Expansion des zwei-Dimension Electrospun Nanofaser Matten in drei Dimension Gerüste

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Technik der Expansion einer traditionellen, zwei-Dimension (2D) Electrospun Nanofaser-Matte in leska 3 Dimension (3D) durch die Druckentlastung der unterkritischen CO₂ Flüssigkeit. Diese erweiterte Gerüste sind 3D, eng mimischen zellulären Nanotopographic Hinweise, und bewahren die Funktionen der biologischen Moleküle innerhalb der Nanofasern gekapselt.

Zusammenfassung

Elektrospinnen wurde die bevorzugte Technologie in der Herstellung von synthetischen, funktionale leski aufgrund der Biomimetik, extrazelluläre Matrix und die einfache Kontrolle der Zusammensetzung, der Struktur und der Durchmesser der Fasern. Jedoch trotz dieser Vorteile traditionellen Electrospun Nanofaser kommen Gerüste mit Einschränkungen auch unorganisiert Nanofaser Orientierung, niedrige Porosität, kleiner Porengröße und hauptsächlich zweidimensionale Matten. Als solche gibt es ein großes Bedürfnis nach Entwicklung ein neues Verfahren zur Herstellung von Electrospun Nanofaser Scaffolds, die die oben genannten Einschränkungen überwunden werden können. Hier ist eine neue und einfache Methode beschrieben. Eine traditionelle 2D Nanofaser-Matte wandelt sich in ein 3D Gerüst mit gewünschten Stärke, Abstand, Porosität und Nanotopographic Signale, um Zelle zu Aussaat und Vermehrung durch die Druckentlastung der unterkritischen CO₂ Flüssigkeit zu ermöglichen. Neben ein Gerüst für die Regeneration des Gewebes auftreten, bietet diese Methode auch die Möglichkeit, die bioaktiven Moleküle wie antimikrobielle Peptide für lokale Medikamentenapplikation zu Kapseln. Die CO₂ erweitert Nanofaser Scaffolds halten großes Potenzial im Gewebe-Regeneration, Wundheilung, 3D Gewebe Modellierung und topischen Medikamenten.

Einleitung

Das Konzept für die Entwicklung einer synthetischen Gerüst, das Patienten zur Gewebereparatur und Regeneration Unterstützung implantiert werden kann ist eine, die dem Gebiet der regenerativen Medizin seit Jahrzehnten durchdrungen hat. Das ideale synthetischen Gerüst dient der Zellwanderung aus den umliegenden gesunden Gewebes zu induzieren, bietet eine Architektur für Zelle Aussaat, Adhäsion, Signalisierung, Proliferation und Differenzierung, unterstützt Vaskularisierung, ermöglicht eine ausreichende Sauerstoffzufuhr und Ernährung-Lieferung, und fördert die Host Immunaktivität um Erfolg nach Implantation¹zu gewährleisten. Darüber hinaus kann es als Träger verwendet werden für die Einbettung antimikrobielle Moleküle gerne bei Wundheilung^1,3,6,7,8,9. Die Fähigkeit zur Steuerung der zeitlichen Freisetzung dieser biologischen Moleküle aus synthetischen Gerüst ist ein weiteres wünschenswert Attribut, das gilt als Engineering¹Gerüste.

Elektrospinnen wurde eine gut genutzte Technik zur Herstellung von Nanofaser Scaffolds^1,2,3,4,5,6. Frühere Versuche, ein Nanofaser-Gerüst wie die hier diskutierten erstellen sind auf unterschiedlichem Erfolg durchgeführt worden. Allerdings haben traditionelle Nanofaser Scaffolds Fähigkeiten zur Erreichung dieser Ziele begrenzt. Traditionelle Nanofaser Scaffolds wurden meist zweidimensionale Matten^1,3. Diese nonexpanded Gerüste sind dicht mit kleinen Porengrößen gepackt; Dies schränkt Zelle eindringen, Migration und Differenzierung, da es nicht zur Förderung einer Umgebung ähnlich genug, um in Vivo^1,7,8,9zu finden. Aus diesem Grund wurden neuere Techniken der 3D Electrospun Nanofaser Gerüst Vorbereitung eingerichtet, um die inhärente Makel zu ändern, die mit 2D Nanofaser-Matten kommen. Diese Techniken führen zu 3D Gerüste; Allerdings haben sie Anwendbarkeit aufgrund der Produktionsmethoden erfordern wässrige Lösungen und Gefriertrocknung Verfahren beschränkt. Diese Verarbeitung führt die zufällige Verteilung der Nanofasern ohne eingeschränkte Organisation, richtige Dicke und/oder gewünschte Porosität, die angemessene Nanotopographic Cues bereitzustellen, die notwendig sind für Zelle Migration und Proliferation. Diese Faktoren führen zu der vorherigen 3D Electrospun Nanofaser Gerüste, die angemessene Nachahmung des Lebens fehlt Gewebe^1,7,8,9.

