Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Summary

Dieser Artikel bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von vielschichtigen Stammzell-Blätter mit günstigen Stammzell-Eigenschaft.

Abstract

Stammzell-Therapie zeigt eine viel versprechende Zukunft bei der Regeneration von verletzten Organ und Gewebe, und die Zelle-Blatt-Technik wurde entwickelt, um die niedrigen Zelle Aufbewahrung und Armen überleben innerhalb der Zielzone zu verbessern. Während des Bauprozesses in Vitro ist eine Lösung für die Aufrechterhaltung der Stammzelle Bioaktivität und Erhöhung der Zelle innerhalb der Zelle Blatt jedoch dringend erforderlich. Dieses Protokoll stellt eine Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale Bedienbarkeit. Decellularized porcinen Perikard (DPP) wird vorbereitet, indem Phospholipase₂ (PLA₂) Decellularization Methode als die Zelle Blatt Gerüst und Ratte Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind isoliert und als die gesetzten Zellen erweitert. Die temporäre vielschichtigen Zellstruktur Blatt mit RAD16 konstruiert ist-ich Peptid Hydrogel. Schließlich Zelle Blatt ist mit einem dynamischen Perfusion System zu stabilisieren die dreidimensionale (3D) Struktur kultiviert, und die Zelle Blatt konnte nach einer 48-Stunden-Kultur in Vitroabgerufen werden. Dieses Protokoll bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von einem vielschichtigen Stammzell-Blatt und das Blatt Zelle in der Zukunft als günstige Stammzell-Therapie Produkt entwickelt werden könnte.

Introduction

Stammzell-Therapie als eine wirksame Behandlung für viele Krankheiten berichtet; niedrige Zelle Retention und Armen überleben innerhalb der Zielzone bleiben jedoch kritische Fragen nach der traditionellen Stammzell-Injektion. Um dieses Problem zu lösen, entwickelte Gewebe-engineering-Wissenschaftler die Zelle Blatt Technik. Eine monolayered Zelle Blatt mit intakten extrazelluläre Matrix war zunächst mithilfe der Temperatur-Antwort Kultur Gericht¹vorbereitet, und seine Follow-up Studien berichtet die signifikanten Verbesserungen der Stammzellen Aufbewahrung und Überleben in das infarzierte Bereich^2,3. Unter den Methoden Bau der vielschichtigen Zelle Blatt als eine wirksame Strategie zur Verbesserung der Zelle überleben und die Zelle Blatt therapeutische Wirkung^3,4berichtet. Seitdem haben Wissenschaftler gearbeitet, auf andere Zelle Blatt Bauweisen zu entwickeln, um die Zelle Höhe, Stammzell-Eigenschaft und mechanischen Eigenschaften der Zelle Blätter erhöhen. So weit, bestimmte Arten von Zelle Blatt wurden konstruiert und studierte bei der Behandlung von Herzinfarkt⁵, Knorpel Verletzung⁶, und Haut Wunde⁷.

Die Bioaktivität der Stammzellen vor der Transplantation zeigten einen aufstrebenden Einfluss auf die Regeneration des verletzten Gewebes, und andere Zelle Blatt Bau Strategien haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Stammzellen. Auf der einen Seite konfluierende Zelle Blätter bestand nur aus High-Density-Stammzellen, und natürliche extrazelluläre Matrizen konnte durch Stapeln monolayered Zelle Blätter⁸ oder mithilfe magnetischer Tissue engineering Techniken⁹erworben werden. Auf der anderen Seite entwickelten die Forscher verschiedene Gerüste um ausreichende mechanische Festigkeit und Unterstützung Zelle Wachstum^10,11,12, ermöglichte eine niedrige Stammzelle Aussaat Dichte um die Ernährung zu gewährleisten liefern. Die niedrigen effizienten Nährstoffversorgung innerhalb der vielschichtigen Zellstruktur Blatt bleibt jedoch trotz dieser Ansätze ein Hauptanliegen beim in-vitro- Bau. Eine effiziente und praktikable Zelle Blatt Bausystem ist daher dringend erforderlich.

