Methodenartikel

4D-Mikroskopie der Hefe

DOI:

10.3791/58618

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28. April 2019

 , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu charakterisieren, wie Membranfächer sich in lebenden Zellen angehender Hefe bilden und transformieren. Viele intrazelluläre Kompartimente in Hefe sind dynamisch, und ein vollständiges Verständnis ihrer Eigenschaften erfordert Zeitraffer-Bildgebung. Die mehrfarbige 4D-Konfokalfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Verhaltens und der Zusammensetzung eines intrazellulären Fachs auf einer Zeitskala von 5-15 min. Eine strenge Analyse der Fachdynamik erfordert die Erfassung von Tausenden von optischen Bereichen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Photobleaching und Phototoxizität durch schnelles Scannen bei sehr geringer Laserleistung minimiert, und die Pixelabmessungen und Z-Schritt-Intervalle werden auf die größten Werte eingestellt, die mit der Probenahme des Bildes in voller Auflösung kompatibel sind. Die resultierenden 4D-Datensätze sind laut, können aber durch Dekonvolution geglättet werden. Selbst bei qualitativ hochwertigen Daten ist die Analysephase eine Herausforderung, da intrazelluläre Strukturen oft zahlreich, heterogen und mobil sind. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, wurden benutzerdefinierte ImageJ-Plugins in Array-4D-Daten auf einem Computerbildschirm geschrieben, Strukturen von Interesse identifiziert, die Daten bearbeitet, um einzelne Strukturen zu isolieren, die Fluoreszenzzeitkurse zu quantifizieren und Filme der projizierten Z-Stacks zu machen. 4D-Filme sind besonders nützlich, um stabile Kompartimente von transienten Fächern zu unterscheiden, die sich durch Reifung umdrehen. Solche Filme können auch verwendet werden, um Ereignisse wie Die Kompartimentfusion zu charakterisieren und die Auswirkungen bestimmter Mutationen oder anderer Störungen zu testen.

Einleitung

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Die Fächer des Endomembransystems befinden sich im ständigen Fluss, und ihre vollständige Charakterisierung erfordert eine Live-Zell-Bildgebung. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die konfokale 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D) verwendet, um fluoreszierend beschriftete Fächer in angehenden Hefen zu visualisieren. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Sekretoreifächer in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae1,2,3zu verfolgen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf S. cerevisiae, das einen nicht gestapelten Golgi hat, in dem die einzelnen Zisternen optisch auflösbar sind4. Die ungewöhnliche Golgi-Organisation in S. cerevisiae ermöglichte die Demonstration durch 4D-Mikroskopie, dass eine Golgi-Zisterne zunächst mit ansässigen frühen Golgi-Proteinen etikettiert und dann diese Proteine verliert, während sie ansässige späte Golgi-Proteine erwirbt3 ,5. Dieser Übergang kann durch die Schaffung eines Stammes visualisiert werden, bei dem das frühe Golgi-Protein Vrg4 mit GFP beschriftet wird, während das späte Golgi-Protein Sec7 mit einem monomeren roten fluoreszierenden Protein gekennzeichnet ist. Wenn einzelne Zisternen verfolgt werden, wird die Reifung als Grün-Rot-Umwandlung3beobachtet. Diese Art der Analyse kann wertvolle Informationen über die Proteinlokalisierung und die Identität des Kompartiments liefern. Beispielsweise können zwei Proteine mit leicht versetzten Ankunfts- und Abfahrtszeiten manchmal verschiedene Fächer in statischen Bildern zu kennzeichnen scheinen, können aber in 4D-Filmen gesehen werden, um dasselbe Fach zu verschiedenen Zeitpunkten zu beschriften6,7 . So zeigt die 4D-Mikroskopie Phänomene auf, die sonst nicht erkennbar wären.

Informative 4D-Mikroskopie von Hefefächern kann mit geeigneten Verfahren und Ausrüstung2erreicht werden. Wann immer möglich, wird fluoreszierende Protein-Tagging durch Genersatz8 durchgeführt, um Überexpressionsartefakte zu vermeiden. Da intrazelluläre Strukturen oft sehr dynamisch sind, ist eine 4D-Bildgebung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine Struktur im Laufe der Zeit zuverlässig nachverfolgt wird. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein laserscannendes Konfokalmikroskop, das mit hochempfindlichen Detektoren ausgestattet ist. Mit diesem Gerät kann das gesamte Zellvolumen von S. cerevisiae durch konfokale Mikroskopie etwa alle 1-3 s abgebildet werden, wobei 2 s Intervalle typisch sind. Die Daten können je nach Beschriftungsdichten der Fluorophore und ihren photophysikalischen Eigenschaften bis zu 5-15 min gesammelt werden. Die Haupthürde ist die Minimierung der Photobleichung. Zu diesem Zweck werden die Laserintensitäten so gering wie möglich gehalten, die konfokale Scangeschwindigkeit maximiert und die optischen Parameter so konfiguriert, dass sie am Nyquist-Grenzwert abbilden, um die relevanten Informationen zu erfassen und gleichzeitig eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. Diese Einstellungen sollen auch die Phototoxizität lindern, ein Faktor, der bei der Live-Zell-Bildgebung oft übersehen wird9,10,11. Die resultierenden lauten Daten werden mit Bleichkorrektur- und Dekonvolutionalgorithmen verarbeitet, um die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten zu erleichtern.

