Methodenartikel

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

DOI:

10.3791/58646

⸱

6. März 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantitative Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptor (KIR) halbautomatische Eingabe (qKAT) ist eine einfache, hohem Durchsatz und kostengünstige Methode zur Nummer Typ KIR -Gene für ihre Anwendung in Bevölkerung und Krankheit Assoziationsstudien zu kopieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptoren (KIR) sind eine Reihe von hemmende und aktivierende immun Rezeptoren auf natürlichen Killer (NK) und T-Zellen, die durch eine polymorphe Cluster von Genen auf Chromosom 19 kodiert. Ihre besten charakterisierten Liganden sind die humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Moleküle, die in großen Histocompatibility complex (MHC) Locus auf Chromosom 6 kodiert sind. Es gibt deutliche Hinweise, dass sie eine bedeutende in der Immunität, Reproduktion und Transplantation Rolle, macht es wichtig, Techniken zu haben, die genau Genotyp kann ihnen. High-Sequenzhomologie, sowie Allele und Kopie Nummer Variation, erschweren jedoch es Design-Methoden, die präzise und effizient Genotyp alle KIR -Gene. Traditionelle Methoden sind in der Regel in die Auflösung der gewonnenen Daten, Durchsatz, Wirtschaftlichkeit und der Zeitaufwand für die Einrichtung und Betreuung der Versuche begrenzt. Wir beschreiben eine Methode namens quantitative KIR halbautomatische Eingabe (qKAT), das ist eine Hochdurchsatz-multiplex Real-Time Polymerase Kettenreaktion-Methode, die die gen Heftnummern für alle Gene in der KIR -Locus bestimmen kann. qKAT ist eine einfache Hochdurchsatz-Methode, die KIR Kopie Nummer Feindaten, bereitstellen kann, die weiter verwendet werden können, um die Variationen in der strukturell polymorphen Haplotypen abzuleiten, die sie umfassen. Diese Kopie Zahl und Haplotyp Daten können für Studien über groß angelegte Krankheit Verbände, Populationsgenetik sowie Untersuchungen zur Expression und funktionelle Wechselwirkungen zwischen KIR und HLAvorteilhaft.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bei Menschen, die killer Immunoglobulin-Like-Rezeptor(KIR) Locus auf dem langen Arm von Chromosom 19 innerhalb der Leukozyten Rezeptor-Komplex (LRC) zugeordnet ist. Dieser Locus ist etwa 150 kb in der Länge und umfasst 15 KIR Gene angeordnet Head-to-Tail. Die KIR -Loci, die derzeit bekannt sind sind KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, und zwei Pseudogene, KIR2DP1 und KIR3DP1. Die KIR -Gene kodieren für zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Immunglobulin-ähnliche Domäne Rezeptoren mit kurzen (S; aktivieren) oder lang (L; hemmenden) zytoplasmatischen Endstücke, die durch natürliche Killerzellen (NK) und Teilmengen von T ausgedrückt werden Zellen. Copy Number Variation ausgestellt in der KIR -Locus-Formularen vielfältige Haplotypen mit variabler gen Inhalt1. Non-Allele homologe Rekombination (NAHR), erleichtert durch eine enge Head-to-Tail gen Anordnung und hohe Sequenzhomologie ist der Mechanismus vorgeschlagen, für die Variabilität der Haplotypic verantwortlich. Mehr als 100 verschiedenen Haplotypen wurden in Populationen weltweit1,2,3,4beschrieben. Diese Haplotypen konnte in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: A und B Haplotypen. Die A-Haplotyp enthält 7 KIR -Gene: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1und KIR3DL2, die inhibitorische KIR -Gene und die aktivierende KIR sind gen KIR2DS4. Bis zu 70 % der Europäischen stammende Personen, die homozygot für KIR Haplotyp A ausschließlich tragen jedoch eine nicht-funktionale "Löschung" Form der KIR2DS45,6. Alle anderen KIR -gen-Kombinationen bilden Gruppe B Haplotypen, darunter mindestens eine der spezifischen KIR Gene KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, und KIR2DL5, und in der Regel zwei oder mehr aktivierenden KIR -Gene enthalten.

