Summary
ICP0 sofre translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. O mecanismo molecular deste evento não é conhecido. Aqui nós descrevemos o uso do microscópio confocal como uma ferramenta para quantificar o movimento de ICP0 na infecção pelo HSV-1, que estabelece as bases para a análise de quantitativamente ICP0 translocação em futuros estudos mecanicistas.
Abstract
Célula infectada proteína 0 (ICP0) de herpes simplex vírus 1 (HSV-1) é uma proteína de início imediata contendo um anel tipo E3 ubiquitina ligase. É responsável pela degradação proteasomal de fatores restritivos do hospedeiro e a ativação do gene viral subsequentes. ICP0 contém uma sequência canônica de localização nuclear (NLS). Ele entra no núcleo imediatamente após a síntese de novo e executa suas funções de defesa do antiprincipalmente hospedeiro no núcleo. No entanto, mais tarde em infecção, ICP0 é encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática durante a infecção HSV-1. Presumivelmente ICP0 translocação permite ICP0 modular as suas funções de acordo com sua localização subcellular em fases diferentes de infecção. A fim de delinear a função biológica e mecanismo regulatório de translocação nuclear e citoplasmático ICP0, nós modificamos um método de microscopia de imunofluorescência para monitorar o tráfico de ICP0 durante a infecção HSV-1. Este protocolo envolve a coloração imunofluorescente, microscópio confocal de imagem e nuclear vs citoplasmática análise da distribuição. O objetivo do presente protocolo é adaptar as imagens confocal de estado estacionário, tomadas em um curso de tempo em uma documentação quantitativa do movimento ICP0 em toda a infecção lítica. Propomos que este método pode ser generalizado para analisar quantitativamente nuclear vs localização citoplasmática de outras proteínas virais ou celulares sem envolvendo tecnologia de imagem ao vivo.
Introduction
Herpes simplex vírus 1 (HSV-1) faz com que uma ampla gama de leves a graves doenças herpéticas incluindo herpes labial, herpes genital, ceratite estromal e encefalite. Uma vez infectado, o vírus estabelece uma infecção latente ao longo da vida nos neurônios do gânglio. Ocasionalmente, o vírus pode ser reativado por várias razões, tais como febre, estresse e imunossupressão1, levando a infecção de herpes recorrente. Célula infectada proteína 0 (ICP0) é um regulador de viral chave crucial para a infecção de HSV-1 lítica e latente. -Preferencialmente a jusante vírus genes através de contrariar o anfitrião intrínseco/inata defesas antivirais2,3. ICP0 tem uma atividade de ligase E3 ubiquitina, que tem como alvo a diversos fatores de célula para degradação de proteossomo dependente3. Também interage com várias vias de célula para regular as suas actividades e, posteriormente, para compensar o anfitrião restrições antiviral3. ICP0 é conhecido para localizar em diferentes compartimentos subcellular enquanto a infecção prossegue3,4,5. A proteína tem um sinal de localização nuclear de lisina e arginina-rich (NLS), situado em resíduos 500 para 5066. A síntese de novo no início infecção HSV-1, ICP0 imediatamente é importado para o núcleo. Primeiro é detectado em uma dinâmica nuclear estrutura denominado domínio nuclear 10 (ND10)7. A atividade E3 ubiquitina ligase ICP0 provoca a degradação de proteínas de organizador ND10, promielocítica leucemia (PML) proteína e proteína salpicados 100 kDa (Sp100)8,9,10. Após a perda de proteínas do organizador, ND10 corpos nucleares estão dispersos e ICP0 é difundida para preencher o núcleo inteiro4,11.