Selbst bei hochwertigen 4D-Filmen ist die Analyse schwierig, da Hefefächer in der Regel zahlreich, heterogen und mobil sind. Aufgrund der intrinsischen Einschränkungen der konfokalen Mikroskopie und der nicht optimalen Einstellungen, die für eine längere 4D-Bildgebung erforderlich sind, sind fluoreszierende Strukturen, die nahe beieinander liegen, schwer zu lösen. Dieses Problem kann umgangen werden, indem man sich auf die geringe Anzahl von fluoreszierenden Strukturen konzentriert, die für die Dauer des Etikettierungszeitraums optisch lösbar bleiben, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Strukturen repräsentativ für die gesamte Population der markierten Fächer. Fluoreszierende Fächer, die zuverlässig nachverfolgt werden können, werden identifiziert, indem Filme von projizierten Z-Stacks angesehen und eine Reihe von Montagen erstellt werden, in denen die optischen Abschnitte für jeden Zeitpunkt auf einem Computerbildschirm angeordnet sind. Diese Analyse verwendet benutzerdefinierte ImageJ12 Plugins, die es ermöglichen, eine individuelle Struktur isoliert nachzuverfolgen.

Jüngste Methoden Papiere behandelt die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen in Hefe13 sowie die Theorie und Praxis der 4D konfokale Bildgebung von Hefezellen2. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die wichtigsten praktischen Aspekte eines 4D-Bildgebungsexperiments. Es enthält einige Verbesserungen an zuvor beschriebenen Verfahren sowie aktualisierte Versionen des ImageJ-Plugin-Codes und der Dokumentation. Das gezeigte Beispiel konzentriert sich auf die Golgi-Dynamik, aber dieses Protokoll eignet sich gleichermaßen für die Abbildung anderer Hefekomden.

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Protokoll

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1. Vorbereitung

  1. Machen Sie nicht fluoreszierendes minimales NSD-Medium2. Das Fehlen von Riboflavin wird voraussichtlich die intrazelluläre fluoreszenz und die damit verbundene Phototoxizität im Hintergrund verringern.
  2. Wachsen Sie den Hefestamm über Nacht bei 23 °C bis zur logarithmischen Phase in 5 ml NSD in einem 50 ml verwirrten Kolben mit guter Belüftung. Etwa 3-4 h vor der Analyse, verdünnen Sie die Hefekultur in frischem NSD, so dass die endgültige OD600 zum Zeitpunkt der Bildgebung 0,5-0,8 betragen wird.
  3. Bereiten Sie eine 2 mg/ml Lösung von Concanavalin A (ConA) vor. Auf Wunsch Aliquots dieser Lösung in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C lagern.
  4. Drehen Sie die ConA-Lösung für 5 min bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge, um Partikel zu entfernen, die die Bildgebung stören können. Dann fügen Sie 250 l des Überstandes zu einer sauberen 35 mm Deckglasbodenmikroskopieschale hinzu. Nach 15 min 2-3 mal mit 2 ml dH2O waschen und trocknen lassen.
  5. Fügen Sie der ConA-beschichteten Schale 250 l der Hefekultur hinzu, warten Sie 10 min, bis die Zellen haften bleiben, und waschen Sie 2-3 Mal mit 2 ml NSD. Bedecken Sie die Zellen mit 2 ml frischem NSD.