HLA Klasse I Moleküle wurden identifiziert als Liganden für bestimmte hemmende Rezeptoren (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3und KIR3DL1), aktivierenden Rezeptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, und KIR3DS1), und für KIR2DL4, das ist eine einzigartige KIR , die enthält eine lange zytoplasmatischen Schwänzen wie andere hemmenden KIR-Rezeptoren, sondern hat auch einen positiv geladenen Rest in der Nähe der extrazellulären Domäne ist eine gemeinsame Funktion von anderen aktivierenden KIR -Rezeptoren. Die Kombination von Varianten innerhalb der KIR-Gene und die HLA-Gene beeinflusst Rezeptor Liganden Interaktion dieser Formen möglicher NK Zelle Reaktionsfähigkeit auf der individuellen Ebene7,-8. Nachweis von genetischen Assoziationsstudien hat angedeutet, dass KIR in virale Resistenz (z. B.., humanen Immundefizienz-Virus [HIV]9 und Hepatitis C-Virus [HCV]10) eine Rolle spielt den Erfolg der Transplantation 11, das Risiko einer Schwangerschaft Störungen und Fortpflanzungserfolg12,13, der Schutz vor Rückfall nach allogenen hämatopoetischen Stammzellen Transplantation (HSCT)14,15, 16und das Risiko von Krebserkrankungen17.

Die Kombination von hohen Sequenzhomologie und Allele und Haplotypic Vielfalt präsentiert Herausforderungen in der Aufgabe genau Genotypisierung KIR -Gene. Konventionelle Methoden der KIR -Gene geben zählen Sequenz-spezifische Primer (SSP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18,19,20, Sequenz-spezifische Oligonukleotid Sonden (SSOP) PCR21, und Matrix assisted Laser desorption Ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)22. Die Nachteile dieser Techniken sind, dass sie nur teilweise Einblick in das Erbgut einer Person zwar auch mühsam zu führen. Vor kurzem wurde Next Generation Sequencing (NGS) angewandt, um die KIR -Locus speziell zu geben. Während diese Methode sehr mächtig ist, kann es teuer sein, und es ist zeitaufwendig, eingehende Analyse und Daten-Kontrollen durchzuführen.

qKAT ist eine Hochdurchsatz-quantitative PCR-Methode. Während herkömmliche Methoden mühsam und zeitaufwändig sind, diese Methode macht es möglich, fast 1.000 genomische DNA (gDNA) Proben in fünf Tagen ausgeführt und gibt die KIR -Genotyp sowie die Kopienzahl gen. qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen, von die jede zwei KIR Loci richtet und ein Referenz-gen einer festen Kopie Zahl in das Genom (STAT6) verwendet für die relative Quantifizierung des Gens KIR kopieren Nummer23. Dieser Test wurde erfolgreich eingesetzt in Studien, bei denen große Population Panels und Krankheit Kohorten auf Infektionskrankheiten wie HCV, autoimmune Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und Schwangerschaft Störungen wie Präeklampsie, sowie eine genetische zugrunde liegenden Studien, die darauf abzielen, die NK Zelle Funktion1,4,24,25,26zu verstehen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung und Beschichtung aus DNA

  1. Die gDNA-Konzentration mit einem spektralfotometrische oder fluorometrisch Instrument genau zu quantifizieren.
  2. Verdünnen Sie DNA um 4 ng/µL auf einer 96-Well Deep-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Kontrollprobe gDNA mit bekannten Ausfertigung eine eigene Nummer und einem nicht-Template-Kontrolle.
  3. Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten bei 450 X g für 2 min.
  4. Mit einem Instrument Handhabung von Flüssigkeiten jeder Probe in vervierfacht auf qPCR 384-Well-Platten zu verzichten, so dass jeder gut 10 ng DNA (2,5 µL/Well). Bereiten Sie mindestens zehn 384-Well-Platten, eine für jede qKAT Reaktion.
  5. Wenn gDNA von mehr als einer 96-Well-Platte verzichtet wird ist, führen Sie eine vollständige Volume-waschen mit 2 % Bleichmittel und Reinstwasser, reinigen Sie die Nadeln der Flüssigkeit Handlingsystem zwischen einzelnen 96-Well-Platte von gDNA Proben.
  6. Trocknen Sie die DNA durch Inkubation der 384-Well-Platten in einem sauberen Bereich bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden.

