Methodenartikel

Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Explants als Voraussetzung für diagnostische Tests

DOI:

10.3791/58569

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29. November 2018

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1Institute for Molecular Medicine Finland (FIMM), HiLIFE, University of Helsinki

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen eine Methode zur Energieerzeugung, Anbau und systematische Analyse der organotypischen Scheiben aus murinen Lungentumoren abgeleitet. Wir beschreiben auch für Scheibendicke optimieren und das Medikament Konzentrationen zur Behandlung von Tumor-Scheiben auswählen.

Zusammenfassung

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Organotypischen primäre Explant Gewebekulturen, die darunter präzise geschliffenen Scheiben, repräsentieren die dreidimensionale (3D) Gewebearchitektur sowie die vielzelligen Interaktionen von nativen Gewebe. Gewebe-Scheiben schneiden sofort frisch resezierten Tumoren erhalten räumliche Aspekte des Intratumor Heterogenität, wodurch sie nützliche Surrogate in Vivo Biologie. Sorgfältige, Optimierung der Scheibe Vorbereitung und Anbau Gewebeverhältnisse ist wesentlich für die prädiktive Diagnostik Potential der Tumor explants Slice. In diesem Zusammenhang sind murine Modellen wertvoll, wie diese bieten einen konstanten Durchfluss von Tumormaterial zu replizieren und reproduzierbare Experimente durchführen. Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung der murine Lung Tumor gewonnenem Gewebe Scheiben mit einer rotierenden Inkubation-Einheit, ein System, das ermöglicht die intermittierende gegenüber der Gewebe mit Sauerstoff und Nährstoffen. Unsere bisherige Arbeit zeigte, dass die Verwendung von rotierenden Inkubation Einheiten die Lebensfähigkeit des Gewebes im Vergleich zu anderen Kultur verbessert, vor allem schwimmende Scheiben und stagnierenden Filter unterstützt. Hier zeigen wir weiter, dass Scheibendicke die Lebensfähigkeit beeinflusst des kultivierten Scheiben, was darauf hindeutet, dass Optimierung der Scheibendicke getan werden für verschiedenen Gewebetypen. Ausgesprochen ITH in relevanten onkogenen Funktionen wie Signalisierung Aktivitäten, stromale Zelle eindringen oder Ausdruck der Differenzierung Marker, erfordert Auswertung der angrenzenden Gewebe Scheiben für die Expression von Markern, die durch medikamentöse Behandlung verändert oder Anbau, selbst. Zusammenfassend lässt sich sagen dieses Protokoll beschreibt die Generation der murine Lung Tumor Scheiben und ihre Kultur auf eine Dreheinheit Inkubation und zeigt, wie Scheiben für den Ausdruck der heterogenen Gewebe Marker als Voraussetzung systematisch analysiert werden sollte vor der Antwort Medikamentenstudien.

Einleitung

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Solide Tumorgewebe, einschließlich Lungenkrebs, genetische und phänotypische Heterogenität aufweisen und beherbergen komplexe Mikroumgebungen1,2. Das Zusammenspiel zwischen Tumorzellen und deren umliegenden Mikroumgebung Einfluss auf Droge Sensibilität und Widerstand Mechanismen3. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der präklinischen Modellen, die biologischen Komplexität und Funktionen in native Tumoren handeln genau modelliert werden können. Präzise geschliffenen Scheiben sofort frische Tumoren abgeleitet bieten eine einzigartige Ressource, da sie eine wesentliche Fähigkeit, in Vivo Biologie, zumindest für ein kurzes Zeitfenster, einschließlich Phänotypen räumlich verteilt in einem einzelnen Tumor dar haben. Resezierten klinische Tumoren sind eines der wenigen personalisierte Exemplare, die aus einem Krebspatienten erzielt werden kann, und ihre diagnostische Anwendung verdient Aufmerksamkeit.

Die Geschichte des organotypischen Kulturen stammt aus demfrühen 19. Jahrhundert, als menschliche intrakranielle Tumoren handgeschliffene in Gewebe Stücke und kultivierten mit der so genannten waren hängen Drop-Methode. Gewebefragmente waren mit einem Deckgläschen verbunden und erlaubt in heparinisierten Humanplasma, Tauchen, nach dem die Deckgläsern invertiert, versiegelt und für mehrere Wochen4kultiviert wurden. Tumor Stücke sind seit kultiviert mit einer Vielzahl von anderen Methoden, wie z. B. auf Plasma Klumpen5in flüssigen Medien6, oder auf 0,45 µm Porengröße Größe Filter6manuell zu schneiden. Der Begriff "organotypischen" wurde erstmals im Jahr 1954, in einer Studie von retinalen Differenzierung der Küken Embryos Auge7verwendet. Es folgten Studien, die Lunge und Herz Gewebe Explantaten abgeleitet von Küken Embryonen8und Gehirn Explantaten von erwachsenen Ratten9verwendet.

Verschiedenen Slice Methoden wurden beschrieben, nämlich manuelle Chopper10,11, Krumdieck Gewebe Hobel12,13und Vibratomes11,14,15, 16. Das Krumdieck Gewebe Hobel erzeugt zylindrische Gewebe Kerne, die dann in kreisförmigen Gewebe Scheiben mit einem Mikrotom geschnitten sind. Ein Vibratome nutzt auf der anderen Seite eine vibrierende Klinge Mikrotom. In einer Studie über Leber Scheiben zeigte sich, dass die Leica Vibratome mehr reproduzierbaren und konsequente Scheiben im Vergleich mit dem Krumdieck Slicer15erzeugt. Slice-dicken von 250 bis 500 µm verwendet wurden, und Studien berichten Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit und morphologische Merkmale sogar bis zu 16 Tage14,10,17,18. Allerdings Tumoren haben Variable Stoffwechselprofile, die Nährstoffansprüche beeinflussen können, und Parameter wie Gewebe Steifigkeit und Matrix-Zusammensetzung können Einfluss auf Belüftung und Nährstoffe fließen. Es ist daher wahrscheinlich, dass jeder Gewebetyp Optimierung der schneiden und Kultur erfordert.

Verschiedenen Anbaumethoden wurden verwendet, um die Scheibe Kulturen unterstützen: ich) stationäre Interphase Kultur, auch genannt stagnierenden Unterstützung Kultur, in denen Scheiben sich am Anfang einer halbdurchlässigen Membran einfügen in das Kulturmedium getaucht befinden. Dabei ist oben auf die Scheiben der Luft ausgesetzt, während der Boden mit Nährstoffen über die poröse Einlage14,19ergänzt wird; (II) die Kelle, ursprünglich entwickelte Methode Kultur ganze Organe oder embryonalem Gewebe Scheiben. In diesem Scheiben wurden auf einer Baumwolldecke oder eines Filters, unterstützt durch ein Metallgitter platziert, und der Filter wird in das Kulturmedium getränkt. Um das Gewebe feucht zu halten, wird eine dünne Schicht des Mediums auf die Scheiben20,21,22hinzugefügt. Diese ersten beiden sind sogenannte Luft-Flüssigkeit Interphase Kulturen; III) Walze Rohr Kulturen, in denen Scheiben befinden sich im Inneren der flachen Seite des ein Kunststoffrohr mit Medium und langsam Rohr Rotation sorgt dafür, dass das Gewebe ist mit Medium während des ersten Teils des Zyklus bedeckt oder während der zweiten23belüftet; (IV) rotierenden Inkubation Einheiten, in denen Scheiben zeitweise Medium mit Nährstoffen und Belüftung ausgesetzt sind. Anders als bei Roller Röhren, bei dieser Methode werden die Scheiben auf porösen Titan Abtropfgitter in 6-Well-Platten mit Kulturmedium24platziert sind.