2. Imaging

  1. Verwenden Sie eine 63x- oder 100x Öl-Tauchlinse. Eine numerische Blende (NA) von 1,40 ist ausreichend, aber es kann auch ein höheres NA-Objektiv verwendet werden.
  2. Formatieren Sie die Rahmengröße auf 256 x 128 (Breite x Höhe). Wenn eine größere Rahmengröße benötigt wird, wird die Scangeschwindigkeit durch die Erhöhung der Breite nicht verringert, solange das konfokale Mikroskop mit einem Resonanzscanner ausgestattet ist.
  3. Passen Sie den Zoomfaktor so an, dass die Pixelgröße 80 nm beträgt.
  4. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, die in der Regel in der Größenordnung von 8 kHz liegt. Aktivieren Sie das bidirektionale X-Scannen, wenn es verfügbar ist und Kontrollexperimente bestätigen, dass die Scans aus den beiden Richtungen registriert sind.
  5. Legen Sie die Zeilenakkumulation auf 4 oder 6 fest. Achten Sie darauf, Akkumulation (Summierung) anstelle der Mittelung zu verwenden.
  6. Stellen Sie das Loch auf 1.2 Airy-Einheiten ein. Empirisch erfasst diese Einstellung bei der Abbildung lebender Hefezellen mehr Photonen als die Standardauswahl von 1.0 Airy-Einheiten, während sie keinen nennenswerten Auflösungsverlust verursacht.
  7. Legen Sie für jeden Fluoreszenzkanal die Anregungswellenlänge fest, weisen Sie einen Hochempfindlichkeitsdetektor zu, stellen Sie den Emissionswellenlängenbereich ein, und aktivieren Sie den Photonenzählmodus, falls verfügbar. Die Wellenlängenauswahl hängt von den Fluorophoren ab. Als Beispiel, erregen SIE die GFP-Fluoreszenz bei 485 nm und sammeln sie von 495-550 nm, und erregen Sie die mScarlet-Fluoreszenz bei 555 nm und sammeln Sie von 562-625 nm.
  8. Legen Sie die Intensität jedes Lasers so niedrig wie möglich fest. Diese Einstellung muss empirisch bestimmt werden. Eine angemessene Intensität führt zur Erfassung einer lauten, aber interpretierbaren Bildsequenz, wobei das Fluoreszenzsignal bis zum Ende eines 5-min-Films nicht mehr als 50% bleicht. Auf dem hier verwendeten konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) entspricht diese Intensität einer Laserleistungseinstellung in der Größenordnung von 5%.
  9. Verwenden Sie Kerbfilter oder Zeitverzahnung, um zu vermeiden, dass reflektiertes Licht vom Deckschein erfasst wird. Wenn Zeit-Gating verfügbar ist, legen Sie das Gating-Fenster auf 0,6-10,0 ns fest.
  10. Schalten Sie die Lichtfeld-Bildgebung ein und verwenden Sie einen Detektor mit geringer Empfindlichkeit für die Datenerfassung. Legen Sie die Verstärkung auf eine Ebene fest, die die Zellen deutlich sichtbar macht. Verwenden Sie keinen Differential Interferenzkontrast (DIC), da das Prisma die Erfassung zuverlässiger Fluoreszenzdaten beeinträchtigt.
  11. Stellen Sie das Z-Schritt-Intervall auf 0,25-0,35 m ein. Stellen Sie das gesamte Volumen der Hefezellen ab, indem Sie etwa 20-25 optische Abschnitte pro Z-Stack sammeln. Geben Sie die Richtung der Bildgebung so an, dass sich "nach unten" in Richtung des Deckslips bewegt.
  12. Legen Sie für einen typischen Film das Zeitintervall zwischen Z-Stacks auf 2 s fest und stellen Sie die Filmdauer auf 5 bis 10 min. Je nach untersuchtem Fach reduzieren Sie das Intervall, um kürzere Filme mit relativ schneller Dynamik zu machen, oder erhöhen Sie das Intervall, um längere Filme von relativ langsame Dynamik.
  13. Speichern Sie den Film als LIF-Datei mit den Hellfeldbildern im letzten Kanal. Höhere Bittiefen sind in dieser Phase nicht erforderlich, und die Verarbeitungspipeline ist so konfiguriert, dass 8-Bit-TIFF-Daten akzeptiert werden.

