Methodenartikel

Protein Kinase C-Delta-Inhibitor Peptid Formulierung mit Gold-Nanopartikeln

4.9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/58741

⸱

9. März 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latner Thoracic Surgery Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Respiratory Medicine Research Laboratory, Institute of Translation Medicine, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University, 3Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben mit eine gold-Nanopartikel-Peptid-Hybrid früher intravenös liefern einen synthetischen Peptid, Protein-Kinase C-Delta-Hemmer, die Ischämie-Reperfusion-induzierten akuten Lungenversagen reduziert. Hier zeigen wir das ausführliche Protokoll der Arzneistoff-Formulierung. Anderen intrazellulären Peptide können in ähnlicher Weise formuliert werden.

Zusammenfassung

Protein C-Delta-Kinase-Inhibitor (PKCδi) ist ein vielversprechendes Medikament, Ischämie-Reperfusion-induzierte Orgel Verletzungen zu vermeiden. Es ist in der Regel an eine Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Allerdings hat TAT unspezifische biologische Aktivitäten gezeigt. Gold-Nanopartikel (festzulegenden) kann als Droge Anlieferung Träger ohne anerkannte Toxizität verwendet werden. Daher haben wir eine GNP/Peptid-Hybrid verwendet, um PKCδi zu liefern. Zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW), in einem 95:5 Verhältnis, wurden verwendet, um die Oberflächeneigenschaften des BSP zu ändern. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) sind stabil in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), bovine Serum Albumin oder fötalen Rinderserum enthalten. Intravenöser Injektion von GNP-PKCi zeigte zuvor Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur GNP/PKCi zu formulieren und bewerten die physiochemischen Eigenschaften des GNP/PKCi. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente mit BSP zu formulieren. Dieser Artikel wird hoffentlich mehr Aufmerksamkeit auf dieses neuartige intrazellulären Drug-Delivery-Technologie und ihre Anwendungen in-vivo ziehen.

Einleitung

Lungen-Transplantation erspart Patienten mit terminaler Lunge Krankheit1. Schwere Komplikationen nach Lungentransplantation bleiben jedoch ein Hindernis. In den frühen Stadien nach Lungentransplantation, primäre Graft Dysfunktion ist die schädlichste Komplikation1und seine Hauptursache ist Ischämie-Reperfusion (IR)-induzierten akuten Lungen-Verletzungen2.

Unter kalten Erhaltung ist Stoffwechsel in einem Spender Lunge beschränkt sich auf einem sehr niedrigen Niveau. Jedoch werden reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid-Synthese aufgrund der Einstellung der Blut fließen3aktiviert. Nach der Transplantation Durchblutung der Haut wird wiederhergestellt und reaktive Sauerstoffspezies und Stickoxid erzeugt während der kalten Ischämie verbessern Entzündung und Zelle Tod, was zu Gewebeschäden.

Zur Vermeidung von Verletzungen IR wurde ein Protein Kinase Cδ Inhibitor (PKCδi) in das Herz, Gehirn und Lunge4,5,6,7,8verwendet. Diese Studien zeigten, dass PKCδi Entzündung und Apoptose während Reperfusion abgenommen. Es hat auch pulmonale IR Verletzung bei Ratten und in eine Lungen-Transplantation Modell6verhindert. PKCδi ist in der Regel mit einer Zelle eindringen Peptid, TAT, für die intrazelluläre Lieferung konjugiert. Jedoch hat gezeigt, dass die TAT Peptid allein nicht spezifische biologische Wirkungen, einschließlich der Förderung der Angiogenese, Apoptose und Hemmung der mehrere Zytokine9,10,11hat. Nanopartikel, kleine Partikel von 1 bis 100 nm im Durchmesser12, als Kandidaten bei der Erleichterung der Droge Lieferung13erkundet worden. Insbesondere gelten goldene-Nanopartikeln (festzulegenden) als nicht-invasive und ungiftig. Daher haben wir als Medikament Anlieferung Träger für Peptid-basierte Medikamente14,15festzulegenden entwickelt.

