Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.
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Methodenartikel
Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern. Infolgedessen hat die Nachfrage nach effektiven Herzmuskelzellen Therapien motiviert, Forscher in der Stammzelle und Bioengineering Felder in Vitro High-Fidelity-menschlichen Myokard für Grundlagenforschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Die unreife Phänotyp der Herzmuskelzellen ist jedoch eine Beschränkung auf den Erhalt von Gewebe, die funktionell die adulten Myokard imitieren charakterisiert vor allem durch mechanische und elektrische Signale. Somit ist der Zweck dieses Protokolls zu bereiten und Reifen der Ziel-Zell-Population durch elektromechanische Stimulation Rekapitulation physiologische Parameter. Herzgewebe Engineering entwickelt sich in Richtung mehr biologische Ansätze und Strategien basierend auf biophysikalische Reize, so sind an Dynamik gewinnt. Für diesen Zweck entwickelte Gerät ist einzigartig und ermöglicht individuelle oder gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, sorgfältig gekennzeichnet und validiert. Zusätzlich, obwohl die Methodik dieser Stimulator und einer bestimmten Zellpopulation optimiert wurde, kann es leicht auf andere Geräte und Zell-Linien angepasst werden. Die Ergebnisse hier bieten Beweis für das erhöhte kardiale Engagement der Zellpopulation nach elektromechanische Stimulation. Elektromechanisch stimulierte Zellen zeigen einen erhöhte Ausdruck der wichtigsten kardialen Marker, einschließlich der frühen, strukturellen und Calcium-regulierende Gene. Diese Zelle Klimaanlage könnte für weitere regenerative Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Hochdurchsatz-Drogen-Screening nützlich sein.
Einleitung
Herz-Funktion basiert auf der Kopplung von elektrischen Erregung und mechanische Schrumpfung. Kurz, Cardiomyocyte interzelluläre Verbindungen ermöglichen elektrische Signalausbreitung fast synchronen Kontraktionen des Herzens, Blut zu Pumpen systemisch und durch Lungensystems produzieren. Herzzellen, unterziehen damit, elektrische und mechanische Kräfte, die Genfunktion Ausdruck und Mobilfunk zu regulieren. Dementsprechend haben viele Gruppen, Kultur-Plattformen entwickeln, die die kardiale physiologische Umgebung um zu verstehen, die Rolle der mechanischen und elektrischen Stimulation auf kardiale Entwicklung, Funktion und Reifung zu imitieren versucht. In-vitro-....
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Protokoll
Diese Studie wird menschliche Herz ATDPCs von Patientenproben verwendet. Ihre Nutzung durch die lokale Ethikkommission genehmigt wurde, und alle Patienten gab informierte Zustimmung. Das Studienprotokoll passt sich an die Grundsätze, die in der Deklaration von Helsinki.
1. Vorbereitungen
- Autoklav zwei Pinzetten, 12 Platinelektroden PTFE für elektrische Stimulation und einige Papiertücher, bei 121 ° C für 20 Minuten.
-
Sterilisieren Sie 12 PDMS maßgeschneiderte Konstrukte (Abb. 1A).
- Waschen Sie jedes Konstrukt mit 5 mL sterilem, destilliertem Wasser mit magnetischen ....
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Ergebnisse
Abbildung 2 stellt das allgemeine Schema für die Zellstimulation gefolgt. Kurz, wurden Zellen ausgesät auf das PDMS-Konstrukt und elektromechanische Stimulation mit einem Medienwechsel zweimal pro Woche durchgeführt. Nonstimulated Zellen dienten als Kontrolle für die elektromechanische Konditionierung. Darüber hinaus wir das Experiment ein zusätzliches Steuerelement hinzugefügt, und subkutane ATDPCs dienten als Kontrolle für kardiale ATDPCs. Von subkutanem Fe.......