3. Dekonvolution

  1. Starten Sie die Dekonvolution-Software (siehe Tabelle der Materialien), mit dem klassischen Maximum Likelihood Estimation-Algorithmus.
  2. Öffnen Sie den in Schritt 2.13 generierten Datensatz. Wählen Sie "Dekonvolution-Assistent". Überprüfen Sie die im "Parameter-Assistenten" angezeigten Werte. Die Bildparameter sollten erkannt und korrekt angezeigt werden. Ändern Sie unter "Refraktive Indizes" den Wert "Embedding med." auf 1,40, um das Hefezytoplasma anzunähern. Wählen Sie unter "coverslip" "Launch editor" und "Estimate position" und "OK", um die Coverslip-Position festzulegen. Wählen Sie "Alle verifiziert enstatten" und "Akzeptieren".
  3. Fahren Sie durch den "Dekonvolution-Assistenten" für jeden Fluoreszenzkanal. Wählen Sie "Manuell" als Modus für die Hintergrundschätzung. Überprüfen Sie das Rohdatenfluoreszenzintensitätsprofil, um einen geschätzten Hintergrundwert zu ermitteln, der in der Regel etwa 0,1 beträgt.
  4. Geben Sie im Menü für die Dekonvolution-Einrichtung den Wert "Maximale Iterationen" von 40 ein und deaktivieren Sie die Bleichkorrektur. Geben Sie einen geschätzten SNR-Wert ein, der in der Regel etwa 5,0 beträgt. Klicken Sie auf "Deconvolve".
  5. Kehren Sie ggf. zur ursprünglichen Datendatei zurück, passen Sie die Hintergrund- und SNR-Werte an, und wiederholen Sie die Dekonvolution, bis das Rauschen ausreichend entfernt wird, ohne die tatsächliche Fluoreszenz von dämmernden Strukturen zu beseitigen.
  6. Verschmelzen Sie die hellen Undfeld- und Dekonvolid-Fluoreszenzkanäle. Ordnen Sie für nachfolgende Filmbearbeitungsschritte in ImageJ die Kanäle so an, dass Rot zuerst, Grün (falls vorhanden) als nächstes, blau (falls vorhanden) als nächstes und hellfeld als letztes ist. Speichern Sie die Bildsequenz als 8-Bit-TIFF-Datei.

4. Bleichkorrektur und Filmgenerierung

  1. Importieren Sie die dekonvolvede Bildsequenz in ImageJ, und konvertieren Sie sie in einen Hyperstack, indem Sie Bild > Hyperstacks > Stapeln in Hyperstack auswählen. Wählen Sie "xyzct" aus dem Dropdown-Menü, und füllen Sie die Anzahl der Kanäle, Z-Stack-Slices und Zeitrahmen (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle teilen.
  3. Korrigieren Sie die Fluoreszenzkanäle für photobleaching mit dem ImageJ-Plugin, das von http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector verfügbar ist. Sobald dieses Plugin heruntergeladen und installiert wurde, wählen Sie Plugins > EMBLtools > Bleach Correction. Wählen Sie "Exponential Fit".
  4. Um die hellfeld- und bleichkorrigierten Fluoreszenzkanäle zu einem Hyperstack zusammenzuführen, wählen Sie Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen. Speichern Sie den resultierenden Hyperstack als 8-Bit-TIFF-Datei.
  5. Installieren Sie die benutzerdefinierten ImageJ-Plugins, die mit diesem Protokoll bereitgestellt werden. Befolgen Sie die Anweisungen im Begleitdokument, um die Bildsequenz anzuzeigen, zu bearbeiten und zu quantifizieren und einen fertigen Film der projizierten Z-Stacks zu erstellen.

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Ergebnisse

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Das hier gegebene Beispiel dokumentiert und quantifiziert die Reifung von zwei Hefe Golgi Zisternen, wie durch zweifarbige 4D konfokale Mikroskopie3visualisiert. Eine Hefezelle enthält in der Größenordnung von 10-15 Golgi-Zisternen, von denen jede über einen Zeitverlauf von ca. 2-4 min reift. Die Reifung kann durch Taggen des frühen Golgi-Markers Vrg4 mit GFP und durch Taggen des späten Golgi-Markers Sec7 mit einem roten Fluoreszenz-Marker sec7 visualisiert werden....

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Diskussion

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Die konfokale 4D-Bildgebung von Hefeorganellen erfordert eine sorgfältige Abstimmung mehrerer Parameter. Das Hauptanliegen ist Photobleaching und Phototoxizität. Ein typischer 4D-Film beinhaltet das Sammeln von Tausenden von optischen Abschnitten, so dass die Laserbeleuchtung so gering wie möglich gehalten werden muss. Tandem fluoreszierende Protein-Tags können verwendet werden, um das Signal zu steigern, ohne die Expression des markierten Proteins16,17zu erhöhen...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01 GM104010 unterstützt. Vielen Dank für die Unterstützung bei der Fluoreszenzmikroskopie an Vytas Bindokas und Christine Labno in der Integrated Microscopy Core Facility, die vom NIH-finanzierten Cancer Center Support Grant P30 CA014599 unterstützt wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm Glasbodenschalen Nr. 1.5MatTekP35G-0.170-14-CBildgebungsschalen
Concanavalin A PulverSigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Leica SP8 KonfokalmikroskopLeica Microsystems
Leica Application Suite X Leica MicrosystemsSoftware für Mikroskope
Huygens Essential Software, Version 17.04Scientific Volume ImagingDekonvolutionssoftware
ImageJNIHSoftware für Bildverarbeitung und -analyse

Referenzen

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