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um ein Multilayeredmesenchymal Stammzellen (MSC) Zelle Blatt vorbereiten. In diesem Bausystem bietet ein DPP die Zelle Blatt mechanische Festigkeit. Basierend auf diesem Gerüst, die 3D Zellstruktur kann schnell aufgebaut werden mit RAD16-ich Peptid Hydrogel und eine dynamische Perfusion System wird verwendet, um die Kultur der vielschichtigen Zelle Blatt, um die 3D Blatt Zellstruktur stabilisieren und für eine ausreichende Ernährung Versorgung der Zellen. Mit diesem System, ein vielschichtiges BMSC Blatt wurde erfolgreich erstellt und einen optimalen therapeutischen Effekt auf die Ratte Myokardinfarkt Modell¹³ausgestellt.

Protocol

Alle Stammzellen und Tierversuch Verfahren wurden nach den ethischen Richtlinien des nationalen Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und durch die Jinan Universität Animal Care and Use Committee (Guangzhou, China) genehmigt.

1. Vorbereitung des DPP-Gerüst mit PLA₂ Decellularization Methode¹⁴

Hinweis: Siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung des PLA₂ Decellularization Methode.

1. 100 mL 200 U/mL PLA₂ Lösung vorzubereiten. 0,5 g Natrium-Deoxycholate und 2 mL PLA₂ in 198 mL Pufferlösung Carbonat hinzufügen. Diese Lösung sollte innerhalb von 24 h nach der Zubereitung verwendet werden.
2. Erhalten Sie frische porcinen Perikardium (FPP) aus dem Schlachthaus und an das Labor innerhalb von 1 h zurück.
   Hinweis: Die FPP ist bei 4 ° C während des Transports aufzubewahren. Schritte 1.2-1.10 sollten durchgeführt werden, mit kontinuierlichen schütteln in einem Wasserbad mit Thermostat gesteuert.
3. Gründlich waschen die FPP mit 200 mL Phosphat-Pufferlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin in einen 500-mL-Becherglas 10 ° Cfür 10 min. Schritt 2 X wiederholen.
4. Die FPP in zwei Ebenen aufgeteilt und das Fettgewebe mit Zange und Schere zu entfernen.
   Hinweis: Halten Sie der FPP nass durch Zugabe von 50 mL PBS alle 20 Minuten während der Entfernung des Fettgewebes.
5. Formen Sie die FPP in 10 x 10 cm² Stück mit einer Schere. Waschen Sie die FPP mit 200 mL Pufferlösung Carbonat (CBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin in einen 500-mL-Becherglas bei 10 ° C für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.
6. Übertragen Sie die FPP zu reinem Wasser und genießen Sie es bei 10° C für 12 h.
7. Einweichen Sie die 10 x 10 cm² Proben in 50 mL von CBS mit 200 U/mL PLA₂ und 0,5 % (w/V) Natrium-Deoxycholate-Lösung bei 37 ° C für 6 Stunden.
8. Waschen Sie den Proben mit CBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin bei 10 ° C für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.
9. Einweichen Sie jede Probe in 50 mL von CBS mit 200 U/mL PLA₂ und 0,5 % (w/V) Natrium-Deoxycholate-Lösung bei 37 ° C für 2 Stunden.
10. Waschen Sie Proben mit CBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin bei 10 ° C für 2 h wiederholen Sie diesen Schritt für 10 X mindestens. Legen Sie die Proben auf flache Teller und trocknen Sie sie zur Gewichtskonstanz in eine Konstante Temperatur Backofen bei 55 ° C.
    Hinweis: Das Beispiel muss vollständig getrocknet werden. Wägen Sie die DPP-Probe alle 10 Minuten und wiederholen, 3 x oder bis das Gewicht nicht mehr ändert.
11. Gestalten Sie jede DPP-Probe in einen Durchmesser von 10,5 mm Kreis mit einer Trephine. Packen Sie jede DPP in einem sterilen versiegelten Beutel.
12. Sterilisieren Sie die DPP Proben durch Gammastrahlung (25 kGy). Die DPP-Proben bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert.
    Hinweis: Alle Proben können bis zu sechs Monate bei 4 ° c gelagert werden

