Methodenartikel

Zebrafish Embryos Modell für bei Vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierte Staphylococcus Aureus Infektion

DOI:

10.3791/58523

⸱

7. Januar 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI) ist eine der Hauptursachen für das Scheitern der Biomaterialien/medizinische Geräte. Staphylococcus Aureus ist einer der wichtigsten Erreger in BAI. Aktuelle Tiermodelle experimentelle BAI Säugetier-wie Maus-Modellen sind kostspielig und zeitaufwendig und daher nicht geeignet für Hochdurchsatz-Analyse. Somit sind neuartige Tiermodellen als ergänzende Systeme für die Untersuchung von BAI in-vivo erwünscht. In der vorliegenden Studie, wir wollten ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse der bakteriellen Infektion in Anwesenheit von Biomaterialien, die anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie zu entwickeln. Darüber hinaus wurde die Antwort provoziert Makrophagen untersucht. Zu diesem Zweck wir fluoreszierende Protein exprimierenden S. Aureus und transgenen Zebrafisch-Embryonen auszudrücken fluoreszierende Proteine in ihre Makrophagen verwendet und entwickelt ein Verfahren um Bakterien alleine oder zusammen mit Mikrosphären in den Muskel injizieren Gewebe von Embryonen. Um bakterielle Infektion Fortschreiten in live Embryonen im Laufe der Zeit zu überwachen, entwickelten wir eine einfache, aber zuverlässige Methode der mikroskopischen Punktwertung von fluoreszierenden Bakterien. Die Ergebnisse von mikroskopischen scoring hat gezeigt, dass alle Embryonen mit mehr als 20 Koloniebildenden Einheiten (KBE) von Bakterien eine positive Fluoreszenzsignal von Bakterien ergab. Um die potenziellen Auswirkungen der Biomaterialien auf Infektion zu untersuchen, haben wir die KBE Zahlen von S. Aureus mit und ohne 10 µm-Mikrokügelchen aus Polystyrol (PS10) als Modell Biomaterialien in den Embryonen festgestellt. Darüber hinaus haben wir ObjectJ-Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest" im ImageJ um der Fluoreszenzintensität der S. Aureus -Infektion mit und ohne PS10 im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Beide Methoden die Ergebnisse zeigten höhere Zahlen von S. Aureus in infizierten Embryonen mit Mikrosphären als bei Embryonen ohne Mikrosphären, zeigt eine Infektion erhöhte Anfälligkeit im Beisein der Biomaterial. So zeigt die vorliegende Studie das Potenzial des Modells Zebrafish Embryos, BAI mit den hier entwickelten Methoden zu studieren.

Einleitung

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Eine Vielzahl von medizinischen Geräten (bezeichnet als "Biomaterialien") werden zunehmend in der modernen Medizin verwendet, um wiederherstellen oder ersetzen menschlichen Körper Teile1. Die Implantation von Biomaterialien prädisponiert jedoch ein Patient zu Infektion, genannt ein Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI), ist eine schwere Komplikation der Implantate in der Chirurgie. Staphylococcus Aureus und Staphylococcus Epidermidis sind zwei am weitesten verbreitete Bakterienarten verantwortlich für BAI2,,3,4,5,6. Implantiert Biomaterialien Form eine Oberfläche anfällig für bakterielle Biofilmbildung. Darüber hinaus können lokale Immunantwort durch die implantierten Biomaterialien, verursachen Effizienzverluste bakterielle Clearance gestört werden. Die anfängliche Clearance von Bakterien infizieren erfolgt hauptsächlich durch die Infiltration von Neutrophilen, die stark reduzierte bakterizide Kapazitäten im Beisein eines eingefügten oder Biomaterialien7implantiert. Außerdem töten Makrophagen das Gewebe infiltrieren, nachdem der erste Zustrom von Neutrophilen die verbleibenden Bakterien phagozytieren werden aber nicht effektiv intrazellulär, durch gestörte immunen signalisieren, die eine Folge der kombinierten Anwesenheit ist Das Biomaterial und Bakterien8. So, das Vorhandensein von Biomaterialien intrazelluläre Überleben der Bakterien9,10,11,12,13 und Biofilm Formation auf den implantierten ermöglichen Biomaterialien4,14. Infolgedessen kann BAI führen zum Ausfall und müssen für den Austausch von implantierten Biomaterialien verursacht erhöhte Morbidität und Mortalität und längeren Krankenhausaufenthalt mit zusätzlichen Kosten2,15.