2. Vorbereitung der Primer und Sonden

Hinweis: qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen. Jede Reaktion umfasst drei Grundierung Paare und drei Fluoreszenz-markierten Sonden, die zwei KIR -Gene und eine Referenz-gen gezielt verstärken. Die Sonden, die in Jiang Et Al.27 veröffentlicht wurden wurden geändert, sodass die Oligonucleotides jetzt mit ATTO-Farbstoffen beschriftet werden, da sie verbesserten Photostabilität und langes Signal Lebenszeiten bieten. Pre-regelmÄÑig Grundierung Kombinationen sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Bereiten Sie Primer-Kombinationen für jede Reaktion gemäß den in Tabelle 1angegebenen Verdünnungen vor.
  2. Bereiten Sie die Sonde Kombinationen für jede Reaktion gemäß Tabelle 1. Jede einzelne Sonde vor der Herstellung der Verbindung zu testen.

3. Vorbereitung des Master-Mix

Hinweis Die unten genannten Mengen sind für die Durchführung einer qKAT Reaktion auf eine Reihe von 10 x 384-Well Platten.

  1. Sicherstellen Sie, dass die gDNA Proben auf 384-Well-Platten beschichtet vollständig trocken sind. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis und halten Sie die Reagenzien von möglichst viel Lichteinfall, da die Fluoreszenz-markierten Sonden Foto und thermosensible sind bedeckt.
  2. Auftauen der qPCR Puffer, Primer und Sonde Aliquote bei 4 ° C.
  3. Bereiten Sie auf dem Eis einen master-Mix 10 x 384-Well Platten durch Zugabe von 18,86 mL Reinstwasser, 20 mL qPCR Puffer, 1.000 µL vorgefertigtes Grundierung Kombination und 180 µL vorgefertigtes Sonde Kombination (Tabelle 2).
  4. Verteilen der master-Mix gleichmäßig über eine 96-Deep-well-Platte mit einer Multi-Kanal-Pipette, 415 µL in jede Vertiefung pipettieren. Halten Sie diese Platte in eine Eisbox aus Licht abgedeckt.
  5. Mit einem flüssigen Umgang mit Instrument, 9,5 µL des master-Mix in jede Vertiefung von 384-Well-Platte mit getrockneten gDNA verzichten. Die Dichtplatte mit einer Folie und legen Sie es sofort bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Platten, um sicherzustellen, dass die Nadeln der Handlingsystem Flüssigkeit mit Wasser zwischen jedem Teller gewaschen werden.
  6. Zentrifugieren Sie 384-Well-Platten bei 450 X g für 3 min und inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht oder zwischen 6-12 h die DNA Aufschwemmen und eventuelle Luftblasen zu zerstreuen.

4. qPCR Assay

  1. Zentrifugieren Sie nach der Übernachtung Inkubation bei 450 X g für 3 min, verbleibenden Luftblasen zu zerstreuen.
  2. Für Zwecke der Automatisierung, verbinden die qPCR-Maschine (z. B. LightCycler 480) zu einem Mikrotestplatte Handler (siehe Tabelle der Materialien). Programm der Mikrotestplatte Handler, der die Platten in der qPCR-Maschine von einem gekühlten Lagerung Dock zu setzen, der vor Licht geschützt ist.
    Hinweis Assays sollte, in der Theorie funktionieren, auf anderen qPCR-Maschinen mit passenden optischen Einstellungen.
  3. Verwenden Sie die folgenden Radsport Bedingungen: 95 ° C für 5 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 66 ° C für 50 s, mit Datenerfassung bei 66 ° C.
  4. Sobald das abgeschlossen ist, haben Sie die Roboter die Platte von der qPCR-Maschine zu sammeln und legen Sie es im Dock ablegen.