Curiosamente, após o início da replicação do DNA viral, ICP0 desaparece a partir do núcleo. Pode ser encontrada exclusivamente no citoplasma, sugerindo a ocorrência de uma translocação nuclear-para-citoplasmática no final de4,de infecção HSV-112. A exigência da replicação de DNA implica o envolvimento potencial de um tarde antisentido viral em facilitar a translocação citoplasmática de HSV-1 ICP04,12. Aparentemente ICP0 tráfico entre diferentes compartimentos durante infecção capacita ICP0 modular suas interações para vários caminhos celulares de forma espaço-temporal, e, portanto, coordenar suas funções múltiplas à multa ajustar o equilíbrio entre o lítico e latente HSV-1 infecção13. Para entender melhor a multifuncionalidade do ICP0 e a coordenação de ICP0 domínios funcionais durante a infecção lítica, dissequei cuidadosamente a base molecular da dinâmica translocação ICP012. Para realizar os estudos mecanicistas anteriormente relatados12, nós aplicamos um método de coloração imunofluorescente para visualizar a Localização subcellular ICP0 no status de infecção diferentes sob microscópio confocal. Também desenvolvemos um protocolo quantitativo para analisar a nuclear vs citoplasmática distribuição de ICP0 usando o software confocal. A população de células infectadas HSV-1 foi tabulada ao longo das fases de infecção e as tendências do movimento de ICP0 foram analisadas, sob diferentes tratamentos bioquímicos12. Aqui descrevemos o protocolo detalhado a translocação de documentos ICP0 em infecção HSV-1. Propomos que este método pode ser adotado como um método geral para estudar a nuclear vs translocação citoplasmática para outras proteínas virais ou celulares, que pode servir como uma alternativa para imagens ao vivo quando a técnica de imagem ao vivo não é aplicável devido a problemas tais como rotulagem método, intensidade de sinal ou abundância de proteína.
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Protocol
1. célula propagação e infecção pelo vírus
- A 20 – 24 h antes da infecção pelo vírus, semente de 5 x 104 de células de fibroblastos de pulmão embrionário humano (HEL) ou outras células a ser examinado em um slide escalonada de 11 mm 4-bem no meio de crescimento (de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de bovino fetal soro (FBS)). Incube as células a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2).
Nota: Cada um bem deve ter confluência de célula de 70-80% no momento da infecção. - No dia seguinte, retire o meio de crescimento e infectar as células com vírus em médio-199 a uma distância de 4-10 pfu/célula. Incubar as células infectadas por vírus durante 1 h a 37 ° C. Abanando o slide durante o período de incubação.
- Após a incubação de 1 h, remover médio-199 e completar com meio de cultura.
Nota: Medicamentos que interferem com fases diferentes de infecção podem ser adicionados a esta etapa ou antes da absorção viral. - Incube as células infectadas por vírus, a 37 ° C com 5% de CO2 para vários comprimentos do período de infecção.
2. fixação e permeabilização
- Hora de infecção adequada, rapidamente lavar as células infectadas com tampão fosfato salino (PBS) 3 vezes e adicionar 200 μL de paraformaldeído 4% preparado na PBS. Incube as celulas com paraformaldeído para 8 – 10 min à temperatura ambiente para consertar as células em cada poço.
- Paraformaldeído, Aspire e lavar os poços com 200 µ l de PBS por 3 vezes. PBS, Aspire completamente após a lavagem 3rd .
- Adicione 100 μL de 0,2% de tensoativo não-iônico para cada poço para permeabilize as células por 5-10 min.
- Aspirar o tensoativo não-iônico e lavar os poços com 200 µ l de PBS por 3 vezes.
3. imunofluorescência coloração
- Completamente, Aspire PBS e adicionar 200 μL de tampão de bloqueio (1% albumina de soro bovino (BSA) e 5% de soro de cavalo em PBS) em cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 1 h, ou a 4 ° C durante a noite.
- Adicionar determinada experimentalmente a concentração do anticorpo primário (coelho anti-ICP0 anticorpo policlonal12) em tampão de bloqueio e incubar o anticorpo primário em temperatura ambiente por 2 h ou a 4 ° C durante a noite.
- Lavar com tampão de bloqueio 3 vezes com incubação de 10 min. Adicione o anticorpo secundário de Alexa 594-conjugados de cabra anticoelho (1: 400, diluído em tampão de bloqueio) e a incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Em seguida, lave as lâminas 3 vezes com tampão de bloqueio no intervalo de 10 min.
- Finalmente, lave o slide uma vez com PBS para remover BSA residual e soro de cavalo.
- Adicione uma gota de meio de montagem antidesgaste com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para montar o slide e selá-lo com lamela usando esmalte transparente.