Gewebe-Scheiben abgeleitet resezierten soliden Tumoren logischerweise vorhanden eine attraktives Ex Vivo Modell, testen Sie den Behandlungserfolg der Anti-Krebs-Wirkstoffe, wie sie die Bewertung der Tragfähigkeit ermöglichen, gezielte Weg Aktivität und molekularen Profile eines spezifischen Tumors im Beisein seiner nativen Tumor Mikroumgebung. Um festzustellen, ob die Droge Reaktionen gemessen in Tumor Scheiben prädiktiv für in Situ Antworten sind, ist es jedoch wichtig zu analysieren, in welchem Umfang Gewebe Scheiben tumorspezifischen biologische Funktionen wie Zellproliferation zu bewahren, Histopathologie-spezifische Zelldifferenzierung oder onkogenen Signalisierung Aktivitäten. Die Auswirkungen von mechanischen Stress löste bei Slice Vorbereitung, Slice Handhabung oder Kultur-induzierte Anpassungen auf die Qualität und die biologischen Funktionen des Gewebes Scheiben sind grundlegende Fragen, die eng miteinander verbunden, die Fähigkeit zur Umsetzung Tumor abgeleitet Scheiben für Funktionsdiagnostik.

Unser Konsortium IMI-finanzierte Projekt PREDECT (http://www.predect.eu) legt systematisch an diese grundlegenden Fragen von Slice-Explantaten aus einer Vielzahl von Quellen zu studieren. Mit Scheiben von Brust-, Prostata- und Lungenkrebs Krebs-Modellen abgeleitet, diese gemeinsame Anstrengung genutzt, qualitative auslesen sowie quantitative Hämatoxylin und Eosin (H & E) - basierte anzeigen zu zeigen, eine Voraussetzung für Luftsauerstoff und stagnierenden filter unterstützt um die Lebensfähigkeit des kultivierten Scheiben bis zu 72 h aufrecht zu erhalten. Immunhistochemie (IHC) Analysen auf kultivierten Scheiben ergab darüber hinaus Intra-Slice Lebensfähigkeit Steigungen, belegt als Nekrose Gradienten in Scheiben von murinen nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), Östrogen-Rezeptor (ER), HIF1α abgeleitet und γH2AX Gradienten in Brust-Krebs-Scheiben oder Androgen-Rezeptor (AR) Ausdruck Steigungen bei Prostatakrebs Scheiben25. Interessanterweise, Intra-Slice Lebensfähigkeit Gradienten im 24 h-Kulturen von murinen NSCLC wurden gerettet durch Anbau in einer Dreheinheit Inkubation, und unsere Studie zeigte, dass Tragfähigkeit bis 72 h26erweitert wurde. Besonders die Oberseite blieb praktikabelste26, befürwortet, dass Medikament Antwort Analysen auf Scheiben am besten auf dieser Seite des Gewebes durchgeführt werden.

Obwohl es bleibt eine Frage, wie viel Gewebe Scheiben können in Situ Tumor Funktionen zusammenfassen, sie wurden ausgiebig genutzt, um Antworten auf Anti-Krebs-Mittel, insbesondere zielgerichteten Medikamenten, monoklonale Antikörper und Chemotherapeutika testen 10,11,13,14,18,27. Wir zeigten kürzlich, dass murine NSCLC Scheiben dynamische Veränderungen in Verbreitung zeigen und Onkogene Signalisierung Aktivitäten nach Anbau im Vergleich zu 0 h frisch geschnittenen Scheiben26. Dies bedeutet, dass es wichtig ist zu untersuchen, ob die gezielte in Situ biologische Funktionen entsprechend während des Anbaus vor Störung Studium erhalten bleiben. Trotz dieser Erkenntnisse zeigten wir, dass Tumor Scheiben räumliche Reaktion auf gezielte Therapien, inmitten Medikament modellieren können Behandlungen bleiben kurz (24 h) und werden zu Beginn der Kultivierung26initiiert. Das folgende Protokoll beschreibt wichtige Bestätigung für die Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Kulturen, vor deren Anwendung in der pharmakologischen Drogentests relevanten Aspekte.

Protokoll

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Alle Maus-Experimente beschrieben in dieser Studie wurden nach den Hinweisen aus der finnischen National Board Tier Experimente durchgeführt und wurden die experimentellen Tier vom von der Universität Helsinki und der State Provincial angenommene Büro Süd-Finnland (Lizenz Nr. ESAVI/9752/04.10.07/2015).

1. Vorbereitungen vor dem Schneiden

  1. Halten Sie folgenden Materialien bereit: Vibratome Probenhalter, Vibratome Puffer 10 cm Kultur Platte, 24-Well-Platte, 10 mL-Pipette, Tablett, Pipette junge, Auffangbeutel, 70 % EtOH in ein 50 mL-Tube, die Instrumente und Gewebekleber zu desinfizieren.
  2. Vorbereiten der Vibratome: Wischen Sie den Klingenhalter mit 70 % EtOH, fügen Sie ein neues Blatt, und führen Sie eine Vibrocheck entsprechend den Anweisungen im Handbuch (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
    Hinweis: Es ist wichtig, den Vibrocheck Schritt durchzuführen, wie es die vertikale Auslenkung der Klinge minimiert und sorgt für gute Qualität-Scheiben.
  3. Füllen Sie jeweils auch von der 24-Well-Platte mit 1 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) ergänzt mit 100 U/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin (HBSS + P/S); halten Sie die Platte auf dem Eis.
  4. Bereiten Sie F12 Kulturmedium mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin, 2 mM Glutamax, 22 mM Glukose und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt.
    Hinweis: Tumor Slice Kulturmedium und Wachstumsfaktor Ergänzungen variieren je nach der Tumor-Gewebe-25.
  5. Bereiten Sie die erforderliche Menge an F12 Medium für medikamentöse Behandlung, verwenden die gleiche Zusammensetzung wie unter Punkt 1.4 beschrieben, aber das Weglassen der FBS.
    Hinweis: Da Wachstumsfaktoren im Serum onkogenen Signalisierung in kultivierten Scheiben beeinträchtigen können, empfiehlt serumfreien Medium für kurzfristige Störung Medikamentenstudien am Tumor Scheiben. Wenn längerfristige Slice Kulturen analysiert werden, ist es wichtig, zunächst die Wirkung der serumfreien Medium auf Gewebe Lebensfähigkeit und tumorspezifischen Marker Ausdruck in den unbehandelten Slice Kulturen bewerten.