5. nach einem Testlauf Analyse

  1. Nach Verstärkung, berechnen die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte mit der zweiten Derivative maximale Methode oder die Anpassungspunkte Methode mit der Software der qPCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die folgenden Schritte aus.
  2. Öffnen Sie die qPCR-Software und in der Registerkarte " Navigator " öffnen Sie die gespeicherte Reaktion-Experiment-Datei für eine Platte.
  3. Wählen Sie für die Analyse mit der zweiten Derivative maximale Methode die Registerkarte "Analyse", und erstellen Sie eine neue Analyse mit Abs Quant/Second Derivat Max Methode.
    1. Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Second Derivat Max Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: Rx-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).
    2. Wählen Sie Filter Kamm und VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dies sorgt dafür, dass die Daten für STAT6 ausgewählt ist.
    3. Wählen Sie Farbe Entschädigung für VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klicken Sie auf berechnen. Wiederholen Sie dies für Fam (465-510) und Cy5/Cy5.5(618-660). Klicken Sie auf Datei speichern.
  4. Wählen Sie für die Analyse der Anpassungspunkte Methode Abs Quant/Fit Punkte in der Registerkarte "Analyse aus".
    1. Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Anpassungspunkte Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: RxF-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).
    2. Wählen Sie den richtigen Filter und Farbe Entschädigungen für STAT6 und jedes der KIR -Gene (Fam/Cy5). Legen Sie in der Registerkarte " Noiseband " Noise-Band, die Hintergrundgeräusche auszuschließen.
    3. Legen Sie in der Registerkarte Analyse die Anpassungspunkte 3 und wählen Sie Show Punkte passen. Klicken Sie auf berechnen. Klicken Sie auf Datei speichern.

6. Export der Ergebnisse

  1. In der qPCR-Software, öffnen Sie den Navigator tab. Wählen Sie Ergebnisse Batch Export.
  2. Öffnen Sie den Ordner, in dem die Experiment-Dateien werden gespeichert und übertragen Sie die Dateien in den rechten Bereich des Fensters. Klicken Sie auf weiter. Wählen Sie den Namen und den Speicherort der Exportdatei.
  3. Wählen Sie Analyse Abs Quant/Second Derivat Max Methode oder Abs Quant/Anpassungspunkte. Klicken Sie auf weiter. Überprüfen Sie, dass der Name der Datei, die Export-Ordner und die Berechnungsart korrekt sind und klicken Sie auf nächste um den Export zu starten.
  4. Warten Sie, bis der Export Status Okist. Der Bildschirm bewegt sich automatisch mit dem nächsten Schritt fort. Überprüfen Sie, ob alle ausgewählte Dateien erfolgreich exportiert wurden, dass die Anzahl der Dateien fehlgeschlagen = 0. Klicken Sie auf fertig.
  5. Verwenden Sie Skripte split_file.pl und roche2sds.pl, individuelle Reaktionen für jede Platte die exportierten Platten aufgeteilt.
    Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.

7. Kopieren Sie Zahl Berechnungen

  1. Öffnen Sie die Kopie Nummer Auswerte-Software (z. B. CopyCaller). Wählen Sie Echtzeit-PCR-Ergebnisse-Datei importieren und laden Sie Textdateien, die von roche2sds.plerstellt.
  2. Wählen Sie analysieren und durchführen Sie die Analyse, indem entweder die Auswahl Kalibrator Probe mit bekannten Exemplarzahl oder am häufigsten Exemplarzahl. Siehe Tabelle 5 für die häufigsten Kopienzahl des KIR -Gene, die in der Regel in europäischen Ursprungs Populationen beobachtet.

8. Qualitätsprüfungen Daten-

  1. Verwenden Sie R-Skript KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R , Nummer Kopieren von Daten von den Platten in eine Tabellenkalkulation zu kombinieren.
    Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.
  2. Überprüfen Sie die Rohdaten auf der Kopie Zahl Analysesoftware für Proben, die nicht zu den bekannten Gestänge Ungleichgewicht (LD) für KIR -Gene (Tabelle 6) entsprechen.

Ergebnisse

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Zahlenanalyse Kopie kann durch den Export der Dateien in die Kopie Nummer Analyse-Software, bietet die vorhergesagten und geschätzte Kopienzahl, basierend auf der ΔΔCq-Methode durchgeführt werden.