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Diskussion
Elektromechanische Stimulation scheint eine sichere Alternative für die Vorbereitung einer feindlichen Umgebung kardialen Zellen und Stärkung ihrer kardialen Engagements sein. Hier berichtet ein Protokoll beschrieben für kardiale Vorläuferzellen erhöht den Ausdruck der wichtigsten kardialen Marker und wurde für ihre nächste Implantation auf murinen Infarzierte Myokard30vorteilhaft. Im Allgemeinen erhöht elektromechanisch stimuliert kardiale ATDPCs die Expression von Genen im Zusammenhang mit frühe.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offen zu legen, außer dass die Stimulationsvorrichtung und das Protokoll bereits patentiert wurden, (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).
Danksagungen
Die Autoren möchten den Mitgliedern des ICREC Research Program (IGTP, Badalona) und die elektronische und biomedizinische Messtechnik Gruppe (UPC, Barcelona), vor allem Prof. J. Rosell-Ferrer danken. Darüber hinaus bestätigen die Autoren Stammzellen Translational Medicine Journal und AlphaMed Presse erlaubt die Anpassung der zuvor veröffentlichten Zahlen (Llucià-Valldeperas, Et al. 30). die Entwicklung dieses Prototypen und das Design des Protokolls wurden vom Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF-2014-59892), die Europäische Kommission unterstützt 7. Rahmenprogramm () RECATABI....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| stimulator | |||
| Supermagnete | Q-10-10-05-N | ||
| vernickelte Neodym-Magnete | Supermagnete | Q-06-04-02-HN | |
| Polydimethylsiloxan (PDMS) SYLGAR 184 Silikon-Elastomer-Kit | Dow Corning Corp | 184 | |
| liniertes Beugungsgitter (1250 Rillen/mm) | Newport | 05RG150-1250-2 | |
| Motorsteuerung | Faulhaber | MCLM-3006-S | |
| Labview | National Instruments | ||
| Zellkultur | |||
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | 70013-065 | |
| 0,05 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-120 | |
| 35 mm Zellkulturschale | BD Falcon 45353001 | ||
| fötales Rinderserum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| L-Glutamin 200 mM, 100x | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina/Streptomicin, 10.000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Minimum essentielles Medium Eagle (alfa-MEM) | Sigma | M4526-24x500ML | |
| Protein & RNA-Analysen | |||
| Protein Kit | Qiagen | 50980404 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Qiagen | 79236 | ||
| TaqMan PreAmp MasterMix 2x | Applied Biosystems | 4391128 | |
| TaqMan Universal PCR MasterMix | Applied Biosystems | 4324018 | |
| Immunostaining10 | |||
| % | Formalin Sigma | HT-501128-4L | |
| Pferdeserum | Sigma | H1138 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Rinderserum Albumina (BSA) | Sigma | A7906-100G | |
| PARAFILM | Sigma | P6543 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Phalloidin Alexa 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Natriumazid | Sigma | S8032-100g | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| Connexin-43 Kaninchen Primärantikörper | Sigma | C6219 Los#061M4823 | |
| Sarkomerischer α-Aktinin Maus Primärantikörper | Sigma | A7811 Los#080M4864 | |
| GATA-4 Ziegen-Primärantikörper | R& D | AF2606 VAZ0515101 | |
| MEF2 Kaninchen Primärantikörper | Santa Cruz | sc-313 Los#E0611 | |
| SERCA2 Ziege Primärantikörper | Santa Cruz | sc-8095 Los#D2709 | |
| Cy3 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | |
| Cy3 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 715-165-151 | |
| Cy3 Sekundärantikörper Antikörper | Jackson ImmunoResearch | 712-165-150 | |
| Cy2 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 715-225-150 | |
| Cy2 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | |
| Cy2 Sekundärantikörper | Jackson ImmunoResearch | 705-225-147 |
Referenzen
- McDonough, P. M., Glembotski, C. C. Induction of atrial natriuretic factor and myosin light chain-2 gene expression in cultured ventricular myocytes by electrical stimulation of contraction. Journal of Biological Chemistry. 267, 11665-11668 (1992).
- Tandon, N., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