4. confocal Imaging
- Com um microscópio confocal, defina o comprimento de onda em 590 – 650 nm para Alexa 594 e 410 – 520 nm para DAPI. Selecione o formato de imagem em 1024 x 1024 e linha média de 8 para adquirir imagens de alta resolução.
- Analise cada poço no slide 4-bem sob microscópio confocal. Adquira imagens de células representativas no âmbito do objectivo de X 100, como mostrado na Figura 1 e Figura 2.
- Para contar com grande número de células, com imagens dos campos consecutivos no âmbito do objectivo de X 40.
Nota: Requer 5 – 10 imagens para acumular mais de 200 células infectadas de cada ponto de tempo de cada infecção. - Em cada experimento, tire fotos com parâmetros confocal constantes para todas as amostras precisa ser comparado.
5. analisando Nuclear vs distribuição citoplasmática
- Abrir o projeto com o software aplicativo confocal. Selecione uma imagem da qual células precisam ser tabulados para nuclear vs distribuição citoplasmática de ICP0.
- Clique na guia "Quantidade" no menu superior e selecione "ROIs de classificar" no menu ferramentas.
- Desenhe uma linha longitudinal em toda a célula a ser analisado, selecionando "Limite" no menu superior.
Nota: Histograma aparecerá mostrando a intensidade de fluorescência ao longo da linha para ICP0 e DAPI. No histograma, a linha azul representa DAPI pixels e marca a fronteira do núcleo, Considerando que a linha vermelha representa ICP0 pixels. -
Com base na coloração de fundo, configure um limite constante de intensidade ICP0 analisar a distribuição subcellular de ICP0 em cada experimento.
- Como exemplificado na Figura 2, se o vermelho do sinal em média é inferior ao limiar da região nuclear mas é acima do limiar além do limite da azul, categorizar o sinal vermelho como predominantemente localizados no citoplasma.
- Se o sinal vermelho estiver acima do limite em todo o núcleo e os limites do sinal azul, grupo o sinal vermelho como núcleo mais localização citoplasmática.
- Se o sinal vermelho estiver acima do limite no núcleo, mas em média é abaixo dele fora do limite do sinal azul, do grupo o sinal vermelho como localização nuclear.
- Tabulate mais de 200 células infectadas de cada amostra em tempo de infecção diferentes e trama em gráfico de barras para ilustrar o movimento de ICP0 de acordo com o tempo (Figura 3).
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Representative Results
Para entender a base molecular e funções biológicas de ICP0 tráfico durante a infecção HSV-1, usamos um método de microscopia de imunofluorescência para analisar ICP0 distribuição subcellular em fases diferentes de infecção. A Figura 1 mostra as células representativas com distintiva localização ICP0 no decorrer da infecção. Para quantificar a translocação nuclear e citoplasmática de ICP0, analisamos a distribuição de ICP0 em relação ao núcleo categorizando células infectadas em três grupos: localização nuclear e citoplasmática localização localização citoplasmática e nuclear ( A Figura 2). Para compreender os elementos necessários para ICP0 tráfico durante a infecção, podemos rastrear movimentos de ICP0 no tipo selvagem ou mutante HSV-1 em fases diferentes de infecção. A Figura 3 mostra um exemplo dos resultados de tabulação para distribuição subcellular de ICP0 no ponto de tempo diferente da infecção.