Die Kopienzahl kann vorhergesagt werden, entweder basierend auf der bekannten Kopienzahl des Control DNA-Proben auf dem Teller oder durch Eingabe der häufigsten gen Kopienzahl (Tabelle 5). Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse einer Platte für eine Reaktion, die KIR2DL4 und KIR3DS1sowie das Referenz-gen richtet sich an STAT6. Die häufigste Kopienzahl für KIR2DL4, ein Rahmen-gen in der KIR -Locus, ist zwei Exemplare, während die häufigste Kopienzahl für KIR3DS1, eine aktivierende gen eine Kopie. Die Ergebnisse in der Abbildung zeigen die PCR-Amplifikation Grundstücke beobachtet auf der qPCR-Software und die Nummer Kopieren von Daten aus der qPCR-Daten generiert. Wie gezeigt, ist der Test zwischen 0, 1, 2, 3 und 4 KIR gen Heftnummern unterscheiden können. Die Kopie Nummer Analysesoftware ermöglicht auch eine Betrachtung der Verteilung der die Kopienzahl auf den Teller legen, als ein Kreisdiagramm oder ein Balkendiagramm. Die Wirksamkeit der Kopie Zahl Vorhersage ist geringer bei Proben mit einer höheren Anzahl der Kopie.

Die Qualität der Werkstoffe in den Reaktionen gDNA, Puffer, Primer und Sonden, kann die Genauigkeit der Ergebnisse beeinflussen. Discordance in den Ergebnissen ist jedoch am ehesten durch Variation der Konzentration von DNA über eine Platte verursacht werden. Die Reinheit des extrahierten gDNA, die gemessen werden kann, mit 260/280 und 260/230 Verhältnisse können sich auch auf die Qualität auswirken. Ein 260/280 Verhältnis von 1,8-2 und a 260/230 Verhältnis von 2-2.2 sind wünschenswert. Eine ungleichmäßige Palette von DNA-Konzentrationen über eine Platte können zu einer hohen Variabilität in der Schwelle-Zyklus (C-t) zwischen Proben und Discordance im Bereich der geschätzten Exemplarzahl führen. Die Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen die Wirkung, die Diskrepanz zwischen den C-t -Werte über eine Platte auf die Genauigkeit bei der Vorhersage von die Kopienzahl haben kann. Die rote Linie zeigt den Bereich der die geschätzte Kopienzahl für eine Probe und idealerweise sollte so nah wie möglich an eine Ganzzahl wie möglich sein.

Die Kopie Nummer Daten, einmal analysiert, können als eine Tabellenkalkulationsdatei in einem 96-Well-Format exportiert werden. Wir haben eine R-Skript (erhältlich auf Anfrage) die Kopie Nummer Daten alle 10 Platten zu kombinieren, die als Set in einer Tabelle ausgeführt werden. Veröffentlichte Daten über KIRs aus meist europäischen Ursprungs Populationen ermöglicht die Vorhersage der LD-Regeln, die zwischen verschiedenen Genen in der KIR komplexe1vorhanden sind. Diese Vorhersagen werden verwendet, um nachgeschaltete Kontrollen auf die Kopie Nummer Ergebnisse (Tabelle 6). Proben, die nicht die vorhergesagte LD zwischen den Genen entsprechen, können ungewöhnliche Polymorphismus oder Haplotypic strukturellen Variationen enthalten. Ein Flussdiagramm, beschreibt das Protokoll ist in Abbildung 3dargestellt.

Eine Tool namens KIR Haplotyp Bezeichner (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) wurde entwickelt, um die Zurechnung von Haplotypen aus dem Datensatz zu ermöglichen. Die Zurechnung arbeitet auf der Grundlage einer Referenz Haplotypen in einem europäischen stammende Bevölkerung1beobachtet. Das Tool lässt sich jedoch auch für einen benutzerdefinierten Satz von Referenz-Haplotypen stattdessen verwendet werden. Drei separate Dateien werden erstellt. die erste Datei listet alle Haplotypen-Kombinationen für eine Probe, die zweite Datei enthält eine getrimmte Liste der Haplotypen-Kombinationen, die die höchsten kombinierten Frequenzen haben, und die dritte Datei listet die Proben, die Haplotypen zugeordnet werden können. Non-Zuordnung von Haplotypen könnte als Indikator für neuartige Haplotypen verwendet werden.