(2) die Vorbereitungen für die Zelle Blatt Bau

1. Autoklav alle Instrumente und Gewebe Trägerkomponenten bei 121 ° C für 30 min, einschließlich 1,5 mL zentrifugale Röhren, Zangen, Pinzetten, Scheren, gezahnten schwarze Basen (trägerbauteil Gewebe) und weiße Spannringe (trägerbauteil Gewebe).
2. Bereiten Sie 20 mL 10 % Saccharose-Lösung keimfrei. Gewicht 2 g Saccharose und löst die Saccharose in 18 mL Reinstwasser. Autoklaven die 10 % Saccharoselösung bei 121 ° C für 30 min oder Filter die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter.
3. Autoklaven der dynamische Perfusion Systemgeräte bei 121 ° C für 30 min, einschließlich eine Gas austauschen, Ausrüstung, eine 500 mL-Glasflasche, Perfusion Kultur Container und die verbindenden Rohre.
4. Bereiten Sie die Instrumente autoklaviert und Gewebe Trägerkomponenten. Setzen Sie das schwarzen Basisteil des Trägers Gewebe in der Kulturschale.
5. Eine getrocknete DPP-Gerüst holen Sie ab und legen Sie es in der Mitte des schwarzen Sockel. Das DPP-Gerüst eine weiße Spannring anziehen und im Gewebe Träger befestigen.
   Hinweis: Stellen Sie sicher das Gerüst ist total fest im Gewebe Träger und es gibt keine Lücke zwischen Schwarzen und den weißen Spannring. Ist dies nicht der Fall, die Gewebe-Träger zu trennen und das Gerüst wieder zu beheben.
6. 100 µL Kulturmedium auf der DPP-Gerüst für die Rehydratation hinzufügen.
   Hinweis: Wenn das Gerüst nicht gut im Gewebe Träger fixiert ist, wird das Nährmedium der Kulturschale infiltrieren.
7. Genommen Sie das Gerüst in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sie es 15 Minuten einweichen lassen.

3. Vorbereitung der Zellen für Zelle Blatt Bau

Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Zellkultur mit einer 100 mm Schale. Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Darstellung des den Bau der vielschichtigen Zellstruktur.

1. BMSCs¹³zu isolieren.
   Hinweis: Diese Methode ist für den Bau von einem vielschichtigen MSC Zelle Blatt vorgesehen. Ratte BMSCs werden in diesem Protokoll verwendet. Die BMSCs sind mit die ganze Knochenmark anhaftende Methode isoliert, und die BMSCs sind erweiterte in Vitro genügend Zelle zu erhalten.
   1. Autoklaven der Instrumente bei 121 ° C für 30 min, einschließlich Zangen, gezahnten Zangen und Scheren. Bereiten Sie eine 2 mL Injektionsspritze und BMSC Kulturmedium (Dulbeccos modifiziert Adlers Medium [DMEM] fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin).
   2. Die drei Wochen alten männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten von Halswirbel Verrenkung einschläfern. Das Tier in 100 mL 75 % Alkohol-Lösung in ein Becherglas für 5 Minuten einweichen.
   3. Nehmen Sie das Tier aus den Becher und anfällig auf dem OP-Tisch. Einschneiden der Haut auf dem Rücken des Tieres mit Schere und Pinzette. Isolieren Sie die Haut und Muskel Gewebe um die Oberschenkel Oberschenkelknochen verfügbar zu machen.
   4. Isolieren der Oberschenkel Oberschenkelknochen und legen Sie es in 30 mL PBS in einer 50 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie zwei Oberschenkel Oberschenkelknochen in eine Röhre. Vortex Zentrifugenröhrchen, das Gewebe gründlich zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.
   5. Geschnitten Sie beide Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere und setzen Sie den Knochenmark Hohlraum.
   6. Aspirieren Sie 2 mL Kulturmedium BMSC mit einer Injektionsspritze. Stechen Sie die Nadel in den Hohlraum des Knochenmarks und spülen Sie das Knochenmark mit Nährmedium. Spülen Sie alle zwei Oberschenkel Oberschenkelknochen in einer Kulturschale von 100 mm.
   7. Hinzugeben Sie für jede 100 mm Kulturschale 2 mL Kulturmedium in der Kulturschale. Setzen Sie die Kulturschale in die 37 ° C Inkubator und statische Kultur für 72 h.
   8. Herausnehmen der Kulturschale aus dem Inkubator. Den Überstand mit 6 mL frisches Nährmedium zu ersetzen.
   9. Primäre BMSCs unter dem Mikroskop zu beobachten. Im Anschluss daran Durchgang der BMSCs jeden 5-7-d.
2. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und wählen Sie geeignete Zellen für Zelle Blatt Bau. Wenn die BMSCs 80 % - 90 % Zusammenfluss erreichen, können die Zellen als die gesetzten Zellen gewählt werden.
3. Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Kulturschale. Vorsichtig waschen der Zellen mit 2 mL warmen PBS. Entfernen Sie alle PBS aus der Kulturschale und machen Sie sicher nicht flüssig bleibt. 2 mL 0,25 % Trypsin (oder eine andere Trennendem Lösung) in die Schale hinzufügen und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.
4. Die Trypsin-Wirkung durch Zugabe von 2 mL Kulturmedium zu stoppen, und vorsichtig waschen der Zellen aus der Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 15 mL Zentrifugenröhrchen. Entmischen der Zellen bei 225 X g für 5 Minuten.
5. Den überstand zu entfernen. Die Zellen mit 3 mL 10 % (w/V) Saccharoselösung aufzuwirbeln.
   Hinweis: 10 % (w/V) Saccharoselösung wird verwendet um die Zellen zu waschen um eine einheitliche Zelle-Hydrogel-Mischung in den folgenden Schritten zu erhalten.
6. Aspirieren Sie 10 µL Zellsuspension und zählen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer. Berechnen Sie das Volumen für den nächsten Schritt benötigt. Für eine Zelle-Blatt sind 3 Millionen BMSCs verwendet.
7. 3 Millionen Zellen zu extrahieren und in einem neuen 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 225 X g für 5 min.
8. Den überstand zu entfernen. Die Zellen mit 1 mL 10 % (w/V) Saccharoselösung aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
   Hinweis: Mit einer zentrifugalen 1,5 mL-Tube ist vorteilhaft für die Vorbereitung der Zelle-Hydrogel-Mischung.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 260 Xg , für 5 min. ganz herauszudrehen überstand und die Zelle Sediment erhalten.