2. Sammlung von Tumor-tragenden Lunge

  1. Einschläfern Sie eine Tumor-tragenden Maus durch zervikale Dislokation, wenn es Symptome von erschwerte Atmung und Verlust von Körpergewicht zeigt.
    Hinweis: CO2-vermittelten Sterbehilfe nennt man induzieren hypoxische Bedingungen in der Lunge, die sich auf Slice Lebensfähigkeit oder onkogenen Aktivitäten auswirken über eine hypoxische Antwort zu entlocken.
  2. Dehnen der euthanasierten Maus auf Styropor Deckel durch Einfügen von 30 G Nadeln in allen vier Pfoten, so dass die Brust ausgesetzt ist.
  3. Schneiden Sie die Haut aus dem Bauch in Richtung der Brust und bis in den Halsbereich. Schneiden Sie den Brustkorb und das Zwerchfell, Lunge und Herz aussetzen. Halten Sie die Schere in einer abgewinkelten Position, um Gewebeschäden zu vermeiden.
  4. Sezieren Sie die Tumor-tragenden Lungen zusammen mit dem Herzen zu und legen Sie sie in ein 50 mL-Tube mit 30 mL eiskaltes HBSS + P/S; halten Sie den Schlauch eiskalt und fortfahren Sie so schnell wie möglich mit dem nächsten Schritt.
    Hinweis: Verzögerungen in der Bearbeitung von Lungentumoren können Onkogene Funktionen verändern z. B. Signalisierung Weg Aktivitäten.

3. Generation von präzise geschliffenen Lungentumor Scheiben

  1. Übertragen Sie die Tumor-tragenden Lungen in HBSS + P/S in eine 10 cm Gewebekultur Platte innerhalb einer laminaren Kapuze gehalten. Trennen Sie die Lungenlappen mit steriler Schere und Pinzette zu, und wählen Sie Lappen mit Tumoren an der Oberfläche zum Schneiden.
    Hinweis: Tumoren > 3 mm Größe eignen sich zum Schneiden. Da normale Lungengewebe umgeben den großen Tumor Kompromissen schneiden aufgrund von Unterschieden im Gewebe Steifigkeit sollten Tumorgewebe unterziehen Schneiden abseits der normalen Gewebe getrennt werden, derart, dass eine ausgeglichene Tumorregion Vibratome Klinge steht.
  2. Generieren Sie ein flaches Stück Gewebeoberfläche durch Schneidenteil des normalen Lungengewebes, die den Tumor entfernt mit einem sterilen Skalpell umgibt, und Tauchen Sie die flachen Folie in einen Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff. Montieren Sie diese Seite auf der Vibratome Probenhalter, so, dass der Tumor die Klinge in einer aufrechten Position zeigt. Lassen Sie den Kleber für 2 – 3 min. trocken.
    Hinweis: Das normale Lungengewebe geklebt, um die Probenhalter nicht stören Tumor Gewebe schneiden und schneiden wird gestoppt, bevor das normale Gewebe erreicht wird. Das Tumorgewebe beugt sich manchmal aufgrund der schwammigen Struktur des normalen Lungengewebes auf Probenhalter, beeinträchtigen die aufrechte Position geklebt. Wenn dies geschieht, kleben Sie ein Stück zusätzliche normale Unterstützung Lungengewebe neben der vormontierten normale Lungengewebe, den Tumor in einer aufrechten Position (Abbildung 1A Iii) zu behalten.
  3. Legen Sie die Probenhalter in das Metall Puffer-Fach und füllen Sie ihn mit kaltem HBSS + P/S, bis das Gewebe in den Puffer eingetaucht ist. Das Tablett Metall Puffer auf das weiße Eisbad und fügen Eis um das Gewebe beim Schneiden kühl zu halten.
  4. Legen Sie das weiße Eisbad auf der Vibratome. Wählen Sie geeignete Slice Einstellungen: Amplitude zwischen 2,5-2,8, schneiden Geschwindigkeit zwischen 0,10 0,14 ms und eine Schnittstärke zwischen 160-250 µm.
    Hinweis: Slicing Einstellungen je nach Härte des Gewebes angepasst werden müssen. Hartgewebe ist einfacher zu schneiden als weicher Gewebe und weicher Gewebe erfordert schneiden mit niedriger Geschwindigkeit (0,1-0,12 ms) und höhere Amplitude (2,6-2,8). Ein 4 – 5 mm großen Tumor enthält in der Regel 15 – 20 Scheiben von 200 µM Dicke. Für kurzfristige Anbau können murine Tumoren unter semi-sterilen Bedingungen außerhalb der laminaren Haube geschnitten werden. Jedoch sollten klinische Tumoren innerhalb einer Klasse II Biosicherheit laminar Haube, um mögliche Krankheitserreger in das menschliche Gewebe zu vermeiden immer geschnitten werden.
  5. Mit sterilen Pinzette, sammeln Sie die Scheiben in 1 mL HBSS in separaten Brunnen von einer 24-Well-Platte auf dem Eis, statt eng Überblick über die Reihenfolge, in der Scheiben geschnitten sind. Markieren Sie jeweils auch von der 24-Well-Platte nach dem Versuchsplan. Zum Beispiel Drogen Mark sequentielle Brunnen von einer 24-Well-Platte als Kultur Zeitpunkten oder als 0 h, Fahrzeugkontrolle (C) behandelten (T) (Abbildung 1 b Ii).
    Hinweis: Nicht stören Sie und ziehen Sie das Tumorgewebe beim sammeln ein Stück der Tumor Orientierung in Bezug auf den Winkel der Klinge führt zu Inkonsistenzen in den Stärken der nachfolgenden Scheiben verändern wird.
  6. Wenn alle Scheiben gesammelt werden, übertragen Sie sie auf Titan Abtropfgitter (2-3 Scheiben pro Raster) in einer 6-Well-Platte mit 2,5 mL Kulturmedium pro Bohrloch. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen den Titan-Raster und dem Medium gebildet werden.
    1. Laden eine Scheibe auf den Backrost, 6-Well-Platte in einer abgewinkelten Position halten, so dass ein Teil des Mediums erstreckt sich das Netz, und legen Sie die Scheibe in das Medium in der Startaufstellung; Verwenden Sie Zange um die Scheibe zu verbreiten, wenn es locken. Laden Sie die 6-Well-Platten auf der Dreheinheit Inkubation innerhalb einer befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 95 % Luft und 5 % CO2beibehalten und Startzyklus Drehung (Abbildung 1 i-Ii).
      Hinweis: Metallische Gitter und die 6-Well-Platten müssen genau Gewicht vor dem Einschalten der Dreheinheit ausgeglichen werden. Es ist wichtig, die Scheiben in der Mitte des Rasters zu positionieren, um sie vollständig wechseln Sie zwischen der Luft und flüssigen Phasen während der Drehung-Zyklen. Scheiben, die zu niedrig oder hoch platziert werden sind nicht entsprechend ausgesetzt Sauerstoff oder Nährstoffen (Abbildung 1 ich), die Gewebe Lebensfähigkeit gefährden kann. Es ist wichtig, die Position der Scheibe in der Startaufstellung beim Anbau, folgen, wie die Scheibe gelegentlich nach unten rutschen kann. Geschieht dies innerhalb von 1 – 2 h Kultur auftreten, korrigieren Sie seine Position zu und notieren Sie sich, dass in diesem Beispiel beschädigt werden. Scheiben, die für längere Zeit mispositioned sind sollten entsorgt werden, Gewebe Lebensfähigkeit durch unsachgemäße Sauerstoffversorgung und Nährstoffversorgung erheblich beeinträchtigt wird.
  7. Sammeln Sie ein Gewebe Stück neben dem kultivierten Scheiben wie ein 0 h, unkultiviert, Referenz. Sammeln Sie mindestens drei Referenz-Scheiben zur Darstellung von oben, Mitte und Zentrum des Gewebes wird in Scheiben geschnitten. Befestigen Sie die 0 h Scheiben sofort und Prozess, wie unter 5.1 beschrieben.
    Hinweis: Wenn die Anzahl der Scheiben begrenzt ist, z.B.wenn mehrere zusammengesetzte Behandlungen oder technische Wiederholungen durchgeführt werden, Vergleiche jeder behandelten Probe mit seinen benachbarten 0 h Probe können schwierig sein. Verwenden Sie in solchen Fällen die nächste 0 h-Scheibe (mindestens 400 – 600 µm auseinander) um relative Gewebe Lebensfähigkeit oder Ausdruck der relevanten Marker zu Beginn der Kultur zu beurteilen.
  8. Ergänzen Sie für langfristige Anbau das Kulturmedium jeden Tag. Heben Sie das Raster mit den Gewebe-Scheiben mit sterilen Pinzette, und legen Sie sie in einen leeren Brunnen 6-Well-Platte; ersetzen Sie 70 % des Mediums mit frischem Nährmedium zu, und setzen Sie das Raster wieder in das Medium. Weiter die Drehung Zyklus wie in Schritt 3.6 erläutert.