figure-results-1
Abbildung 1: repräsentative Ergebnisse einer Platte für Reaktion Nr. 5. (A) diese Panel zeigt Verstärkung Grundstücke. (B) dieses Panel zeigt kopieren Anzahl Parzellen. (C) dieser Bereich zeigt die Kopie Nummer Verteilung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-2
Abbildung 2: repräsentative Ergebnisse einer Platte mit einer Variablen DNA-Konzentration für Reaktion Nr. 5. (A) diese Panel zeigt Verstärkung Grundstücke. (B) dieses Panel zeigt kopieren Anzahl Parzellen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

figure-results-3
Abbildung 3: Flussdiagramm des Protokolls qKAT. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

AssayGeneForward PrimerKonzentration (nM)Reverse PrimerKonzentration (nM)SondenKonzentration (nM)
Nr. 13DA1A4F250A5R250P4a150
2DL 22DL2F4400C3R2600P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL 3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 33DL 3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 43DL1e4B1F250B1R125P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 53DS1B2F250B1R250P4b150
2DL 4C1F200C1R200P5b - 2DL 4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 62DL 1B3F500B3R125P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 72DS1B4F500B4R250P4b150
2DL 5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 82DS3B5F250B5R250P4b150
3DL2e9D4F250D5R125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
Nr. 102DS5B6F2200B6R3200P4b150
2DS4C5F250C5R250P5b150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

Tabelle 1: Kombination und Konzentration von Primer und Sonden verwendet in jeder qKAT Reaktion 27 .

ReaktionGrundierung Aliquote (µL)Sonde Aliquote (µL)
R13DA1A4FA5R2DL2F4C3R2WASSERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL 21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RWASSERSTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL 31601601601601608080806060
Hinweis: benötigen Sie 20 µL weniger Wasser in den MasterMix
R33DL 3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2WASSERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100 1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2WASSERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RWASSERSTAT6FSTAT6RP4BP5B - 2L 4PSTAT6
2DL 410010080804408080606060
R62DL 1B3FB3RD3FD3RWASSERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RWASSERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DL 52001002002001008080606060
R82DS3B5FB5RD4FD5RWASSERSTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2WASSERSTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RWASSERSTAT6FSTAT6RP4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

Tabelle 2: Volumen (µL) von 100 µM Primer/Sonden Stammlösungen, Primer und Sonden Kombination Aliquote.

NameRichtung5´ Änderung3´ ÄnderungSequenz (5' →3')LängeTMGC %ExonPosition
P4aSinnFAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044,44425-451
P4bAntisenseFAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5bSinnATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5b - 2DL 4SinnATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9SinnATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062,591246-1269
PSTAT6ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

Tabelle 3: Liste der Sonden verwendet in qKAT 1, 27. fluoreszierende Farbstoffe am 5'-Ende der Oligo-Sonden P5b, P5b - 2 DL 4, P9 und PSTAT6 wurden geändert, um ATTO-Farbstoffen.