Die Oberfläche des festzulegenden kann für spezielle Anwendungen wie molekulare Erkennung16,17, chemische Sensor18, bildgebenden19und Drug-Delivery manipuliert werden. GNP/Peptid-Hybrid-System entwickelt wurde, mit 20 nm festzulegenden und zwei kurze Peptide (P2: CAAAAE und P4: CAAAAW) in einem 95:5 Verhältnis, die Oberflächeneigenschaften der festzulegenden ändern. Das P2-Peptid mit der negativ geladenen Glutaminsäure (E) am Ende, stabilisiert festzulegenden in einer wässrigen Lösung, und das P4-Peptid mit der hydrophoben Tryptophan (W) am Ende hilft festzulegenden Eingang in Zellen14. Cystein (C) Rückstände am N-Terminus dieser Peptide enthält eine Thiol-Gruppe, die in den Goldflächen14konjugieren kann. Dieses Peptid/GNP-Hybrid wurde weiter verwendet, um PKCδi (CSFNSYELGSL) zu liefern. Das optimierte molare Verhältnis von P2:P4 zu PKCδi ist 47.5:2.5:50. Festzulegenden konjugiert mit PKCδi (GNP/PKCi) werden in destilliertem Wasser, 0,9 % NaCl und PBS mit bovinen Albumin oder fötalen Rinderserum14stabil. Intravenöser Injektion von GNP/PKCi hat sich gezeigt, Ischämie-Reperfusion Verletzungen der Lunge15zu vermeiden. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um GNP/PKCi formulieren und beschreibt, wie die physikalisch-chemischen Eigenschaften des GNP/PKCi zu bewerten. Wir haben ähnliche Methoden verwendet, um andere Peptid-basierte Medikamente zu GNP20,21,22konjugiert zu formulieren. Wir hoffen, dass dieser Artikel mehr Aufmerksamkeit auf diese neuartige Formulierung zur intrazellulären Wirkstoffabgabe ziehen wird.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Peptid-Lösungen

  1. Abrufen der Peptide (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) aus dem Gefrierschrank-20 ° C und Auftauen bei Raumtemperatur (RT).
    Hinweis: Halten Sie die Flasche geschlossen, um verhindern, dass Feuchtigkeit kondensiert auf der Peptide.
  2. Ein Microscale belasten Sie 0,01 g jedes Peptid. Genommen Sie jedes Peptid in eine separate 50 mL konische Rohr.
  3. Die P2-Röhre 18,74 mL entionisiertem Wasser (DI) hinzufügen.
  4. Der P4-Tube 16,93 mL DI Wasser hinzufügen.
  5. Zugeben Sie 8,21 mL 50 % Acetonitril in VE-Wasser, das PKCδi Rohr verdünnt.
  6. Wirbel der Peptid-Lösungen kurz. Legen Sie die 50 mL konische Röhrchen in einem Sonikator (40 MHz) für 5 min.
  7. Eine biologische Kabinett bringen Sie die Peptid-Lösungen. Alle Peptid-Lösungen vorbereitet sollte 1 mM betragen.
  8. Übertragen Sie 1 mL jedes Peptidlösung auf eine neue 50 mL konische Rohr. Die Rohre der P2 und P4 19 mL VE-Wasser hinzu und das PKCδi Rohr fügen Sie 19 mL 50 % Acetonitril hinzu, so, dass jede Lösung bis 50 µM verdünnt und in eine eigene Röhre gespeichert.

2. Formulierung von BSP/PKCi

  1. Peptide sollte die GNP-Lösung noch in der BSC hinzugefügt werden
  2. Fügen Sie 475 μL von P2, 25μL P4 und 500 μL δPKCi Lösung in einem 15 mL-Tube. Der gleiche 15 mL Tube 9 mL 20 nm GNP-Lösung (7.0x1011 Partikel/mL) hinzufügen.
  3. Beenden Sie das Biosafety-Kabinett. Wickeln Sie die 15 mL-Tube mit Alu-Folie. Lassen Sie es über Nacht auf einem Schüttler bei RT.
  4. Zurück die Proben der Biosicherheits Kabinett. Aliquoten 1 mL der GNP/PKCi in jeder 1,5 mL Mikroröhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie die Rohre in einer Mikro-Zentrifuge für 30 min bei 15.294 x g bei 4 ° C.
  6. Jedes Rohr unter einen Schrank Biosafety entfernen Sie überstand.
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig, den Überstand zu entfernen, gleichzeitig sicherzustellen, dass die GNP Pellet erhalten bleibt und wird nicht abgesaugt.
  7. Wieder aussetzen Sie, das Pellet in dem gewünschten Lösungsmittel entsprechend der Konzentration erforderlich. Anwendbaren Lösungsmitteln kann DI-Wasser, PBS und 0,9 % NaCl.
    Hinweis: Ab 1 mL der GNP/PKCi, enthält die GNP Pellet 6,3 x 1011 Partikel, basierend auf der GNP-Konzentration des Herstellers. Verwalten von 1,3 x 1012 Partikel in 500 µL von 0,9 % NaCl, fügen wir 232 µL von 0,9 % NaCl zu jedem der drei Pellets. Nach der Zusammenlegung, können wir dann 500 µL GNP/PKCi Lösung sammeln.
    Hinweis: Mischen Sie die gewünschte Lösungsmittel vor Verdünnung der GNP/PKCi Pellet, ansonsten GNP/PKCi aggregiert werden.