Neuere Versuche zur Entwicklung einer erweiterten, 3D Gerüst mit besseren Biomimetik der extrazellulären Matrix (ECM) sind durchgeführt worden, mit einer wässrigen Natrium Natriumborhydrid (NaBH₄) Lösung Behandlung und vordefinierten Formen zugunsten besserer Kontrolle über die Form der resultierenden Gerüst^7,8. Diese Methode ist jedoch nicht ideal, da es die Verwendung von wässrigen Lösungen, chemische Reaktionen und Gefriertrocknung erfordert, die stören können, mit Polymeren und gekapselten Biomoleküle, die wasserlöslich sind. Verwendeten Zusatzstoffe können auch Nebenwirkungen während Gewebe-Regeneration-^8,-⁹. Die CO₂ Erweiterung Methode in diesem Artikel beschriebenen stark reduziert die Verarbeitungszeit, eliminiert die Notwendigkeit für wässrige Lösungen und erhält den Betrag und die Funktionalität von biologisch aktiven Molekülen in einem größeren Ausmaß als die zuvor bewährte Methoden⁹.

In früheren Studien, Antibiotika, Silber, 1α, 25-Dihydroxyvitamin D-₃und antimikrobiellen Peptid waren LL-37 in Nanofaser Scaffolds geladen, einzeln und in Kombination zu untersuchen, das Potenzial dieser Gerüste, Agenten, um freizugeben Weitere Hilfe bei der Wundheilung^9,10,12,13. Für die Zwecke der Nachweis dieser Methode der Nanofaser Gerüst Expansion, wird Coumarine 6, einem Fluoreszenzfarbstoff in das Gerüst, um das Potenzial der Einbettung des Gerüsts mit verschiedenen gewünschten Verbindungen demonstrieren geladen werden. Diese Methode der erweiterten Nanofaser Gerüst Fertigung in Verbindung mit gekapselten bioaktiven Moleküle birgt ein großes Potenzial im Gewebe-Regeneration, Wundheilung, die Erstellung von 3D Gewebemodelle und die aktuelle Abgabe von Medikamenten.

Protokoll

Alle in-Vivo -Verfahren unten umrissen wurden vom IACUC an der University of Nebraska Medical Center genehmigt.

1. bereiten Sie die Lösungen für Standard Elektrospinnen

1. In einer Glasröhre 20 mL auflösen 2 g poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) in einem Lösungsmittelgemisch von Dichlormethan (DCM) und N, N-Dimethylformamid (DMF) mit einem 4:1-Verhältnis (V/V) in einer Konzentration von 10 % (w/V).
   Achtung: Griff DCM und DMF in einer gut belüfteten Kapuze, Belastung durch Dämpfe zu vermeiden. DCM Kunststoffe nicht aussetzen.
2. Legen Sie die Glasröhre in ein Labor-Rotator, bis die Lösung klar wird. Die Lösung kann über Nacht zu mischen.
3. Wenn bioaktive Materialien wie Peptide oder Drogen in das Gerüst zu integrieren beabsichtigen, eine eigene Lösung zu erstellen und bis zum Gebrauch bei 4 ° C lagern.
   1. Bereiten Sie die fluoreszierenden Farbstofflösung (50 mg/mL) mit 20 mL PCL-Lösung.

2. richten Sie die Elektrospinnen Apparatur (Abbildung 1A)

1. Fügen Sie hinzu, die PCL-Lösung eine 20 mL Spritze mit einer stumpfen 21 Gauge-Nadel befestigt. Stellen Sie sicher, dass keine in der Spritze und die damit verbundenen Schläuche Luft.
2. Platzieren einer rotierenden Stahltrommel mit Erdkollektoren 12 cm von der Spitze der Nadel.
3. Mit Krokodilklemmen, schließen Sie das Netzteil High Voltage Direct Current (DC) zur Nadel und sicherzustellen Sie, dass der Kollektor geerdet ist.
   Achtung: Schalten Sie die Stromversorgung vor dem Umgang mit jedem verbundenen Materialien.