GenPrimerRichtungSequenz (5´-3´)LängeTMGC %ExonPositionAmplifikate (bp)Allele übersehen werden
3DL2e4A1FvorwärtsGCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261,14399-4161793DL 2 * 008, * 021 * 027, * 038.
A1RRückwärtsCTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352,6559-5773DL 2 * 048
3DA1A4FvorwärtsGTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416112nichts
A5RRückwärtsGTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255,6492-509nichts
2DS2A2FvorwärtsGTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416111nichts
A6RRückwärtsTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142,9488-508nichts
3DL 3A8FavorwärtsGTGAAATCGGGA
GAGACG		185055,64406-423139nichts
A8FbvorwärtsGGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052,6405-4233DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8RRückwärtsAGTTGACCTGGG
AACCCG		185161,1526-543nichts
3DL1e4B1FvorwärtsCATCGGTCCCAT
GATGCT		185155,64549-566853DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1RRückwärtsGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL 1 * 00502
3DS1B2FvorwärtsCATCGGTTCCAT
GATGCG		185155,64549-566853DS1 * 047; 3 DL 1 * 054 abholen kann.
B1RRückwärtsGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633nichts
2DL 1B3FvorwärtsTTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3RRückwärtsGTCACTGGGAGC
TGACAC		185061,1622-6392DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1B4FvorwärtsTCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147,44545-563962DS1 * 001
B4RRückwärtsGGTCACTGGGAG
CTGAC		174964,7624-640nichts
2DS3B5FvorwärtsCTCCATCGGTCG
CATGAG		185361,14546-56396nichts
B5RRückwärtsGGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161,1624-641nichts
2DS5B6F2vorwärtsAGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052,64475-493173nichts
B6R3RückwärtsTCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366,7630-6472DS5 * 003
2DL 4C1FvorwärtsGCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255,65808-82583nichts
C1RRückwärtsCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252,6872-8902DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 22DL2F4vorwärtsGAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257,95778-7961512DL 2 * 009; 782G geändert a.
C3R2RückwärtsTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928nichts
2DS4C5FvorwärtsTCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770,65803-819120nichts
C5RRückwärtsTTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257,9904-9222DS4 * 013
2DS4Del2DS4DelvorwärtsCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457,95750-768203nichts
2DS4R2RückwärtsTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952nichts
2DS4FL2DS4FLvorwärtsCCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357,95744-762209nichts
2DS4R2RückwärtsTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952nichts
2DL 3D1FvorwärtsAGACCCTCAGGA
GGTGA		174858,891180-1196156nichts
D1RRückwärtsCAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 und 2DL 3 * 01802
2DL 5D2FvorwärtsCACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B * 011 und 2DL5B * 020
D2RRückwärtsGGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947,41315-1333nichts
2DP1D3FvorwärtsCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121nichts
D3RRückwärtsTTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304nichts
3DL1e9D4FvorwärtsCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221933DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2RückwärtsCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343,51273-12953DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9D4FvorwärtsCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221156nichts
D5RRückwärtsGACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463,21340-1358nichts
STAT6STAT6FvorwärtsCCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129
STAT6RRückwärtsCCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

Tabelle 4: Sequenzen der Primer verwendet in qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 32DS22DL 22DL 32DP12DL 13DA12DL 43DL 1
EX9		3DL 1
EX9		3DS12DL 52DS32DS52DS12DS4
gesamt		2DS4
FL		2DS4
DEL		3DL 2
ex4		3DL 2
EX9
Am häufigsten Kopienzahl21122222221111121122

Tabelle 5: Am häufigsten Exemplarzahl für KIR Gene, die häufig in europäischen stammende Proben beobachtet.

Gestänge Ungleichgewicht Regeln für qKAT basierend auf europäischen BevölkerungenKopie-Prüfung
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 und KIR3DL2 sind Rahmen Gene auf beide Haplotypen vorhanden. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 und KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 und KIR2DL2 sind mit einander in LD 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 und KIR2DL3 sind Allele des gleichen Gens 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 und KIR2DL1 sind mit einander in LD 2DP1=2 DL 1
5Exon 4 von KIR3DL1 und KIR3DL2 ist jeweils gleich Exon 9 KIR3DL1 und KIR3DL2 . 3DL1ex4=3DL1ex9 und 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 und KIR3DS1 sind Allele 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 und KIR2DS5 sind in LD mit KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 und KIR2DS1 sind in LD 3DS1=2DS1
9Vorhandensein von KIR2DS1 und KIR2DS4Tuerprofil ist gegenseitig auf einen Haplotyp 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL und KIR2DS4del sind Varianten des KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabelle 6: Verknüpfung Ungleichgewicht zwischen KIR Gene, die häufig in europäischen Ursprungs Populationen beobachtet können zur Kopie Zahlendaten überprüfen 1,27.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschrieben eine neue halbautomatische Hochdurchsatz-Methode, genannt qKAT, das erleichtert die Kopie Nummer eingeben, KIR Gene. Die Methode ist eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden wie SSP-PCR, die niedrig-Durchsatz und können nur zeigen das Vorhandensein oder Fehlen dieser höchst polymorphen Gene.