3. Bewertung der BSP/PKCi Hybrid Löslichkeit

  1. Gießen Sie 0,5 mL der GNP/PKCi Lösung in einer Küvette Acryl. Legen Sie die Acryl-Küvette auf einem UV-Vis Spektralphotometer und testen Sie die Spitze Absorption15.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Sollte darauf geachtet werden, die biophysikalischen Eigenschaften des GNP/PKCi Hybrid, zu bewerten wie GNP tendenziell Aggregat in Lösungsmittel. Wenn GNP aggregiert wird, ändert sich die Farbe der Lösung von rosa bis violett (Abbildung 1a). UV-Vis Spektralphotometer ist in der Lage, die Veränderungen empfindlicher zu erkennen. Wenn die GNP/PKCi nicht aggregiert ist der Höhepunkt der Aufnahme sollte bei 525 nm (Abbildung 1 b). W...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Um die richtige Formulierung zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass die δPKCi Lösung den Beschallung Schritt in 1.6 beschrieben erfährt. ΔPKCi Peptidsequenz enthält hydrophoben Moieties, so dass ein Sonikator hilft bei der Auflösung von PKCi in der 50 % Acetonitril-Lösung. Darüber hinaus ist es sehr wichtig, um das Lösungsmittel akribisch, wie in Schritt 2.7 beschrieben mischen.  Die GNP/PKCi-Hybrid wird nicht gut formuliert werden, wenn diese Schritte nicht richtig durch die Aggregation der δPKCi Peptid

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts, an diesem Projekt offen zu legen.

Danksagungen

Diese Arbeit stützt sich auf Forschungsstipendien von Canadian Institutes of Health Research (PJT-148847), Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario (RE-08-029) und Kanada erste Forschung der Excellence Program, Medizin von Design an der University of Toronto. Dr. Mingyao Liu ist James und Mary Davie Stuhl Lungenschädigung, Reparatur und Regeneration.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
negativ geladenes Glutaminsäurepeptid (P2)CanPeptid-Sequenz: CAAAAE-NH2
Länge: 6aa
Modifikation: C-terminale Amidierung
Menge: 50mg
Reinheit: >95%
hydrophobes Tryptophan-Peptid (P4)CanPeptid-Sequenz: CAAAAW-NH2
Länge: 6aa
Modifikation: C-terminale Amidation
Menge: 50mg
Reinheit: >95%
Δ PKCi-PeptidCanPeptideSequenz: CSFNSYELGSL-NH2
Länge: 11aa
Modifikation: C-terminale Amidation
Menge: 50mg
Reinheit: >95%
konisches Röhrchen (50ml)Corning Life Sciences3582070
konisches Röhrchen (15ml)Corning Life Sciences3582096
AcetonitrilSigma-Aldrich271004-100ML
UltraschallgerätBranson Ultrasonics Corp.Branson 2510MTH
MikroröhrchenDiamed.caAD 150-N
Gold-NanopartikellösungTed Pella15705-5Eine Partikelgröße beträgt 20 nm
Rocking Platform ShakerVWR international40000-304 
MikrozentrifugeEppendorf5417R
AcrylküvetteSARSREDT67.758
UV-Vis SpektralphotometerAgilentCaty 60 UV-Vis

Referenzen

  1. Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
  2. Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
  3. Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
  4. Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
  5. Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
  6. Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
  7. Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
  8. Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
  9. Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
  10. Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
  11. Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
  12. Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
  13. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  14. Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
  15. Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
  16. Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
  17. Rosi, N. L., Mirkin, C. A. Nanostructures in biodiagnostics. Chemical Reviews. 105 (4), 1547-1562 (2005).
  18. Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
  19. Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
  20. Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
  21. Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
  22. Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
  23. Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
  24. Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
  25. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
  26. Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360(2009).
  27. Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
  28. Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
  29. Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Goldnanopartikel DeliveryPeptidkonjugationIsch mie ReperfusionsschadenUV Vis SpektrophotometrieNanopartikelaggregationzellul re AufnahmePeptidsyntheseDrug Delivery SystemNanopartikelstabilit t

Verwandte Artikel