Figura 1: dinâmica tráfico de ICP0 durante a infecção HSV-1. Células de HEL cultivadas em laminas 4-poços foram infectadas com protótipo HSV-1 (estirpe F) em 10 pfu/célula. Em 1, 5 e 9 h pós infecção (hpi), as células foram fixo, permeabilizadas, reagiu de coelho anti-ICP0 e mouse anti-PML anticorpos primários e então reagiu a Alexa 594-conjugado anticoelho e anticorpos secundários de Alexa 488-cojugated anti-rato para imagem abaixo dos 100 objetivos X. Proteína de (PML) de leucemia promielocítica serve como uma proteína de marcador para ND10 corpos nucleares, que desaparece em 5 e 9 hpi devido à degradação do PML na infecção. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise da distribuição subcellular ICP0. Painel esquerdo: com um microscópio confocal, células representativas foram ampliadas para mostrar a linha longitudinal que do outro lado da célula que define a região de interesse (ROI). Painel direito: intensidades de fluorescência pixel em ROI foram quantificadas para ICP0 e DAPI em células individuais e ilustradas como histogramas pelo software aplicativo confocal. Um limite arbitrário (linha verde) foi ajustado para refletir a coloração de fundo. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: percentagem de distribuição subcellular para selvagem-tipo e C-terminal truncado ICP0. HEL células foram infectadas pelo vírus recombinantes contendo o selvagem-tipo ICP0 (ICP0 WT) ou C-terminal truncado ICP0 (ICP0 C-truncamento) em 4 pfu/célula. Nos pontos de tempo indicado, células foram coradas e analisadas conforme descrito acima. Mais de 200 células foram tabuladas para ICP0 local. Porcentagem de células que contém o núcleo, citoplasma ou nuclear + citoplasmático ICP0 foram plotados com um software de cálculo de folha de cálculo. Esta é uma experiência exemplar para mostrar que usando este método, nós identificamos ICP0 C-terminal, um domínio necessário para ICP0 de translocação nuclear e citoplasmática. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo tem sido costumava estudar a translocação nuclear e citoplasmática de HSV-1 ICP0. ICP0 sofre tráfico subcellular durante a infecção HSV-1 (Figura 1). Provavelmente, ICP0 interage com várias vias de célula para realizar diferentes funções em diferentes locais. Isso permite que o ICP0 afinar suas múltiplas funções no cabo de guerra com hospedeiro humano13. No entanto, como ICP0 coordenadas as múltiplas funções de forma espaço-temporal não foi bem estudada. Com o microscopia fluorescente protocolo descrito acima, nós começamos a analisar a base molecular da translocação nuclear e citoplasmática de ICP0. A partir de agora, nós identificamos o ICP0 C-terminal 35 aminoácidos como um elemento necessário e importante para esta translocação. Na ausência do C-terminal, ICP0 é contido dentro do núcleo durante a infecção (Figura 3). Também descobrimos que uma translocação de atrasos a nuclear-para-citoplasmática ICP0 E3 ligase-dependente de retenção nuclear força em células de U2OS12. Além disso, descobrimos que a ICP0 C-terminal e a expressão das proteínas virais tarde cooperarem para superar a retenção nuclear e facilitar a translocação citoplasmática12. Atualmente, estamos usando esse protocolo para tela para as proteínas virais tarde envolvidas na translocação nuclear e citoplasmático ICP0.
O protocolo foi desenvolvido inicialmente para estudar a dinâmica tráfico de ICP0 infecção HSV-1. Como mostrado na Figura 1, no início de infecção HSV-1, ICP0 é colocalized com ND10, onde vários componentes chaves do celulares fatores restritivos e ND10 como PML e Sp1008, são degradados. Após degradante ND10 constituintes chaves, ICP0 difunde-se por todo o núcleo e no final, infecção, ICP0 é translocada para o citoplasma. Porque ICP0 submete-se a síntese de novo ao ser infectado, a abundância de proteína inicial é muito baixa e então uma síntese viral robusta rapidamente irá obscurecer o movimento de todas as moléculas individuais, o que torna difícil rastrear usando uma única molécula tecnologia de imagem ao vivo. Portanto, estamos deliberadamente escolheu não usar imagens ao vivo. Em vez disso, nós adotamos o protocolo acima para estudar a localização de estado estacionário ICP0 em pontos diferentes de infecção, que nos serviu bem no rastreamento ICP0 movimento temporal em uma população de células infectadas HSV-1.
