4D-Mikroskopie der Hefe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu charakterisieren, wie Membranfächer sich in lebenden Zellen angehender Hefe bilden und transformieren. Viele intrazelluläre Kompartimente in Hefe sind dynamisch, und ein vollständiges Verständnis ihrer Eigenschaften erfordert Zeitraffer-Bildgebung. Die mehrfarbige 4D-Konfokalfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Verhaltens und der Zusammensetzung eines intrazellulären Fachs auf einer Zeitskala von 5-15 min. Eine strenge Analyse der Fachdynamik erfordert die Erfassung von Tausenden von optischen Bereichen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Photobleaching und Phototoxizität durch schnelles Scannen bei sehr geringer Laserleistung minimiert, und die Pixelabmessungen und Z-Schritt-Intervalle werden auf die größten Werte eingestellt, die mit der Probenahme des Bildes in voller Auflösung kompatibel sind. Die resultierenden 4D-Datensätze sind laut, können aber durch Dekonvolution geglättet werden. Selbst bei qualitativ hochwertigen Daten ist die Analysephase eine Herausforderung, da intrazelluläre Strukturen oft zahlreich, heterogen und mobil sind. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, wurden benutzerdefinierte ImageJ-Plugins in Array-4D-Daten auf einem Computerbildschirm geschrieben, Strukturen von Interesse identifiziert, die Daten bearbeitet, um einzelne Strukturen zu isolieren, die Fluoreszenzzeitkurse zu quantifizieren und Filme der projizierten Z-Stacks zu machen. 4D-Filme sind besonders nützlich, um stabile Kompartimente von transienten Fächern zu unterscheiden, die sich durch Reifung umdrehen. Solche Filme können auch verwendet werden, um Ereignisse wie Die Kompartimentfusion zu charakterisieren und die Auswirkungen bestimmter Mutationen oder anderer Störungen zu testen.

Einleitung

Die Fächer des Endomembransystems befinden sich im ständigen Fluss, und ihre vollständige Charakterisierung erfordert eine Live-Zell-Bildgebung. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die konfokale 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D) verwendet, um fluoreszierend beschriftete Fächer in angehenden Hefen zu visualisieren. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Sekretoreifächer in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae^1,2,3zu verfolgen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf S. cerevisiae, das einen nicht gestapelten Golgi hat, in d....

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Machen Sie nicht fluoreszierendes minimales NSD-Medium². Das Fehlen von Riboflavin wird voraussichtlich die intrazelluläre fluoreszenz und die damit verbundene Phototoxizität im Hintergrund verringern.
2. Wachsen Sie den Hefestamm über Nacht bei 23 °C bis zur logarithmischen Phase in 5 ml NSD in einem 50 ml verwirrten Kolben mit guter Belüftung. Etwa 3-4 h vor der Analyse, verdünnen Sie die Hefekultur in frischem NSD, so dass die endgültige OD₆₀₀ zum Zeitpunkt der Bildgebung 0,5-0,8 betragen wird.
3. Bereiten Sie eine 2 mg/ml Lösung von Concanavalin A (ConA) vor. Auf Wunsch Aliquots dieser Lösung in flüssig....

Ergebnisse

Das hier gegebene Beispiel dokumentiert und quantifiziert die Reifung von zwei Hefe Golgi Zisternen, wie durch zweifarbige 4D konfokale Mikroskopie³visualisiert. Eine Hefezelle enthält in der Größenordnung von 10-15 Golgi-Zisternen, von denen jede über einen Zeitverlauf von ca. 2-4 min reift. Die Reifung kann durch Taggen des frühen Golgi-Markers Vrg4 mit GFP und durch Taggen des späten Golgi-Markers Sec7 mit einem roten Fluoreszenz-Marker sec7 visualisiert werden........

Diskussion

Die konfokale 4D-Bildgebung von Hefeorganellen erfordert eine sorgfältige Abstimmung mehrerer Parameter. Das Hauptanliegen ist Photobleaching und Phototoxizität. Ein typischer 4D-Film beinhaltet das Sammeln von Tausenden von optischen Abschnitten, so dass die Laserbeleuchtung so gering wie möglich gehalten werden muss. Tandem fluoreszierende Protein-Tags können verwendet werden, um das Signal zu steigern, ohne die Expression des markierten Proteins^16,17zu erhöhen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
35 mm Glasbodenschalen Nr. 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Bildgebungsschalen
Concanavalin A Pulver	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8 Konfokalmikroskop	Leica Microsystems
Leica Application Suite X	Leica Microsystems		Software für Mikroskope
Huygens Essential Software, Version 17.04	Scientific Volume Imaging		Dekonvolutionssoftware
ImageJ	NIH		Software für Bildverarbeitung und -analyse