4. Vorbereitung der BMSCs und der RAD16-ich Peptid Hydrogel Mischung

Hinweis: Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Darstellung des den Bau der vielschichtigen Zellstruktur.

1. Die zentrifugale 1,5 mL-Tube 20 µL 10 % (w/V) Saccharoselösung hinzufügen. Sanft Aufschwemmen Sie der BMSCs und erhalten Sie eine homogene Suspension zu.
   Hinweis: Erzeugen Sie keine Bläschen während der Wiederfreisetzung.
2. Fügen Sie 20 µL des RAD16-ich Peptid Hydrogel an der Spitze der Suspension. Rühren Sie leicht die RAD16-ich Peptid und Zelle Federung mit der Pipettenspitze. Wenn die Zellsuspension und Hydrogel miteinander vermischt sind, pipette vorsichtig der Mischung ein paar Mal.
3. Nehmen Sie das DPP-Gerüst aus dem Gewebe-Träger und Aspirieren Sie sanft das Kulturmedium mit einer PIPETTENSPITZE.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die DPP-Gerüst vollständig rehydriert ist, bevor Sie die Zelle-Hydrogel-Mischung hinzufügen.
4. Aspirieren Sie die Mischung und fügen Sie es gleichmäßig auf der DPP-Gerüst.
   Hinweis: Das Gesamtvolumen der Mischung wäre etwa 40-50 µL. Es empfiehlt sich, die Mischung 10 µL jeweils von der Mitte an der Außenseite des Gerüstes hinzufügen.
5. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium auf den Grund des Trägers Gewebe. Legen Sie die Zelle Blatt im Inkubator 37 ° C für 5 Minuten.
6. Nehmen Sie die Zelle Blatt aus dem Inkubator. Sanft fügen Sie 4 mL Kulturmedium in der Kulturschale und Tauchen Sie die Zelle Blatt. Legen Sie die Zelle Blatt im 37 ° C Inkubator für 2 h statische Kultur.

5. in-vitro- Kultur aus einem 3D vielschichtigen Zelle Blatt mit einem dynamischen Kultursystem

Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des dynamischen 3D-System.

1. Bereiten Sie das dynamische Perfusion System, einschließlich einer peristaltischen Pumpe, Gasgeräte Austausch, eine 500 mL-Glasflasche, Perfusion Kultur Container und den verbindenden Rohren. Montieren Sie das dynamische Perfusion System, wie in Abbildung 2dargestellt.
2. Die sterile Glasflasche 200 mL Kulturmedium hinzufügen. Legen Sie die Zelle Blatt in der Kammer des Behälters Kultur.
   Hinweis: Achten Sie auf die Richtung der oberen Oberfläche des Blattes Zelle.
3. Fügen Sie 3 mL Kulturmedium im Gewebe Container hinzu, und schließen Sie den Container. Die dynamische Perfusion System im Inkubator und einschalten Sie die Pumpe. Inmitten des Durchfluss der peristaltischen Pumpe 8 mL/min. Kultur der Zelle Blatt das dynamische Perfusion System für 48 h.