4. Behandlung von Tumor-Scheiben mit niedermolekularer Hemmer

  1. Bereiten Sie die erforderlichen Konzentrationen von Verbindungen in Behandlung Medium. In der Regel muss ein 10-divisibel höhere Wirkstoffkonzentration im Vergleich zu den IC50s, gemessen in Zellkulturen Ziel Hemmung in Gewebe Scheiben zu erreichen. Zur Vermeidung von unspezifischen Zytotoxizität testen Sie verschiedener Konzentrationen minimal wirksame Konzentration für jede Verbindung zu erhalten. Hier, testeten wir 0,1 – 1 µM PI3K/mTOR-Inhibitor Dactolisib und 0,05 – 0,5 µM von MEK-Inhibitor Selumetinib auf murinen NSCLC Scheiben.
  2. Fügen Sie 2,5 mL der Medien mit der verdünnten Medikament oder DMSO oder andere Fahrzeugkontrolle in der 6-Well-Platte. Legen Sie die Titan-Gitter in die Vertiefungen.
  3. Legen Sie die Gewebe-Scheiben auf die Netze, wie unter Punkt 3.6 beschrieben.
  4. Durchführen Sie Fahrzeug oder Droge-Behandlungen für 24 h weiter mit Gewebe Fixierung und die Verarbeitung der Scheiben zu Paraffin-Blöcke wie in Abschnitt 5 beschrieben.
    Hinweis: Dauer der medikamentösen Behandlung kann je nach Ziel des Experiments, optimiert werden, unter Berücksichtigung der Fähigkeit Gewebe Scheiben, in Situ Gewebefunktionen analysiert während der Kulturdauer zu behalten.

5. Fixierung und Verarbeitung von Gewebe-Scheiben

  1. Heben Sie vorsichtig den unkultivierten 0 h Referenz- oder kultivierten Scheibe auf ein Filterpapier in gepufferter Kochsalzlösung getränkt.
    1. Um dies zu tun, fügen Sie 2-3 mL PBS in einer 10 cm Platte den Slice-Schwimmer mit PBS-Puffer und lassen Sie "Fischen Sie" sie sich durch Anheben der Scheibe auf dem Filterpapier mit einer Zange.
    2. Übertragen Sie das Filterpapier in eine Histocassette, und Tropfen Sie einen verdünnter Hämatoxylin (1:1 in entionisiertem Wasser) auf das Gewebe-Segment um die Position der Scheibe sichtbar während der anschließenden Bearbeitungsschritte (Abbildung 1) zu markieren.
    3. Schließen Sie die Kassette, und in 4 % neutral gepuffertem Formalin-Lösung übertragen. Beheben Sie das Gewebe über Nacht bei 4 ° C.
      Hinweis: Während des Einsetzens der Scheibe auf dem Filterpapier, stellen Sie sicher, dass das Oberteil des Segments nach oben zeigt; Dies ist notwendig, die oberen, mittleren und unteren Bereich einer Scheibe schneiden und Analyse, wie unter Punkt 6.3 beschrieben folgen.
  2. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Kassetten in 70 % EtOH, und fahren Sie sofort mit der Einbettung von Paraffin Gewebe Verarbeitungsschritt.
  3. Vor der Verarbeitung von Gewebe, Waschen der Histocasettes in 100 % EtOH 2 X 10 min. lang. In diesem Fall verwenden Sie eine Mikrowelle-Station für Gewebe Verarbeitung. Wählen Sie das Programm für 1 mm dicke Gewebe und folgen Sie den Anweisungen im Handbuch (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
    Hinweis: Bei Verwendung von anderem Gewebe Bearbeitungsmaschinen verwenden Sie das Programm geeignet für dünne Gewebeproben.
  4. Öffnen Sie für die Einbettung von Paraffin eine Histocassette und mit einem Skalpell heben Sie vorsichtig die Scheibe aus dem Filterpapier. Verwerfen Sie das Filterpapier zu, und übertragen Sie die Scheibe in eine Form mit flüssigem Paraffin.
    1. Drücken Sie das Gewebe an der Unterseite der einbettenden Form, zum Beispiel mit einem flachen Gewicht darauf sogar schneiden. Legen Sie den Unterteil des Histocasette oben auf dem Schimmel, lassen Sie der Schimmel auf eine kalte Pastete für 30 min. abkühlen und trennen Sie der Schimmel von der Paraffinblock.
      Hinweis: Als Alternative zur horizontalen einbetten, es ist möglich, den Tumor Slice einbetten vertikal durch die Positionierung der Scheibe in einer aufrechten Position. Vertikale Abschnitte erlauben ohne weiteres Analyse von Gradienten in Lebensfähigkeit oder funktionelle Marker Ausdruck auf einem einzigen Abschnitt 25. Gradient Analyse mit horizontal eingebettet Scheiben erfordert Paraffin-Schnitt wie in Schritt 6.2 beschrieben.