Eine wachsende Zahl von Anti-BAI-Strategien werden entwickelt,2,16,17. In-vivo Bewertung der Wirksamkeit dieser Strategien in relevanten Tiermodellen ist unerlässlich. Traditionelle experimentelle BAI Tiermodellen (z. B., -Maus-Modellen) sind jedoch in der Regel teuer, zeitaufwendig und daher nicht geeignet für hohen Durchsatz testen mehrere Strategien18. Aktuelle Entwicklung der Bio-optische bildgebende Verfahren basierend auf Biolumineszenz/fluoreszierend Etikettierung von Wirtszellen und Bakterien können sich für die kontinuierliche Überwachung der BAI Progression und Wirt-Pathogen/Host-Material Interaktionen in einzelne kleine Tiere wie Mäuse18,19,20,21. Aber diese Technik ist relativ komplex und noch in den Kinderschuhen, und mehrere Fragen zur quantitativen Analyse von BAI18. Zum Beispiel ist eine hohe Herausforderung-Dosis erforderlich, um bakterielle Besiedlung zu visualisieren. Darüber hinaus Licht Streuung und Adsorption von Biolumineszenz/Fluoreszenz-Signale in Geweben von Säugetieren Test, die Tiere müssen auch sein angesprochen18,19,21. Daher sind neuartige, kostengünstige Tiermodellen zulassend intravitalen Visualisierung und Quantitative Analyse im Laufe der Zeit wertvolle ergänzende Systeme für das Studium BAI in-vivo.

Zebrafisch (Embryonen) dienten als ein vielseitiges in-vivo Werkzeug für sezieren Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese der Infektion mehrere Bakterienarten wie Mykobakterien22, Pseudomonas Aeruginosa23, Escherichia coli24, Enterococcus Faecalis25und Staphylokokken26,27. Zebrafisch-Embryonen haben viele Vorteile wie optische Transparenz, eine relativ niedrige Instandhaltungskosten und Besitz des immunen Systems sehr ähnlich dem in Säugetieren28,29. Zebrafisch-Embryonen wird dadurch eine hohe Wirtschaftlichkeit, lebendigen Modellorganismus für intravitalen Visualisierung und Analyse der Infektion Fortschreiten und damit verbundenen Host Antworten28,29. Visualisierung der Zelle Verhalten in vivo, transgenen Zebrafisch Linien mit verschiedenen Arten von Immunzellen (z.B., Makrophagen und Neutrophile) und sogar mit Gewebekulturen tagged subzellulären Strukturen wurden entwickelt28 ,29. Darüber hinaus bietet die hohe Reproduktionsrate der Zebrafisch die Möglichkeit der Entwicklung von Hochdurchsatz-Testsysteme mit automatisierten Roboter-Injektion, automatisierte Fluoreszenz Quantifizierung und RNA Sequenz Analyse27, 30.

In der vorliegenden Studie hatten wir vor, ein Zebrafish Embryos Modell für Biomaterial-assoziierten Infektionen mit Fluoreszenz bildgebende Verfahren entwickeln. Zu diesem Zweck haben wir ein Verfahren um Bakterien (S. Aureus) injizieren in Anwesenheit von Biomaterial Mikrosphären in das Muskelgewebe von Zebrafisch-Embryonen entwickelt. Wir verwendeten S. Aureus RN4220 mit dem Ausdruck ihrer mCherry fluoreszierendes Protein (S. Aureus- mCherry), die gebaut wurde, wie an anderer Stelle für ein anderes S. Aureus -Stamm10,31beschrieben. Die transgenen Zebrafisch-Linie (mpeg1: FH/Kaede) Kaede grünes fluoreszierendes Protein in der Makrophagen32 und blau fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen dienten zum Ausdruck zu bringen. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass intramuskuläre Injektion von Mikrosphären in Zebrafisch-Embryonen, Biomaterial Implantation zu imitieren machbar33. Um das Fortschreiten der BAI und damit verbundenen Zelle eindringen in einzelnen Embryonen im Laufe der Zeit quantitativ zu analysieren, haben wir die "Zebrafisch-Immunotest" Projektdatei, die in "ObjectJ" (ein Plug-in für ImageJ) betrieben wird, die Fluoreszenzintensität der Quantifizierung Bakterien, die ihren Wohnsitz und Makrophagen in der Nähe der Injektionsstelle der Mikrosphären33infiltrieren. Darüber hinaus bestimmen wir die Zahl der Koloniebildenden Einheiten (KBE) von Bakterien in an- und Abwesenheit von Mikrosphären in den Embryonen, mögliche Auswirkungen von Biomaterialien auf Infektion zu studieren. Unsere Studie zeigt, dass mit den hier entwickelten Methoden Zebrafish Embryos eine vielversprechende, Roman vertebrate Tiermodell für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

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Protokoll

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In diesem Protokoll ist Pflege von Erwachsenen Zebrafisch in Übereinstimmung mit den lokalen Tierschutzbestimmungen wie von der lokalen Tierschutz-Ausschuss genehmigt. Experimente mit Embryonen wurden nach der Richtlinie 2010/63/EG durchgeführt.