3. Elektrospinnen

1. Für die 20 mL PCL-Lösung, stellen Sie die Parameter der Spritzenpumpe wie folgt: Durchmesser = 20,27 mm, Volumenstrom = 0,5 mL/h Check, wenn die Tropfen an der Spitze der Nadel bilden.
2. Wenn die Einbeziehung der bioaktiven Moleküle gewünscht wird, den Apparat zu ermöglichen, co-axial Elektrospinnen (Abbildung 1 b)eingerichtet. Erstellen Sie eine benutzerdefinierte Koaxial Düse mit Injektionsnadeln.
   Hinweis: Diese Düsen sind auch im Handel erhältlich. Beachten Sie, dass eine Lösung des Farbstoffes bereit ist, das Hinzufügen von solchen Molekülen zu simulieren.
   1. Bereiten Sie eine 1 % ige Lösung von Leuchtstofffärbung Cumarin 6 im Wasser. Eine kleine Spritze 3 mL 1 % Farbstoff hinzufügen. Verbinden Sie die Spritze mit der gleichen Koaxial Düse als PCL-Lösung. Wieder einmal sicherstellen Sie, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
   2. Für diese 3 mL Lösung, stellen Sie die Parameter der Spritzenpumpe wie folgt: Durchmesser = 9,49 mm, Volumenstrom = 0,02 mL/h Check, wenn die Tropfen an der Spitze der Nadel bilden.
3. Wenden Sie eine elektrische Spannung von 20 kV zwischen Spinndrüse (22-Gauge-Nadel) und ein Erdkollektor befindet sich 20 cm weg von der Spinndüse. Sammeln Sie die ausgerichteten Nanofaser-Matten in einer Trommel mit 2.000 u/min drehen. Die PCL-Nanofaser-Matten zu sammeln, sobald sie eine Dicke von ~ 1 mm erreichen.

4. Generation von PCL Nanofaser Matten mit angeordneten Löchern.

1. PCL Nanofaser Matten zu fabrizieren.
   1. Lösen Sie PCL-Perlen in einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus DCM und DMF mit einem Verhältnis von 4:1(v/v) in einer Konzentration von 10 % (PCL) (w/V auf). Pumpen die PCL-Lösung mit einer Durchflussrate von 0,7 mL/h über eine Spritzenpumpe während ein Potenzial von 20 kV zwischen Spinndrüse (22-Gage Nadel) angewendet wird und ein geerdeter Sammler befindet sich 12 cm neben der Spinndüse.
   2. Die Nanofaser-Membran mit einer rotierenden Trommel mit einer rotierenden Geschwindigkeit größer als 500 u/min zu sammeln.
2. Tauchen die PCL Nanofaser Matten in Flüssigkeit N₂ für 5 min (i.e., steif). Halten Sie die PCL-Nanofaser-Matten in Flüssigkeit N₂ und Punsch PCL Nanofaser Matten mit einer 0,5 mm Durchmesser.

5. Ausbau der 2D Nanofaser Matten mit/ohne angeordneten Löchern über unterkritischen CO₂ Flüssigkeit (Abbildung 2).

1. Legen Sie die PCL-Nanofaser-Matten in flüssigem Stickstoff für 5 min und schneiden in 1 x 1 cm Quadrate mit scharfen chirurgische Schere während in flüssigen Stickstoff getaucht um zu Verformungen der Kanten zu vermeiden.
2. Legen Sie die geschnittene Matte in eine 30 mL Zentrifugenröhrchen mit ~ 1 g des Trockeneises. Fest den Deckel Kappe und ermöglichen das Trockeneis in flüssigem CO₂zu ändern.
3. Sobald Flüssigkeit in der Röhre gebildet hat, lassen Sie schnell den Druck durch Öffnen der Kappe.
   Achtung: Verwenden Sie geeignete thermische Schutzausrüstung beim Umgang mit flüssigem Stickstoff und Trockeneis. Öffnen Sie das unter Druck stehende Rohr auf das Gesicht nicht. Die Zentrifugenröhrchen sollten nicht mehrfach verwendet werden.
4. Entfernen Sie und beobachten Sie die gepufften Gerüst aus der Tube. Legen Sie das Gerüst in einem neuen Zentrifugenröhrchen mit Trockeneis und wiederholen Sie, bis die gewünschte Dicke erreicht ist. Die erweiterte Nanofaser Scaffolds in Ethylenoxid vor der Inkubation mit Zellen zu sterilisieren.