Die Genauigkeit der erhaltenen Kopie Zahl Daten ist abhängig von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Qualität und Konzentration-Einheitlichkeit der gDNA Proben und die Qualität der Reagenzien. Die Qualität und Genauigkeit der gDNA Proben über einen Teller sind extrem wichtig, da Schwankungen in der Konzentration auf den Teller legen Fehler bei der Berechnung der Kopienzahl führen können. Da die Assays mit europäischen Ursprungs-Sample-Sets validiert wurden, benötigen Daten von Kohorten aus anderen Teilen der Welt eine gründlichere Prüfungen. Dies soll sicherstellen, dass Instanzen von Allel ausfallende oder nicht-spezifische Primer/Sonden Bindung nicht als Copy Number Variation fehlinterpretiert werden.

Während die Assays wurden entworfen und optimiert, um als Hochdurchsatz-laufen, können sie geändert werden, um weniger Beispiele auszuführen. Vertrauen-Metrik in der Kopie Zahl Analysesoftware ist betroffen, wenn weniger Proben analysieren, aber dies kann verbessert werden, wenn Kontrolle genomische DNA-Proben mit bekannten KIR gen Ausfertigung eine eigene Nummer auf dem Teller enthalten sind und zusätzliche Probe repliziert werden iinklusive.

Für Labors ohne Flüssigkeit/Platte-Handling-Roboter master-Mix mit Mehrkanal-Pipetten verzichtet werden kann und Platten können manuell in das qPCR-Gerät geladen werden.

Das Hauptziel hinter der Entwicklung des qKAT war eine einfache, hohem Durchsatz, hochauflösende und kostengünstige Methode, Genotyp KIRs für Krankheit Assoziationsstudien erstellen. Dies wurde erfolgreich, da qKAT beschäftigt war, bei der Untersuchung der Rolle von KIR in mehrere große Krankheit Assoziationsstudien, einschließlich einer Reihe von Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Schwangerschaft Störungen4, 24 , 25 , 26.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Projekt erhielt Fördermittel aus dem Medical Research Council (MRC), der European Research Council (ERC) Programms der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation (Grant Agreement Nr. 695551) und das National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedizinischen Forschungszentrum und NIH Forschung Blut- und Transplant Research Unit (NIHR BTRU) im Bereich der Organspende und Transplantation an der University of Cambridge und in Partnerschaft mit NHS Blood and Transplant (NHSBT). Die geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt der NHS, die NIHR, das Department of Health oder die NHSBT.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
REAGENTS
OligonukleotideSigmaSonderanfertigungSEQUENZEN: Gelistet in Tabelle 4
Sonden mit ATTO-Farbstoffenmarkiert SigmaSonderanfertigungSEQUENZEN: Gelistet in Tabelle 3
SensiFAST Sonde No-ROX KitBiolineBIO-86020−
MilliQ Wasser−−−
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EQUIPMENT
Zentrifuge mit schwingendem SchaufelrotorEppendorf (oder gleichwertig)Eppendorf 5810R oder gleichwertiges System
NanoDropThermo ScientificND-2000
OR
QuBit FluorometerLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II Instrument 384-WellRoche05015243001
Twister II Mikroplatten-Handler mit Mé Cour Thermischer Plattenstapler (Mé CaliperLife Sciences204135
Vortex-MischerBiosanBS-010201-AAA
Einkanalpipetten (Volumenbereich: 0,5– 10 & Mikro; L, 2– 20 & Mikro; L, 20– 200 & Mikro; L, 200– 1.000 & Mikro; L; 1-10 mL)Gilson (oder gleichwertig)F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- und DNase-freie Pipettenspitzen, gefiltert (10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1.000 & Mikro; L, 10 mL)Starlab (oder gleichwertig)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagenzreservoir, 55 mLSTARLABE2310-1010
50 mL ZentrifugenröhrchenSTARLABE1450-0200
96-Well-Deep-Well-PlatteFisher Scientific12194162
LC480 384 Multiwell-PlattenRoche04729749001
LightCycler 480 SiegelfolieRoche04729757001
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
>
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR-Haplotyp-Identifikatorhttp://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

Referenzen

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Schlagwörter

KIR GenotypisierungqKAT MethodeReal time PCRKopienzahlanalyseMultiplex ReaktionenHLA InteraktionNK ZellrezeptorenPopulationsgenetikKrankheitsassoziation

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