Para uma relação elevada do sinal-de-fundo na análise confocal, dois passos críticos são dignos de nota na parte molhada-banco do presente protocolo. Primeiro, os slides de 4-bem escalonados permitam múltiplas amostras para serem manipulados em um único slide. Ele salva muito o uso dos reagentes preciosos como vírus e anticorpos. No entanto, porque o volume em cada poço é tão pequeno, reserva residual não completamente limpa durante as mudanças de buffer pode interferir com o reagente subsequente. Portanto, em cada switch de reserva, uma aspiração completa é necessária antes de adicionar o novo buffer. Em segundo lugar, com base em nossas experiências, o grau de permeabilidade de reticulação e a membrana celular é importante para a clareza dos sinais de fluorescência. Definimos um número empírico de 10 min para paraformaldeído e tratamentos de surfactante não iônico. Encontramos esse tempo muito mais longo ou mais curto do que 10 min pode diminuir a proporção de sinal-para-fundo. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2, bem como no estudo anterior12, imagens obtidas em nossas experiências são cristalinas. O sinal azul proeminente que delineia claramente o limite nuclear é a chave para determinar a distribuição subcellular da ICP0. Na parte computacional do presente protocolo, um passo crucial é definir um limite constante para eliminar o fundo. Uma coloração bem sucedido com alta relação sinal-para-plano de fundo é a chave para uma linha de limite inferior e o melhor sinal de contraste. Manter um constante limiar para todas as amostras no mesmo experimento, no entanto, é a base para a documentação quantitativa de ICP0 (Figura 2 e Figura 3).
O protocolo também pode servir como uma ferramenta geral para estudar subcellular tráfico para outras proteínas virais ou celulares quando está faltando um método adequado de imagem ao vivo. Na técnica de imagem ao vivo, as células são mantidas em ambiente fisiológico ideal para manter a célula estado metabólico14,15. Um requisito básico para a imagem latente de célula viva é fluorescente rotular a proteína do alvo, que pode ser conseguida pela fusão da proteína do alvo com uma etiqueta fluorescente16, ou entregar um fluoróforo conjugado específico da molécula da proteína alvo17 . Em ambos os casos, problemas podem levantar-se da fusão de etiqueta fluorescente altera a propriedade de proteína do alvo ou fluoróforo conjugado molécula tem dificuldade para atravessar a membrana celular. Fotobranqueamento que causa danos nas células no processo é uma preocupação adicional em imagem ao vivo18. Portanto, novas estratégias para superar a limitação de imagem ao vivo continuam a ser a fronteira do desenvolvimento tecnológico. O protocolo que descrevemos aqui fornece análise temporal das imagens confocal estado estacionário, que pode servir como uma ferramenta alternativa quando um método adequado de imagem ao vivo não está disponível. O método é fácil e confiável. Ele fornece a deteção clara da localização Subcellular da proteína com fundo mínimo. Usando o software confocal, somos capazes de quantitativamente analisar a percentagem de células com distribuições diferentes da proteína alvo em uma população de células e o movimento da proteína alvo de documentos em fases diferentes da célula.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro de uma subvenção de NIH (RO1AI118992), atribuído a Haidong Gu. Agradecemos a instalação de microscopia, imagem & Core Cytometry recursos (MICR) Universidade Estadual de Wayne para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells and viruses | |||
| Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells) | Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University) | HEL cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS | |
| HSV-1 viral Stock (Strain F) | Dr. Bernard Roizman Lab | ||
| Medium | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-500ml | |
| Medium-199 (10x) | Gibco | 11825-015 | |
| Reagents | |||
| 4- well 11 mm staggered slide | Cel-Line/Thermofisher Scientific | 30-149H-BLACK | |
| 16% Paraformaldehyde solution(w/v) Methanol free | Thermo Scientific | 28908 | |
| Triton X-100 | Fisher reagents | BP151-1C0 | |
| Bovine Serum Abumin (BSA) | Calbiochem | CAS 9048-46-8 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| NaCl | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| KH2PO4 | Fisher Bioreagent | BP362-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Na2HPO4 | Fisher Bioreagent | BP332-500 | |
| Blocking buffer (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum ) | Dr. Haidong Gu lab | ||
| Rabiit Anti-ICP0 antibody | Dr. Haidong Gu lab | ||
| PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG | santa Cruz Biotechnology | SC-966 | |
| Alexa Fluor 594-goat anti-rabbit IgG | invitrogen | A11012 | |
| Alexa Fluor 488-goat anti-mouse IgG | invitrogen | A11001 | |
| Vectashield Mouting medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Pasteur pipette | Fisher Brand | 13-678-20D | |
| Nail Polish | Sally Hansen | ||
| Equipment | |||
| Confocal Microscope | Leica SP8 | ||
| Confocal Software | Leica LAS X Application suite | ||
| Excel software | Microsoft Excel | ||
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Scientific | Order code 51026282 |
References
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