6. Verarbeitung und Analyse von Formalin fixiert und Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe

  1. Bereiten Sie 4 µm dünne Abschnitte der FFPE Gewebe Scheibe Blöcke mit einem Mikrotom. Beim Schneiden, stellen Sie den Winkel des Blocks, so dass die Oberfläche des Blocks in Bezug auf die Klinge horizontal ausgerichtet ist; Dies ist notwendig, auch Abschnitte durch das Gewebe zu erhalten.
  2. Zur Erfassung eines potenziellen Kultur-induzierte Lebensfähigkeit Farbverlauf, Zellwanderung in kultivierten Scheiben über die Scheiben oder Farbverläufe in Biomarker Ausdruck ermöglichen, sammeln Sie Abschnitte aus den oben, Mitte und unten Schichten der einzelnen Gewebe Slice auf Objekt Folien wie weiter unten erläutert.
  3. Sammeln Sie sequentielle Gewebeschnitte von Paraffin-eingebetteten Gewebe Scheibe zuerst am oberen Teil der Glas-Folien. Fahren Sie fort, die Abschnitte der tieferen Gewebeschichten in der Mitte, gefolgt vom Unterteil des Glas-Objektträger (Abbildung 1E) zu sammeln.
    Hinweis: Um drei Abschnitte auf einen Glasobjektträger unterzubringen, trim entfernt das Übermaß an Paraffin rund um den eingebetteten Gewebe Slice.
  4. Lassen Sie die Abschnitte über Nacht bei 37 ° C trocknen, und fahren Sie mit H & E Färbung oder Immunohistochemistry, wie unten beschrieben.
    Hinweis: Verlust der Antigenität kann auftreten, wenn FFPE Abschnitte bei hohen Temperaturen oder für längere Zeit gespeichert werden. Paraffin-Abschnitte werden empfohlen, bei 4 ° C gelagert werden, und innerhalb von 6 Monaten nach dem Schnitt sollte IHC Analysen durchgeführt werden.
    1. Für H & E Färbung, deparaffinize und rehydrieren die Paraffin-Abschnitte wie folgt: Xylol 3 X 5 min, 100 % EtOH 3 X 1 min., 96 % EtOH 2 X für 1 min, 70 % EtOH 1 x 1min und deionisiertes Wasser 2 X 1 min.
    2. Die Abschnitte in frisch gefilterte Hämatoxylin Lösung für 10 min inkubieren und waschen unter fließendem Leitungswasser für 5 min. Dip die Abschnitte in saurem Alkohol (1 % HCl in 70 % EtOH) für 2 Mal und waschen unter fließendem Leitungswasser für 5 min, gefolgt von Inkubation mit 0,5 % Eosin für 2 m in.
    3. Nach dem Eosin Schritt entwässern in den Abschnitten durch Eintauchen der Folien in Alkohol und Xylol-Lösungen, wie folgt: 96 % EtOH 2 X für 15 s, 100 % EtOH 3 X für 30 s, Xylol 3 X 1 min. lang. Zu guter Letzt die Abschnitte in Xylol basiert Eindeckmittel einbetten.

7. Analyse der Gewebe Lebensfähigkeit und Biomarker-Ausdruck

  1. Bilder mit hoher Auflösung durch die Generierung von ganze Dia-Scans von H & E-gefärbten Folien mit Hilfe eines Scanners zu erwerben. Um Gewebe Lebensfähigkeit zu beurteilen, nehmen Sie Schnappschüsse von den Gewebe-Scans für die oberen, mittleren und unteren Abschnitte der Scheiben.
    1. Zeichnen Sie mit Foto-Manipulator-Software manuell Masken auf die nekrotischen Bereiche des Gewebes, gefolgt von Quantifizierung des nekrotischen Regionen mit MATLAB.
    2. Berechnen Sie die relative Rentabilität der Scheiben zu unterschiedlichen Zeitpunkten im Vergleich zu den nächstgelegenen 0 h-Scheibe, wie in unserer vorherigen Studie (Närhi Et Al., Abbildung S2B und C)26kultiviert. Ebenso bewerten Sie potentielle Intra-Slice Lebensfähigkeit Gradienten durch Quantifizierung der Rentabilität im oberen, mittleren und unteren Abschnitt eines kultivierten Slice, und berechnen Sie die relative Rentabilität der einzelnen Abschnitte zu seinen engsten 0 h schneiden.
      Hinweis: Während der reine Anbau von murinen NSCLC Scheiben nekrotischen Zelltod induziert, abhängig von biologischen Reaktionen auf ex Vivo Kulturbedingungen das Tumorgewebe. Beispielsweise wurden Gradienten in HIF1α, ER und Makrophagen geprägt von F4/80 im Filter unterstützt Slice Kulturen abgeleitet von einer Brust Krebs Modell25festgestellt. H & E - sowie IHC-basierte Analysen der kultivierten Scheiben müssen daher für jede Art von Gewebe in Betracht gezogen werden.
  2. Durchführen Sie IHC auf den Paraffin-Abschnitten. Das folgende IHC-Protokoll stellt einen Ausgangspunkt dar und erfordert eine weitere Optimierung für andere Antikörper. Kurz, deparaffinize und rehydrieren die Paraffin-Abschnitte wie folgt: Xylol 3 X 5 min, 100 % EtOH 3 X 1 min., 96 % EtOH 2 X für 1 min, 70 % EtoH 1 X für 1 min und deionisiertes Wasser 2 X 1 min.
    1. Zu den Antigenen Epitope aussetzen, führen Wärme vermittelt Antigen-Retrieval mit 10 mM Zitronensäure bei pH 6 in einem PT-Modul gefolgt von normalem Ziegenserum (NGS) mit 1 X PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur (21-23 ° C) mit 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) und 10 % blockieren.
    2. Inkubieren Sie den primären Antikörper in 1 % BSA und 5 % verdünnt NGS in 1 X PBS, entweder für 1 – 2 h bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörper Anti-Kaninchen, für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von Erkennung mit 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB).
    3. Abschnitte sind mit Hämatoxylin (um 01:10 in entionisiertem Wasser verdünnt) für 30 s und waschen unter fließendem Wasser für 5 min, gefolgt von Austrocknung durch Eintauchen der Folien in Alkohol und Xylol Lösungen wie folgt counterstained: 70 % EtOH 1 x 96 % EtOH 2 x 100 % EtOH 3 x Xylol 3 X ( Schritt 1 min). Zu guter Letzt die Abschnitte in Xylol basiert Eindeckmittel einbetten.
  3. Erwerben Sie ganze Dia-Scans von IHC-gefärbten Folien zu, exportieren Sie sie als TIFF-Bilder bei einem Abbildungsmaßstab von 1:4 mit der mit einem Bildbetrachter und führen Sie die Quantifizierungen mit ImageJ.
    Hinweis: als Alternative zu den Scanner, mikroskopische Bilder 20 X oder 40 X Vergrößerung für Quantifizierungen erworben werden können. Bildvergrößerung kann quantifiziert werden je nach der Markierung gewählt werden; hohe Vergrößerung Bilder sind empfohlen für nukleare Färbung, während zytoplasmatischen oder Membran-Marker mit 20 X Bilder quantifiziert werden können.
    1. Für die Quantifizierung der nuklearen Marker in diesem Fall NKX2-1 Expression, konvertieren Sie jedes Bild in 16-Bit-Bilder mit Fidschi-ImageJ, und laden Sie Bilder für die Bildanalyse.
    2. Passen Sie die Bild-Analyse-Pipeline je nach Analyse. In diesem Protokoll verwenden die folgende Pipeline für die Quantifizierung von NKX2-1 positive Kerne: identifizieren Primärobjekte | Messung der Intensität Objekt | Objekte zu filtern (minimaler Wert = 0,0025) | Berechnen Sie Math Die Ergebnisse werden als Prozentwerte der DAB-gefärbten Kernen der die Gesamtzahl der Kerne dargestellt.