1. Vorbereitung des "Nur-Bakterien" und Bakterien-Mikrosphären Suspensionen

Hinweis: Der S. Aureus RN4220 Stamm mit dem Ausdruck mCherry fluoreszierendes Protein (S. Aureus- mCherry) wird verwendet. S. Aureus RN4220 Belastung in der Virulenz Regulator-gen AgrA (Zubehör gen Regler A)34mutiert und kann daher relativ geringer Virulenz im Zebrafish Embryos Modell haben. Andere S. Aureus -Stämme oder andere Bakterienarten für BAI können verwendet werden.

  1. Nehmen Sie 4 bis 5 Kolonien von S. Aureus RN4220 Bakterien aus tryptic Soja Kultur Agarplatten mit 10 µg/mL Chloramphenicol ergänzt und Kultur die Bakterien Mitte logarithmischen Wachstumsphase in 10 mL tryptic Soja Brühe ergänzt mit 10 µg/mL Chloramphenicol bei 37 ° C unter schütteln.
    1. Während Kultur, verdünnen 100 µL Bakteriensuspension in 900 µL steriler Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in eine Küvette (Breite 1 cm) für eine optische Dichte (OD) Messung bei 620 nm (OD620). Kultur der Bakterien bis OD620 0,4 – 0,8 erreicht.
      Hinweis: In der Regel entspricht ein OD-620 von 0,1 3,0 x 107 KBE/mL S. Aureus. Die OD-620 von einem Inokulum von Bakterien in Mitte logarithmischen Wachstumsphase ist zwischen 0,4-0,8. Unterschiedliche Zeiträume zur Kultivierung können für andere Arten und Stämme von Bakterien benötigt werden.
  2. Bakterien bei 3.500 X g für 10 min Zentrifugieren und erneut aussetzen der gebeizte Bakterien in 1 mL sterile PBS. Anschließend waschen Sie die Bakterien mit sterilen PBS 2 Mal, und schließlich wieder auszusetzen Sie, die Bakterien in 1,1 mL 4 % (w/V) Polyvinylpyrrolidon40 (PvP-40) Lösung mit PBS-Puffer.
  3. Vortex diese Bakteriensuspension und verdünnte 100 µL der Suspension in 900 µL steriler PBS in einer Küvette für die OD-620 -Messung. Passen Sie die Konzentration der Bakteriensuspension mit PvP-40 Lösung. Dies ist die "Nur-Bakterien" Federung.
  4. Biomaterialien können frei gewählt werden, um mit Bakteriensuspension mischen. In der vorliegenden Studie werden kommerzielle Polystyrol (PS) Mikrosphären (blau fluoreszierend, 10 µm) verwendet. Um eine Bakterien-Mikrosphären Aussetzung zu generieren, Zentrifugieren Sie die Mikrosphären für 1 min bei 1000 X g, Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und erneut unterbrechen Sie die Mikrosphären in der "Nur-Bakterien" Suspension (in PVP40 Lösung).
  5. Die Konzentration der Bakterien-Mikrosphären Aussetzung muss um etwa gleiche Dosen von Bakterien in der Gegenwart und in der Abwesenheit von Mikrosphären injizieren, werden zwei Drittel des Zusammenschlusses der "Nur-Bakterien" Suspension (ohne Mikrosphären). Dies wird erreicht durch die Bakterien-Mikrosphären Aussetzung mit 0,5 Volumen der PvP-40 Lösung verdünnen. Mischen Sie die Suspensionen durch vortexen. Beachten ist ist dieses Verhältnis für S. Aureus(zwei Drittel) bewertet worden. Es eignet sich auch für S. Epidermidis, aber es wird empfohlen, zu prüfen, ob dieses Verhältnis gilt auch für andere Bakterienarten und andere Größen (unter 10 µm) oder Formen von Biomaterialien (als Mikrosphären) injiziert werden.
  6. Die Konzentration der "Nur-Bakterien" und Bakterien-Mikrosphären Suspension durch quantitative Kultur 10-divisibel serielle Verdünnungen wie folgt überprüfen: Transfer 100 µL der Suspensionen auf eine 96-Well-Platte und seriell verdünnt durch die Übertragung von 10 µL-Aliquots von der Federung in 90 µL steriler PBS. Doppelte 10 µL Aliquots der unverdünnten und verdünnten Suspensionen auf Agarose Platten Teller, über Nacht die Platten bei 37 ° C inkubieren, zählen der Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien (Koloniebildenden Einheiten. CFU).

