中的 pml 降解, nd10 核体在5和 9 hpi 时消失。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: icp0 亚细胞分布分析.左面板: 使用共聚焦显微镜, 将代表性细胞放大, 以显示在细胞上绘制的纵向线, 该线定义了感兴趣的区域 (roi)。右面板: 对单个细胞中的 icp0 和 dapi 进行了 roi 荧光像素强度的量化, 并通过共聚焦应用软件将其表示为直方图。设置了任意阈值 (绿线) 以反映背景染色。刻度栏 = 10μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 野生类型和 c 端截断 icp0 的亚细胞分布百分比.hel 细胞在 4 pf塞尔细胞处被含有野生型 icp0 (icp0 wt) 或 c-终端截断 icp0 (icp0 c 截断) 的重组病毒感染。在指定的时间点, 细胞被染色和分析如上所述。为 icp0 位置列出了200多个单元格。用电子表格计算软件绘制了含有核、细胞质或核 + 细胞质 icp0 的细胞的百分比。这是一个典型的实验, 表明使用这种方法, 我们已经确定 icp0 c-终端作为一个领域所需的 icp0 核细胞质易位。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该协议已被用于研究1型 hsv-1 icp0 的核细胞质迁移。icp0 在1型单纯疱疹病毒感染期间遭到亚细胞贩运 (图 1)。很可能, icp0 与各种细胞通路相互作用, 在不同的位置执行不同的功能。这使得 icp0 能够在与人类主机13的拔河比赛中微调其多重功能。然而, icp0 如何以时空的方式协调多个函数还没有得到很好的研究。利用上述荧光显微镜协议, 我们开始分析 icp0 核细胞质转移的分子基础。到目前为止, 我们已经确定 icp0 c-端35氨基酸是这种易位的重要元素。在没有 c-终点的情况下, icp0 在整个感染过程中被限制在细胞核内 (图 3)。我们还发现, icp0 e3 配体依赖性核力量延迟了 u2os 细胞12的核细胞质转移.此外, 我们还发现 icp0 c-末端和晚期病毒蛋白的表达相互合作, 以克服核保留, 促进细胞质移位12。目前, 我们正在使用该协议来筛选参与 icp0 核细胞质转移的晚期病毒蛋白。
该议定书最初是为了研究1型单纯疱疹病毒感染中 icp0 的动态贩运问题而制定的。如图 1所示, 在1型单纯疱疹病毒感染的早期, icp0 与 nd10 同相化, 其中细胞限制性因子和 nd10 成分 (如 pml 和 sp1008)的几个关键成分被降解。在降解 nd10 关键成分后, icp0 扩散到整个细胞核和感染后期, icp0 被转移到细胞质。由于 icp0 在感染后进行了新的合成, 最初的蛋白质丰度很低, 然后一个强大的病毒合成很快就会掩盖任何单个分子的运动, 这使得使用单个分子进行跟踪变得很困难。实时成像技术。因此, 我们故意选择不使用实时成像。相反, 我们采用上述协议研究了 icp0 在不同感染点的稳态定位, 这对跟踪1型单纯疱疹病毒感染者群体 icp0 时间运动有很好的帮助。
对于共聚焦分析中的高信噪比, 在本协议的湿板凳部分, 有两个关键步骤值得注意。首先, 4 井交错幻灯片允许在一张幻灯片上处理多个样本。它极大地节省了宝贵的试剂, 如病毒和抗体的使用。但是, 由于每个井中保持的体积很小, 在缓冲区更改过程中未完全清除的剩余缓冲区可能会干扰后续试剂。因此, 在每个缓冲区开关中, 在添加新缓冲区之前, 需要进行彻底的抽吸。其次, 根据我们的经验, 细胞交联的程度和膜的渗透率对于荧光信号的清晰度非常重要。我们为甲醛和非离子表面活性剂的处理设置了10分钟的经验数。我们发现, 时间更长或短于10分钟可以降低信噪比。如图 1和图 2所示, 以及以前的研究 12, 在我们的实验中获得的图像是水晶般清晰的。清晰地勾勒出核边界的突出蓝色信号是确定 icp0 亚细胞分布的关键。在该协议的计算部分, 一个关键的步骤是设置一个恒定的阈值来消除背景。高信噪比的成功染色是降低阈值线和更好的信号对比度的关键。但是, 在同一实验中保持所有样本的恒定阈值是 icp0 定量文档的基础 (图 2和图 3)。
该协议还可以作为一个通用的工具, 研究亚细胞贩运的其他病毒或细胞蛋白时, 一个合适的实时成像方法是缺乏。在活体成像技术中, 细胞保持在最佳的生理环境中, 以维持细胞代谢状态14,15。活细胞成像的一个基本要求是荧光标记目标蛋白, 这可以通过将目标蛋白与荧光标记16融合来实现, 或者提供特定于目标蛋白17的荧光共轭分子.在这两种情况下, 如果荧光标记的融合改变目标蛋白特性或荧光共轭分子难以穿过细胞膜, 问题可能会增加。在这一过程中造成细胞损伤的光漂白是活体成像中另一个值得关注的问题。因此, 克服活体成像局限性的新策略仍然是技术发展的前沿。我们这里描述的协议提供了稳态共聚焦图像的时间分析, 当没有合适的实时成像方法时, 该协议可以作为替代工具。该方法简单可靠。它提供了在最小背景下的蛋白质亚细胞定位的清晰检测。利用共聚焦软件, 我们能够定量分析在细胞群中目标蛋白分布不同的细胞的百分比, 并记录目标蛋白在不同细胞阶段的运动。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢国家卫生研究院授予海东谷的赠款 (ro1ai111892) 的财政支持。我们感谢韦恩州立大学的显微镜、成像和细胞仪 (micr) 核心设施提供的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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