Ergebnisse

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Abbildung 1 stellt den Workflow für die Generation, Anbau und Analyse von präzise geschliffenen Gewebe Scheiben aus murinen NSCLC-Tumoren abgeleitet. In dieser Demo verwendet wir Tumoren aus einer gentechnisch Mausmodell (GEMM) beherbergen bedingte Aktivierung des KrasG12D zusammen mit dem Verlust von Lkb1 (auch bekannt als Serin/Threonin-Kinase 11), nachstehend KL. Maus-Zucht und Lunge Tumorentstehung erfolgte wie in26,28beschrieben. Abbildung 2A zeigt die Wirkung der Scheibendicke Gewebe auf die Lebensfähigkeit des Scheiben-kultivierte für 24 h mit einer rotierenden Inkubation-Einheit. Die Ergebnisse zeigen, dass 160 µm dünne Scheiben nekrotische großflächig über die Scheibe enthalten. Darüber hinaus zeigen 250 µm dünne Scheiben eine Nekrose Farbverlauf über die Scheibe im Vergleich zu 200 µm dünne Scheiben schneiden. Es ist wahrscheinlich, dass die Armen Insgesamte Lebensfähigkeit der dünnste 160 µm, durch technische Abwicklung verursacht wird bei der Positionierung der Scheiben auf die Netze, wie diese sind empfindlich und neigen zu locken. Auf der anderen Seite, wenn Scheiben zu dick sind, sie anfällig für Mangel an Sauerstoff oder Nährstoffen Diffusion über die Scheiben werden können, wird die in murinen NSCLC explants als nekrotische Tod gradient25belegt. Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass mit variabler dicke Scheiben von einem Tumor, trotz Verwendung von identischen Vibratome Einstellungen erzeugt werden können. Es empfiehlt sich daher, mehrere Wiederholungen aus verschiedenen Tumorproben zu analysieren. Wichtig ist, erfordert jeden Gewebetyp Slice Dicke Optimierung maximale Rentabilität zu erreichen, da Gewebe Textur und Härte Sauerstoffversorgung und Nährstoffe fließen beeinflussen können. Abbildung 2 b -2C veranschaulicht quantitative IHC Analysen der NKX2-1 Expression, eine Markierung von gut differenziertem Lunge Adenokarzinom (AC) in Proben kultiviert bis zu 72 h und 0 h Scheiben abgestimmt. Ergebnisse zeigen, dass NKX2-1 Expression nicht erheblich, in kultivierten Scheiben im Vergleich zu 0 h unkultiviert Scheiben geändert wird, was darauf hindeutet, dass der Prozess der Anbau nicht offen den Differenzierung Status des Tumorgewebes AC auswirkt. Abb. 2D zeigt das Dienstprogramm Tumor Gewebe Scheiben für die Bewertung der Wirksamkeit der zielgerichteten Medikamenten. Wir zeigte kürzlich, dass Kras mutierten murinen ACs Ausstellung hohe Expression von phosphorylierten ERK1/2 (Kennzeichnung MAPK Weg Überaktivität) im Vergleich zu adenosquamöse (ASC) Tumoren, beim Ausdruck der phosphorylierten 4EBP1 (Markierung mTOR-Aktivität ) in ähnlicher Weise äußert sich in AC und ASC Tumoren. Um zu testen, ob diese Bahnen auf Gewebe Scheiben zielgerichtet, KL AC Gewebe Scheiben mit DMSO behandelt wurden oder titriert Mengen Verbindungen, nämlich 0,1 – 1 µM Dactolisib, Ziel der mTOR-Signalweg oder 0,05 – 0,5 µM Selumetinib, MAPK Weg zu Zielen. Ergebnisse zeigen, dass 1 µM Dactolisib oder 0,5 µM Selumetinib sind wirksam bei der Hemmung der Phosphorylierung von 4EBP1 oder ERK1/2, beziehungsweise. Darüber hinaus deutet dosisabhängige Inhibition der gezielten Phosphoproteine Gewebe Scheiben auch ausgenutzt werden können, um Phosphorylierung-spezifische Antikörper zu überprüfen.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des Workflows für Einrichtung und Analyse der murinen NSCLC Tumor abgeleitet Slice Explantaten. (A) Schema beschreibt die Sammlung und Aufbereitung von Tumor-tragenden Lungen zum Schneiden. Lungenlappen werden von einer Maus geerntet und Tumorgewebe wird vom normalen Gewebe durchschnitten. Die schwarze Pfeilspitze und Sternchen zeigen ca. 4 mm und 1 mm Tumoren bzw.. Die weiße Pfeilspitze zeigt Lungengewebe geklebt, um die Oberfläche der Probenhalter. Der rote Pfeil zeigt auf ein zusätzliches Stück normale Lungengewebe Unterstützung, den Tumor in einer aufrechten Position zu behalten. (B) Vibratome schneiden und Sammlung von Gewebe-Scheiben. Weißer Pfeil zeigt die Slice Richtung. Sammlung von sequentiellen Scheiben in einer 24-Well-Platte mit kalten HBSS + P/S. Die Scheiben können entweder kultiviert zu verschiedenen Zeitpunkten (hier: 24-72 h) tumorspezifischen Marker Ausdruck während des Anbaus (obere Zeile) zu beurteilen, oder können zur medikamentösen Behandlungen durchführen. C: Fahrzeugkontrolle, T: medikamentöse Behandlung. (C) der Gewebe-Scheibe für den Anbau mit rotierenden Inkubation Einheiten platzieren. Kippen Sie 6-Well-Platte zu, so dass einige Medium den oberen Rand des Rasters bedeckt, legen Sie die Gewebe-Scheibe in der Mitte des Rasters auf dem Medium und verbreiten Sie das Slice mit Pinzette zu. Sicherstellen Sie, dass die 6-Well-Platten Gewicht für eine gleichmäßige Drehbewegung Zyklus ausgeglichen werden. X: zeigt falsche, und figure-results-2 : zeigt die korrekte Positionierung des Segments. (D) Foto von der Proteinkinase-Block eines Tumor-Segments. Schwarzer Pfeil auf Paraffin-eingebetteten Gewebe Slice gefärbt mit Hämatoxylin. (E) Schaltpläne zeigen die Stationspunkte Reihenfolge der Scheiben in FFPE-Blöcken; Diese Abschnitte können verarbeitet werden, um Gewebe Lebensfähigkeit und Tumor-spezifische Biomarker Ausdruck zu bewerten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2: Beurteilung der Lebensfähigkeit und Histotype-spezifische Marker Ausdruck und gezielte medikamentöse Behandlung auf NSCLC Gewebe Scheiben. (A) Vertreter H & E Bilder von AC NSCLC Scheiben von der angegebenen dicken kultiviert für 24 Std. 200 µm dünne Scheiben halten bessere Rentabilität im Vergleich zu 160 µm und 250 µm dünne Scheiben schneiden. Dunkelblaues Blau steht für H & E gefärbt tragfähige Gewebe und Rosa zeigt pseudocolored nekrotische Regionen. Hellblau zeigt Regionen, die aus der Analyse, entweder durch schlechte Gewebe Qualität oder das Vorhandensein von fibrösen Stroma ausgeschlossen. T1 und T2 sind biologische Wiederholungen von zwei verschiedenen Tumoren abgeleitet. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) repräsentative IHC Bilder von NKX2-1 Expression in AC-Scheiben für den angegebenen Zeitpunkten kultiviert. Pfeil zeigt den Bereich, in stärkerer Vergrößerung dargestellt. Ergebnisse zeigen, dass NKX2-1 Expression in den kultivierten Scheiben im Vergleich zu 0 h Scheiben nicht verändert wird. Maßstabsleiste = 500 µm und 50 µm für niedrige und hohe Vergrößerungen, beziehungsweise. (C) Quantifizierung der in (B) dargestellten Daten. (D) Vertreter IHC Bilder von phosphorylierten 4EBP1 oder pERK1/2 Ausdruck in 0 h Scheiben oder Scheiben mit DMSO behandelt oder titriert Mengen an Dactolisib (Dact, oberste Zeile) oder phosphoryliert pERK1/2 Ausdruck 0 h Slice oder Scheiben mit DMSO behandelt oder Selumetinib (Sel, untere Reihe). Schwarze Kästchen zeigen Bereiche in stärkerer Vergrößerung dargestellt. Maßstabsleiste = 1 mm oder 50 µm für niedrige oder hohe Vergrößerung, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