(2) Zucht, Ernte und Pflege von Zebrafish Embryos

  1. Folgen Sie der allgemeinen Verfahren beschrieben früheren35,36 für Zucht, Ernte und Wartung von Zebrafisch-Embryonen, mit nachfolgend beschriebenen Modifikationen. Eine Familie von Wildtyp Tupfel lange Flosse (TL) Zebrafisch oder Zebrafisch der ausgewählten transgene Linie zu überqueren (hier, Mpeg1: Kaede) in einem Tank mit einem Netz hinzugefügt induzieren die erwachsenen Weibchen, Eier zu produzieren, nachdem das Licht anmacht, dann Erwachsene von der produzierten Eier trennen.
  2. Sammeln Sie die Embryonen am nächsten Tag zu und entsorgen Sie die undurchsichtigen, die nicht lebensfähig sind. Halten Sie ca. 60 Embryonen pro Petrischale (100 mm Durchmesser) in E3 mittlere37 und inkubieren Sie bei 28 ° C. Tot und abnorme Embryonen zu entfernen, und das E3-Medium täglich aktualisieren.

3. Vorbereitung der Injektionsnadeln

  1. Bereiten Sie die Glas Microcapillary Nadeln zur Injektion mit einer Mikropipette Puller Instrument. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Hitze: 772, ziehen: 100, Vel: 200, Zeit: 40, Gas: 75.
  2. Brechen Sie die Nadelspitze mit der Pinzette an der Stelle wo die Nadel einen Außendurchmesser von ca. 20 µm (für 10 µm Mikrosphären) hat, mit einem Lichtmikroskop mit eine Maßstabsleiste in das Okular. Vermeiden Sie Nadeln mit einer sehr großen Öffnung Größe, wie sie überleben des Embryos gefährden werden.
    Hinweis: Die Öffnung kann gewählt werden, zu kleiner oder größer sein, je nach Größe und Form der Biomaterialien injiziert werden. In der Literatur berichteten Injektionen mit Nadeln mit einer Öffnung von ca. 50 µm, verursachen eine signifikante Abnahme der Embryo überleben38.

4. Injektion von "Bakterien-Only" oder Bakterien-Mikrosphären Aussetzung in Zebrafish Embryos

  1. Erhitzen Sie Agarose-Lösung (1 – 1,5 % (wt) in Demi-Wasser) mit einer Mikrowelle ausgestattet und in einer 100-mm-Petrischale gießen. Legen Sie eine Kunststoff-Formenbau-Vorlage auf die Agarose-Lösung in der Petrischale, Vertiefungen in der Agarose für die Platzierung der Embryonen in richtige Position erleichtern Injektionen zu schaffen. Bei Raumtemperatur inkubieren Sie und entfernen Sie den Schimmel, wenn die Agarose-Lösung erstarrt ist.
  2. Stellen Sie in 3-d nach Befruchtung die Embryonen in einer 100 mm Petrischale mit 0,02 % (w/V) 3-Aminobenzoic Säure (Tricaine), um sie zu betäuben. Nach 5 min transfer der Embryonen auf die Agarose-Platte mit E3 0,02 % (w/V) Tricaine-haltigem Medium überlagert und richten Sie sie in eine Orientierung für die Injektion. Für die Mpeg1: Kaede transgene Linie zuerst betäuben Embryonen in E3 mittlere mit 0,02 % (w/V) Tricaine. Wählen Sie dann die Embryonen grün fluoreszierende Proteine mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop zum Ausdruck zu bringen.
  3. Laden Sie die Nadel mit ca. 10 µL der "Bakterien-only" oder Bakterien-Mikrosphären Suspension mit einer Pipettenspitze Microloader. Montieren Sie die Nadel auf einem Mikromanipulator zum Mikro-Injektor verbunden. Für der Injektor hier (siehe Tabelle der Materialien), die folgenden Einstellungen für Injektionen von 2 – 3 nL verwendet: Druck: 300-350, Gegendruck: 0, Zeit: 2 ms.
    Hinweis: Die Einstellungen für die Mikro-Injektor hängen den Injektor verwendet. Injektor-Einstellungen müssen für Injektionen von Bakterien gemischt mit Biomaterialien mit anderen Formen oder Größen angepasst werden.
    1. Nadeln mit der gleichen Öffnung für die Injektion von "Nur-Bakterien" Federung und die Bakterien-Mikrosphären Aussetzung zu verwenden. Wenn die Nadel defekt oder verstopft ist, immer für eine neue Nadel für weitere Injektionen zu ändern.
  4. Stechen Sie die Nadel in das Muskelgewebe der Embryonen unter einem Lichtmikroskop (Abbildung 1), in einem Winkel von 45 – 60 ° c zwischen der Nadel und dem Körper des Embryos. Passen Sie die Position der Nadel im Gewebe durch sanft hin und her bewegt. Die Embryonen mit einem Fußpedal zum Mikro-Injektor verbunden zu injizieren.
  5. Zählen Sie nach Injektion von fluoreszierenden Bakterien die Embryonen für erfolgreiche Infektion unter dem Stereo-Fluoreszenzmikroskop. Entsorgen Sie die Embryonen erzielte negativ (keine sichtbaren fluoreszierenden Bakterien oder keine sichtbaren fluoreszierenden Mikrosphären). Embryonen einzeln in E3 Medium in 48-Well Platten zu erhalten. Aktualisieren Sie das Medium täglich.

