Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.
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Methodenartikel
Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In lebenden Zellen beinhalten Prozesse wie Adhäsion Bildung umfangreiche strukturelle Veränderungen in der Plasmamembran und das Zellinnere. Um diese hoch dynamischen Events sichtbar zu machen, wurden zwei komplementäre lichtmikroskopische Techniken, mit denen schnelle Bildgebung live Proben kombiniert: spinning Disk Mikroskopie (SD) für schnelle und hochauflösende Volumen Aufnahme und Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) für die präzise Lokalisierung und Visualisierung der Plasmamembran. Eine umfassende und vollständige imaging-Protokoll wird für Führung durch Probenvorbereitung, Mikroskop Kalibrierung, Imagebildung und Erwerb, wodurch Multi-Color SD-TIRF live imaging Serie mit hoher räumlich-zeitliche Auflösung angezeigt. Alle gewünschten Bild Nachbearbeitung Schritte, Multi-dimensionale live imaging Datasets, d.h. Anmeldung und Kombination der einzelnen Kanäle zu generieren sind ein selbst geschriebenes Makro für die open-Source-Software ImageJ zur Verfügung gestellt. Die Darstellung der fluoreszierenden Proteinen während der Initiation und Reifung der Adhäsion-komplexe sowie die Bildung des Aktin-Zytoskeletts Netzwerks, diente als Beweis der Grundsatz dieser neuartige Ansatz. Die Kombination aus hochauflösenden 3D Mikroskopie und TIRF zur Verfügung gestellt, einer detaillierten Beschreibung dieser komplexen Prozesse innerhalb der zellulären Umgebung und gleichzeitig präzise Lokalisierung der membranassoziierten Moleküle erkannt mit hohem Signal-Hintergrund-Verhältnis.
Einleitung
Unsere Tage entwickeln sich rasch lichtmikroskopische Techniken bietet High/Super Resolution Imaging in festen und lebenden Exemplar. Höchstauflösung Techniken wie z. B. stimulierte Emission Depletion (STED), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM) und Foto-Aktivierung Lokalisierung Mikroskopie (PALM) oder direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm), bzw. sind im Handel erhältlich und ermöglichen die Darstellung der subzellulären Strukturen zeigt Details fast auf molekularer Ebene1,2,3,4,
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Protokoll
1. Vorbereitung der Zellen
- Samen Sie zwei Tage vor dem Experiment, 3 * 105 HeLa oder NIH3T3 Zellen in 2 mL voll Wachstumsmedium pro Bohrloch einer 6-Well-Zellkultur-Platte. Stellen Sie sicher, dass Zellen in einer Laminar-Flow-Haube in diesem Protokoll behandelt werden.
- Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment, die Transfektion Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder eine empirisch ermittelte Protokoll, z.B.:
- Verdünnen Sie 1 µg der RFP-Lifeact und 1 µg der YFP-Vinkulin in insgesamt 200 µL Serum Medium reduziert. Vortex Transfection Reagens kurz, hinzu kommen 4 µL 200 µL DNA und Wirbel wieder. Inkubieren S....
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Ergebnisse
Um dem Potenzial des SD-TIRF Imaging, zeigen ein Assay entwickelt wurde zeigen sollte, die räumlich-zeitliche Organisation der Zelle-Matrix-Haftung-komplexe und deren Wechselwirkung mit dem Zytoskelett während zellulare Adhäsion. Daher Anhänger HeLa oder alternativ NIH3T3, die Zellen mit YFP-Vinkulin und RFP-Lifeact für 18-24 h, transfiziert wurden trypsiniert und auf Fibronektin-beschichtete Unterseite Glasschalen ausgesät. Diese Zell-Linien wurden für ihre starke Zellskelett und höhere .......
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Diskussion
In diesem Papier wurde die erste erfolgreiche Implementierung von SD und TIRF-Mikroskopie in einer Konfiguration für experimentieren live Cell imaging, d.h. hohe Erfassungsraten wie 2 SD-TIRF Bild Stapel pro Minute bei 3 verschiedenen Bühne vorgestellt. Positionen, entsprechend insgesamt 168 Rahmen (ca. 3 Bilder pro Sekunde), erworben wurden. Die paar SD-TIRF-Mikroskope, die zuvor beschriebenen12,13, vor allem fehlende ausreichend Highspeed imaging, zell.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken sehr die wissenschaftliche Gemeinschaft von des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf unterstützt uns mit Proben zur Auswertung. Nämlich, wir danken Sabine Windhorst für NIH3T3 Zellen, Andrea Mordhorst für YFP-Vinkulin und Maren Rudolph für RFP-Lifeact.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Mikroskop und Zubehör | |||
| SD-TIRF Mikroskop | Visitron Systems | ||
| Ti mit perfektem Fokussystem | Nikon | Inverses Mikroskopstativ | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Spinning Disk Unit in Dual-Kamera-Konfiguration | |
| iLAS2 | Roper Scientific | TIRF/FRAP-Scanner | |
| Evolve | Photometrix | EM-CCD-Kameras | |
| PiezoZ-Tisch | Ludl Electronic Products | Motorisierter Z-Tisch | |
| Bioprecision2 XY-Tisch | Ludl Electronic Products | Motorisierter XY-Tisch | |
| Inkubationskammer auf dem Tisch | Okolab | Bold Line | Temperatur, CO2 und Feuchtigkeitsversorgung |
| Zellkultur | |||
| HeLa-Gebärmutterhalskrebszellen | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3-Fibroblasten | DSMZ | ACC-59 | |
| Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA 0,05 | Gibco | 25300054 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Reduziertes Serummedium |
| Fötales Kälberserum (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Vollwachstumsmedium (DMEM ergänzt mit 10 % FCS und 1 % PenStrep) | |||
| TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | Transfektion Reagenz |
| Ascorbinsäure (AA) | Sigma | A544-25G | |
| 6-Well-Zellkulturplatte | Sarstedt | 83.392 | |
| Glasbodenschalen | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, 0.17mm Glasdeckglas |
| Fibronektin, Rinderplasma | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer verbesserte Kammer | VWR | 631-0696 | |
| TetraSpeck Kügelchen | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| PlasmideRFP-Lifeact | |||
| Maren Rudolph, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf, Deutschland | |||
| YFP-Vinculin | Andrea Mordhorst, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf, Deutschland | ||
| Software und PluginsVisiView | |||
| Visitron Systems | Version 3 | ||
| ImageJ | Version 1.52c | ||
| Turboreg Plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Makro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | diese Veröffentlichung | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Version 6.2.2 |
Referenzen
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
- Gustafsson, M. G. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