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Verschiedene komplexe in-vitro- Tumor-Modelle, einschließlich 3D Kulturen und Organellen, wurden entwickelt, um die Architektur und onkogenen Funktionen von in Vivo Tumor Gewebe29,30rekapitulieren. Allerdings beinhaltet die Errichtung von 3D Kulturen oder Organellen Gewebe Dissoziation und selektives Wachstum von einem einzigen Zelltyp oder Kokultur eine wählen Sie einige Zelltypen in einer künstlichen Umgebung. Als Folge erfassen solcher Modelle unvollständig die Feinheiten des Tumor-Heterogenität und Tumor-Stroma-Interaktionen. Organotypischen Tumor Scheiben, halten auf der anderen Seite die Gewebe Architektur und biologischen Komplexität der Tumor in Situ ohne umfangreiche Manipulation. Diese Fähigkeit des Gewebe-Scheiben, Modell Tumorzellen in ihrer nativen Mikroumgebung macht sie besonders attraktiv für präklinische Studien. Wir berichteten bereits einen optimierten Workflow für die Einrichtung und Analyse der Tumor präzise geschliffenen Scheiben und zeigten, dass, im Vergleich um zu filtern, unterstützt, eine Inkubation Dreheinheit verbessern die Lebensfähigkeit der kurzfristigen murinen NSCLC Slice Kulturen25 , 31. jedoch Anbau auf rotierenden Einheiten ist technisch anspruchsvoll und erfordert eine ständige Überwachung. Wir stellen Ihnen hier ein Protokoll für Tumor-Gewebe-Slice-Generation und praktischen Einsatz einer rotierenden Inkubation Einheit um ihnen Kultur, sowie begleitende Methoden, um die Fähigkeit der Scheiben, in Situ Tumorbiologie Voraussetzung vor der Droge erfassen überwachen Antwort-Tests.

Mehrere wichtige Schritte im Protokoll sicherzustellen Gewebe Integrität und Lebensfähigkeit der Tumor Scheiben. Wenn normale Lungengewebe den Tumor umgibt, kann der Vibratome mit inkonsistenten dicke Scheiben zu generieren oder die Scheiben aufgrund von Unterschieden in Struktur und Steifigkeit zwischen normalen und Tumor-Gewebe beschädigen. Es ist daher wichtig, die umliegenden normalen Lungengewebe vor Tumor schneiden zu entfernen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist das slicing Dicke, die sorgfältig für jeden Gewebetyp optimiert werden soll. Darüber hinaus einmal in Scheiben geschnitten, ist es wichtig, dass die Scheibe etwa in der Mitte das Raster, also genau darauf intermittierende eintauchen in Kulturmedium und Sauerstoff Exposition platziert wird. Schließlich ist es wichtig, die Position eines Segments während der Rotationszeit, zu folgen, wie eine Scheibe auf das Medium im Dropdown kann; in diesem Fall können weitere Maßnahmen ergriffen werden, wie in Schritt 3.6 des Protokolls erklärt.

Neben Gewebe Handhabung um die Integrität zu gewährleisten gibt es auch wichtige Schritte in der IHC-Analyse zu interpretieren, wie die Scheibe der nativen Gewebe ähnelt. Unsere früheren Studie zeigte, dass murine NSCLC-Tumoren ausgeprägte Intra-Tumor räumliche Heterogenität in onkogenen Signalisierung Aktivitäten26aufweisen. Dies bedeutet, dass die Verwendung von räumlich unterschiedliche Gewebe für Steuerelemente Scheiben oder Medikament behandelten Proben zuverlässige experimentelle Dateninterpretation beeinflussen können und daher dicht benachbarte Scheiben als Kontrollen und Proben verwendet werden sollte. Wir weiter gezeigt, dass bei der Vermehrung oder onkogenen Phosphoprotein Ausdruck im frisch geschnittenen unkultiviert 0 h Scheiben waren ähnlich wie in Situ Tumoren, kultivierte Scheiben zeigte veränderte Onkogene Phosphoprotein Ausdruck, speziell veränderten p4EBP1 und pSRC sowie veränderte Verbreitung von Ki67 IHC analysiert. Veränderte p4EBP1 Ausdruck wurde ebenso in 24 h entdeckt menschliche NSCLC und Prostatakrebs schneiden Kulturen (Narhi Et Al., ergänzende Abbildung S3B-S3C, S5 und S7)26. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Vergleich der kultivierten Scheiben mit ihren nächstgelegenen 0 h unkultiviert Slice entscheidend ist für die Erhaltung der in Situ Tumor Funktionen in kultivierten Scheiben zu beurteilen.

Trotz der Verbesserung der Rentabilität des organotypischen Scheiben25, gibt es Einschränkungen mit dem Rotator System in Bezug auf die technischen Details. Die Gewebe-Scheiben auf Titan-Gitter ist schwieriger im Vergleich um zu filtern, Einsätze und eine Inkubation Dreheinheit möglicherweise nicht verfügbar. Als Alternative stagnierende Filter unterstützt können verwendet werden, aber in diesem Fall nur die Luft-exponierten Seite der Scheiben sollte analysiert werden, da Luftfilter-Gradienten in Lebensfähigkeit und Hypoxie gemessen HIF1α Ausdruck schnell im Filter unterstützt Scheibe gebildet werden Kulturen (Davies Et Al., Abbildung 5 und Abbildung 7A-7 b)25. Wir haben ferner gezeigt, dass Tumor Slice Kulturen veränderte Verbreitung und onkogenen Signalisierung Aktivitäten im Vergleich zu ihrer Muttersprache Tumoren26, möglicherweise wegen der Wundheilung Antworten oder metabolische Anpassung der Scheiben zu ex Vivo aufweisen kann Kultur32. Obwohl grob morphologischen Merkmale der murinen NSCLC-Tumoren während 72 h Anbau beibehalten wurden, können Kultur-induzierten proliferative Veränderungen beeinflussen genaue Einstufung der kultivierten Scheiben. Daher sollten Gewebe Scheiben nur für kurzfristige funktionelle Studien genutzt werden.