(5) Zerkleinerung von Embryonen, mikroskopische Scoring und quantitativen Kultur von Bakterien

  1. Ergebnis aller Embryonen mikroskopisch auf das Vorhandensein von fluoreszierenden Bakterien mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop, ab sofort nach den Injektionen und an jedem folgenden Tag bis die Embryonen für quantitative Kultur nach dem Zufallsprinzip ausgewählt werden.
  2. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie ein paar live infizierten Embryonen (5 bis 6 in der vorliegenden Studie) kurz nach der Injektion und übertragen Sie sie einzeln auf separaten 2 mL Mikroröhrchen mit sterilen Tipps. Entfernen Sie das Medium, die Embryonen vorsichtig mit sterilen PBS einmal waschen und 100 µL steriler PBS hinzufügen.
  3. Jedes Fläschchen 2 – 3 sterile Zirkonia Perlen (2 mm Durchmesser) hinzu und zerquetschen die Embryonen mit der Homogenisator (siehe Tabelle der Materialien) bei 3.500 u/min für 30 s. Kultur das Homogenat quantitativ wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: Anderen Homogenisatoren können andere Einstellungen erforderlich.
  4. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mehrere Embryonen an den folgenden Tagen nach der Injektion für quantitative Kultur gemäß Schritt 5.3 aus.

(6) Fluoreszenzmikroskopie Infektion Fortschreiten und provoziert Cell Infiltration in den Zebrafish Embryos

  1. Betäuben Sie die Embryonen, wie unter Punkt 4.2 beschrieben. Pipette 500 µL einer PBS - 2 % (wt)-Methyl-Zellulose-Lösung in eine Petrischale mit E3 Medium mit 0,02 % (w/V) Tricaine. Legen Sie die Embryonen in die Methyl-Zellulose-Lösung und halten Sie sie gerade und horizontal.
    Hinweis: Methyl-Zellulose-Lösung wird als ein "Klebstoff", der aufgrund seiner Viskosität vorübergehend immobilisieren können Embryonen in beste Orientierung für die Bildgebung verwendet.
  2. Verwendung eines Stereo-Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit Hellfeld, mCherry, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und UV Filter Bild einzelnen Embryonen unter identischen optimierte Einstellungen (z.B., Intensität, Gewinn und Belichtung Zeit) bei 160 X Vergrößerung . Die Brennebene so eingestellt, dass die Gewebeschädigung durch die Injektion verursacht im Fokus, mit dem Hellfeld-Filter ist. Stellen Sie die Z-Stapel Tiefe bei 10 µm und Schritt Größe bei 5 µm, die Aufnahme von 3 aufeinander folgenden Bildern ermöglicht.
  3. Bild einzelnen Embryonen einmal täglich von 5 h nach der Injektion bis 2 Tage nach der Injektion. Schließen Sie Toten Embryonen (kein Herzschlag oder Embryo teilweise abgebaut) für weitere imaging und Analyse. Embryonen einzeln in E3 Medium in 48-Well Platten zu erhalten. Aktualisieren Sie das Medium täglich.