6. Erhalt der vielschichtigen MSC Zelle Blatt

1. Autoklaven der Instrumente und Gewebe Trägerkomponenten bei 121 ° C für 30 min, einschließlich 1,5 mL zentrifugale Röhren, Zange und gezahnten Zangen.
2. Ziehen Sie den Eingang Kanal aus der Glasflasche, die Lieferung von Kulturmedium in den Container zu stoppen.
   Hinweis: Beenden der peristaltischen Pumpe, wenn der Kultur-Behälter leer ist.
3. Nehmen Sie die Zelle Blatt aus dem Kultur-Container und steckte es in eine Kulturschale.
4. Verwenden Sie eine Zange zu immobilisieren den Gewebe-Träger und ein anderes gezahnte Pinzette verwenden, um den weißen Spannring aus dem schwarzen Sockel trennen. Schließlich erhalten Sie die vielschichtige BMSCs Zelle Blatt.
5. Für kurze Konservierung kann jede Zelle Blatt auf eine zentrifugale 1,5 mL-Tube mit der Zange übertragen werden. DPP-Gerüst sollte an der Innenwand des zentrifugalen Rohres angebracht werden, und das Blatt Zelle verbreiten sollte, so viel wie möglich in die Zentrifugenröhrchen.
6. Fügen Sie sanft 1 mL Kulturmedium in der zentrifugalen Röhre, die Zelle Blatt einzutauchen. Verschließen Sie die Kappe der zentrifugalen Röhre und speichern Sie die Zelle Blatt bei 4 ° C.
   Hinweis: Die Zelle Blatt sollte transplantiert oder schnellstmöglich analysiert. Es wird empfohlen, die Zelle Blatt innerhalb von 4 Stunden zu verwenden.

Results

Die schematische Darstellung der vielschichtigen Stammzell-Blatt Bau ist in Abbildung 1dargestellt. Vorbereitung der Zelle Blatt Gerüst von der PLA-₂ -Decellularization-Methode ist der erste Schritt. Basierend auf dem Schafott, entsteht eine temporäre 3D Zellstruktur durch Mischen der Stammzellen mit der RAD16-1-Peptid-Hydrogel. Um ein vielschichtiges Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale mechanische Festigkeit zu erhalten...

Discussion

Dieses Protokoll meldet eine effiziente Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen MSC-Blatt. Dieses Blatt Zelle weist optimale mechanische Festigkeit, hohe Zelldichte seeding und günstige Stammzellen Bioaktivität. Mit BMSCs als ein Beispiel, die 3D Zellstruktur ist schnell aufgebaut mit RAD16-ich Peptid Hydrogel. Nach in das dynamische Perfusion System kultiviert wird, erhält man das vielschichtige BMSC Blatt erfolgreich und die BMSCs pflegen eine hohe Expression der Stammzell-Marker.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phospholipase A2	Sigma-Aldrich	P6534
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Phosphatpuffer	Gibco BRL	89033
Penicillin Streptomycin / Amphotericin	Gibco BRL	15640055
Puffer Bikarbonat	Sigma-Aldrich	C3041
Tischkonzentrator	Changzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-014-CVR
Südamerikanisches fötales Rinderserum	Gibco BRL	10270-106/P30-3302
L-Glutamin	Corning Cellgro	25-005-CI
0,25 % Trypsin/2,21 mM EDTA	Corning Cellgro	25-053-CI
Biosicherheitswerkbank	Esco,Singapur	AC2-2S1
Inkubator mit konstanter Temperatur	Esco, Singapur	CLS-170B-8
Zentrifugenröhrchen	Corning	430790
EP Röhrchen	Axygen	31617934
Zentrifugalmaschine	TOMOS	1-16R
Saccharose	Sigma-Aldrich	S9378-500G
Pura Matrix	BD	354250
Dynamisches Perfusionskultursystem	Minucells und Minutissue	D-93077
Schlauchpumpe	Ismatec	IPC N8
Pumpenschlauch	Ismatec	Nr.1306
MINUSHEET 1300		Regensburger	Gewebeträgerkomponenten
MINUSHEET	Regensburg		dynamisches Perfusionssystem
MINUSHEET 0006	Regensburg		Gasaustauschausrüstung
MINUSHEET 0002	Regensburg		500 mL Glasflasche
MINUSHEET 1301			Behälter für Perfusionskultur