Verwendung einer rotierenden Inkubation Einheit rettet zumindest teilweise Intra-Slice Lebensfähigkeit oder Biomarker Ausdruck Steigungen, besonders während der ersten 24 Std. Kultur. Sobald auf Integrität und Funktion geprüft, bietet das Gewebematerial für funktionelle Studien, wie z. B. Behandlung Medikamentenstudien. Neben Medikament Antwort Profilierung profitieren veränderte Zielausdruck folgt medikamentöse Behandlung auch Antikörper-Validierung. Dies gilt insbesondere für den Nachweis von murinen Epitope mit Maus monoklonalen Antikörpern, da diese tendenziell hohen Färbung Hintergrund geben. Darüber hinaus sind gut validierte Antikörper erforderlich, um zuverlässige und reproduzierbare Daten in diagnostischen und klinischen Einstellungen zu erreichen. So bietet Modulation der Fülle oder Phosphorylierung des relevanten Epitope nach medikamentöse Behandlung in Geweben Scheiben eine handliche praktische Anwendung in Antikörper-Validierung. Ein großer Vorteil der Tumor Slice Kulturen ist die Fähigkeit, räumlich verteilt Modellfunktionen, einschließlich onkogenen Signalisierung Aktivitäten oder Medikamente im Tumor oder Stromazellen Zellen, wodurch sie eine attraktives ex Vivo Modell. Jedoch Scheiben drehen während des Anbaus und der Prozess der Anbau kann weitere Schäden des Gewebes besonders an den Rändern. Es ist daher genau Overlay die Biomarker-gefärbten IHC Bilder von 0 h-Scheiben mit den nekrotischen Regionen erkannt in kultivierten Scheiben schwierig die beeinträchtigt die Fähigkeit, präzise räumliche Biomarker Aktivitäten verknüpfen, Medikamente. Darüber hinaus sind Tumor-intrinsische, Kultur-induzierte und Medikamenten-induzierten nekrotische Reaktionen zumindest in murinen NSCLC Gewebe Scheiben, Kompromisse bei der genaue Quantifizierung der räumlichen Medikament Antworten zu unterscheiden. Schließlich erlaubt die Verwendung von Tumor Slice Kulturen ein Forscher auf dem Prüfstand mehrere Verbindungen auf den gleichen Tumor ohne eine Notwendigkeit zur Behandlung von Tieren, so zu verfeinern, zu reduzieren und Labor Tierversuche zu ersetzen.

Als zukünftige Anwendung kann das beschriebene Protokoll klinischen solide Tumorproben angenommen werden. Gewebe-Typ-abhängige Änderungen oder Optimierungen sind weitere wahrscheinlich erforderlich, beginnend mit Anpassungen an die Vibratome Einstellungen einschließlich Slice Dicke und Vibration Geschwindigkeit um diesen Tumor Textur oder Steifigkeit zu optimieren. Darüber hinaus variieren die Nährstoff- und Wachstumsfaktor Anforderung für verschiedene Tumorgewebe. Als Beispiel haben Brust Krebs Scheiben mit Insulin in die mittlere13,18ergänzt kultiviert worden. Angesichts der Tatsache, dass begrenzte Gewebematerial während der Operation oder Biopsie vorliegt, kann Optimierung des Patienten abgeleitet Tumor Slice Kulturen schwierig sein, aufgrund von Schwierigkeiten bei der Beschaffung von replizieren Proben in ausreichender Zahl. Reproduzierbarkeit der Daten wird darüber hinaus auch durch herausgefordert ausgesprochen von Patient zu Patient Probe Heterogenität, insbesondere der Anteil der Tumorzellen gegen fibrotische Regionen oder Stromazellen Infiltrate sowie nekrotische Gewebeanteile. Schließlich müsste Anwendung der Tumor Scheiben in Diagnoseeinstellungen Untersuchung über das Ausmaß, welches Medikament Antworten in Scheibe Explantaten der Vorbehandlung Biopsien zur Nachbehandlung in Vivo Antworten entspricht.

Offenlegungen

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Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

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Diese Forschung Arbeit erhielt finanzielle Unterstützung von der Innovative Medicines Initiative gemeinsamen Unternehmens gewähren Vereinbarung no 115188, Universität Helsinki Doctoral Programm in Biomedizin Stipendien (A.S.N.) und Sigrid Juselius und Orion-Farmos Stiftungen (E.W.V.). Wir danken unseren PREDECT Gewebe Slice Plattform Mitglieder des Konsortiums (Taija af Hällström und Siv Knaappila für Unterstützung bei der Einrichtung des Systems Rotator und Riku Turkki für Unterstützung mit der MATLAB-Analyse. Jouko Siro ist bedankte sich für die Erfassung der Abbildung 1-Fotografien. Wir danken dem FIMM WebMicroscope-Team für das Scannen von histologischen, und das Labor Tier Zentrum für Tierhaltung unterstützen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hank' s Balanced salt solution (HBSS)SigmaH6648
Penicillin StreptomycinLösung Thermo Fischer Scientific15140-122
Ham's F-12 mediumThermo Fischer Scientific21765-037
GlukoseVWR101174Y
FBSThermo Fischer Scientific10270-106
Glutamin 200mMThermo Fischer Scientific25030-024
Cyanacrylat-Klebstoff (GLUture)Abbott32046-90-1
Leica VT1200 S Mikrotom mit vibrierender KlingeLeica Biosystems14048142066
SchneideklingeVWRPERS60-0138
TitangitterAlbamma Forschung und EntwicklungMA0036
Inkubation von Schichten EinheitAlbamma Forschung und EntwicklungMD2500
10 cm GewebekulturplatteSarstedt83.1802
24-Well-PlatteSarstedt83.1836
6-Well-PlatteSarstedt83.1839
Neolus InjektionsnadelnTerumo NeolusNN2525R
50 mL FalkenröhrchenGreiner 
PBSLonzaBE17-517Q
FormaldehydFisherF/1501/PB08
Trifold Histo Kassette PapierKrebsdiagnostikDX26280
Histo KassettenVWR720-2199 
KOS Der Mikrowellen-Multifunktions-TaschentuchprozessorMilestone SRLCAT307EN-003
MikrotomThermo Fischer ScientificHM355S
Superfrost Ultra plus ObjektträgerVWR631-0099
BSASigmaA2153
NGSThermo Fischer Scientific16210-064
ZitronensäureSigmaC1909
PT-ModulThermo Fischer ScientificA80400012
Hämatoxylin für H& E-FärbungMerck1.09249.0500
Hämatoxylin zur GegenfärbungDakoS3309
EosinSigmaE4382
NKX2-1 AntikörperAbcamab133638Chargennummer: GR98031-12
pERK 1/2 AntikörperCell Signaling TechnologiesCST 4370Chargennummer: 17
p4EBP1 AntikörperZellsignalisierung TechnologienCST 2855Chargennummer: 20
BrightVision Poly-HRP Ziege Anti-Kaninchen-SekundärantikörperImmunoLogicVWRKDPVR-110HRP
Montage Medicum PertexVWRMEDT41-4021-00
DAB ImmunoLogicVWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235)SelleckchemS1009
Selumetinib (AZD2644)SelleckchemS1008
Pannoramic 250 Objektträger-Scaner3DHISTECH
MATLABMathWorkshttps://se.mathworks.com/ products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER 3DHISTECHhttps://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6Adobehttps://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJImageJhttps://imagej.net/Fiji
CellProfilerCellProfiler Software zur Analyse von Zellbildernhttp://cellprofiler.org/
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Referenzen

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Schlagwörter

Tumor Slice ExplantsPrecision Cut SlicesRotating Incubation UnitTissue Slice PreparationMurine Lung TumorsIntratumor HeterogeneitySlice Thickness OptimizationVibratome SlicingTissue Culture MethodsDrug Response Studies

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