(7) Quantitative Analyse der Fluoreszenzintensität der Infektion Fortschreiten und provoziert Cell Infiltration mit Objekt J Projektdatei "Zebrafisch-Immunotest"

  1. Der Link "Zebrafisch-Immunotest" und das ausführliche Handbuch herunterladen: < Https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, wie in einer früheren Studie33beschrieben. In Kürze öffnen Sie Bilder für die Analyse mit "Zebrafisch-Immunotest", unter dem Freeware-Programm Bild J. Jede geladene Bild manuell markieren der Injektionsstelle anhand der beobachteten Gewebeschäden von Embryonen.
    Hinweis: Die markierte Seite dient "Zebrafisch-Immunotest" als den Mittelpunkt den Fluoreszenz-Gipfel innerhalb einer Entfernung von 50 µm zu erkennen. Die detektierten Fluoreszenz-Spitze dient dann als Zentrum eines standardisierten Bereichs (Durchmesser von 100 µm) für Fluoreszenzmessung.
  2. Klicken Sie auf "Berechnung" im Menü Objekt J um die Fluoreszenz Messung für mehrere Kanäle, ggf. automatisch für alle Bilder laufen. Exportieren Sie die Daten und analysieren Sie, indem Sie geeignete statistische Testmethoden.

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Ergebnisse

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Die vorliegende Studie untersucht die Anwendbarkeit der Zebrafisch-Embryonen als eine neuartige vertebrate Tiermodell für die Untersuchung von Biomaterial-assoziierten Infektionen. Mikroinjektion Technik ist häufig verwendet worden, um verschiedene Bakterienarten in Zebrafisch-Embryonen verursachen Infektion22,26,27,30,36zu inj...

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Diskussion

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Biomaterial-assoziierten Infektionen (BAI) ist eine schwerwiegende klinische Komplikation. Ein besseres Verständnis der Pathogenese der BAI in-vivo böte neue Erkenntnisse zur Verbesserung der Prävention und Behandlung von BAI. Jedoch aktuelle experimentelle BAI Tiermodellen wie murinen Modelle sind teuer, arbeitsintensiv und erfordern spezialisiertes Personal in komplexe chirurgische Techniken geschult. Daher eignen sich diese Modelle nicht für Hochdurchsatz-Analyse. Da Anforderungen Zebrafish Embryos Modelle weniger kom...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch das IBIZA-Projekt des Programms biomedizinischen Material (BMM) und mitfinanziert vom niederländischen Ministerium für Wirtschaft und Währung. Die Autoren möchten Prof. Dr. Graham Lieschke Monash University in Australien danken für die Bereitstellung der Zebrafisch transgenen Linie (Mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tryptische Soja-AgarBD Difco236950Medienaufbereitungsanlage bei AMC
Tryptische SojabrüheBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidon40ApplichemA2259.0250
10 µ Mikrosphären aus Polystyrol mit m Durchmesser (blau fluoreszierend)Life technology/ThemoFisherF8829
Mikrokapilärglas (1 mm AD x 0,78 mm ID)Harvard Apparatur30-0038
Mikropipetten-AbzieherInstrument Sutter Instrument IncFlaming p-97
Lichtmikroskop LM 20LeicaMDG33 10450123
3-Aminobenzoesäure (Tricain)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
Stereo-Fluoreszenzmikroskop LM80LeicaMDG3610450126
Microloader PipettenspitzenEppendorf5242956.003
Mikromanipulator M3301 mit M10 StativWorld Precision Instruments00-42-101-0000
FemtoJet express MikroinjektorEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 mL ppSarstedt72.693.005
Zirkonoxid-KügelchenBio-connect11079124ZX
MagNA LyserRoche41416401
MSA-2 Platten (Mannitol Salz Agar-2)Biomerieux43671Chapmon 2
Medium Methylcellulose 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
Gyrotory Shaker (für Bakterienwachstum)New Brunswick ScientificG10
Zebrafisch-InkubatorVWRIncu-line
KüvettenMARKE759015
ZentrifugeHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
SpektrometerPharmacia biotechUltrospec® 2000
PinzetteSigma-AldrichF6521-1EA
48 Well-PlattenGreiner bio-one677180
96 Well-PlattenGreiner bio-one655161
PetrischaleFalcon353003
PetrischaleBiomerieuxNL-132
ImageJNicht zutreffendNicht zutreffendLink: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrismNicht zutreffend

Referenzen

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