6. Charakterisierung der erweiterten Nanofaser Scaffolds

1. Die Morphologie und Struktur der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit erweiterten Nanofaser-Gerüste zu charakterisieren.
   1. Die Proben mit Doppelklebeband leitfähigen metallischen Stud und Mantel mit Platin für 40 s mit einem Sputter Coater auf 40 mA.
   2. Untersuchen Sie die Fasern mit SEM nach früheren Studien⁹. Sammle die Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV.
2. In Vitro Freisetzung Profile und Bioaktivität von freigegebenen Peptide zu charakterisieren.
   1. Gewicht 10 mg Nanofaser Membranen vor und nach der Erweiterung im CO₂.
   2. Tauchen Sie die Proben in PBS-Puffer und sammeln Sie 10 μl des Überstandes zu verschiedenen Zeitpunkten (0-28 Tage).
   3. Verwenden Sie Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) Kit, um die LL-37-Peptid-Konzentration in der gesammelten überstand zu quantifizieren.
3. Überprüfen Sie zelluläre Infiltration in Vivo und Host Antwort.
   1. Setzen Sie die 9 - Wochen alten Sprague-Dawley (SD) Ratten in einer Narkose-Kammer, verbinden mit Isofluran Dampf und die Ratten zu betäuben. Übertragen Sie die Ratten auf einem Operationstisch, nachdem die Ratten komplette Anästhesie ohne Gefühle werden. Die Ratten mit einer Isofluran-Prüfkopf mit Verdampfer während der Operation kontinuierlich zu betäuben. Das Haar der Ratte in den Rücken von einem Tier Rasierer zu rasieren und mit Jod und Alkohol Haut Peeling zu sterilisieren. Subkutane Taschen über 1,5 cm Einschnitte an supraspinalen Standorten auf den Handrücken mit einem Skalpell zu erstellen.
   2. Einfügen Sie eine erweiterte Nanofaser Gerüst (1,5 mm Dicke) in die subkutanen Tasche mit einer Pinzette für jeden Schnitt. Schließen Sie den Schnitt mit einem Hefter.
   3. Bei 1 einschläfern 2 und 4 Wochen die Ratten mit 95 % CO₂. Sezieren Sie sanft die modellabhängigen und das umliegende Gewebe mit einer chirurgischen Schere. Vor der histologischen Untersuchung des Gewebes in Formalin für mindestens 3 Tage Tauchen, und dann mit Paraffin einbetten. Abschnitt des Gewebes mit einem Mikrotom, dann führen Sie Hämatoxylin und Eosin (H & E), Masson trichrome Färbung.

Ergebnisse

Die Wirksamkeit der Erweiterung traditionelle 2D Electrospun Nanofaser Matten in 3D Gerüste über Druckentlastung der unterkritischen CO₂ Flüssigkeit zeigte sich in verschiedenen Funktionen: die Dicke der Gerüste von 1 mm bis 2,5 mm unbehandelt erhöht und 19,2 mm mit einem oder zwei CO₂ Behandlungen, bzw. (Abb. 3A-C). Die Porosität-ein Merkmal der Architektur entscheidend für die Zelle Aussaat-auch in die erhöhte Dicke (<...

Diskussion

Traditionelle 2D Electrospun Nanofaser Matten verwandeln in erweiterten 3D Gerüste, die über CO₂ Druckentlastung untersucht wurde. Traditionelle 2D Nanofaser-Matten sind erfolgreich erweiterte über unterkritischen CO₂ Flüssigkeit. Die entscheidenden Schritte sind 2D Nanofaser Matten unter einer optimierten Zustand herzustellen und schneiden Sie die Matten ohne Verformung der Kanten (zB. mit scharfen chirurgische Schere). Diese CO-₂-erweiterte Nanofaser Scaffolds...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polycaprolacton	Sigma-Aldrich	440744
N,N-Dimethlyformamid	Fisher Chemical	D-199-1
Dichlormethan	Fisher Chemical	AC61093-1000
Cumarin 6	Sigma-Aldrich	546283
rotierende Stahltrommel	kundenspezifisch		Dies dient als Kollektor beim Elektrospinnen.
Spritzenpumpe	Fisher Scientific	14-831-200	das koaxiale Spinnen sind zwei Einzelspritzenpumpen erforderlich.
Revolver	Lab Net International	H5600	Einstellbarer Laborrotator zum Mischen von Lösungen
Injektionsnadel (27G x 1 1/2")	EXCELINT International Co	26426	Dies ist Teil des gezeigten Beispiels für eine kundenspezifische Koaxialdüse
Injektionsnadel (21G x 1 1/2")	EXCELINT International Co	26416	Dies ist ein Teil des gezeigten Beispiels für eine kundenspezifische Koaxialdüse
Hochspannungs-Gleichstromversorgung	Gamma Hochspannungsforschung	ES30
Rasterelektronenmikroskop	FEI	Nova 2300
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axio Imager 2
LL 37 ELISA Kit	Hycult Biotech	HK321-02

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