Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Zusammenfassung

Präsentiert wird hier ein Protokoll, das ein in vitro neural-endotheliales Kokultursystem und die metabolische Einbeziehung von Sialoglycan mit bioorthogonalen funktionellen Gruppen kombiniert, um primäre neuronale Stamm- und Vorläuferzellen zu erweitern und ihre Oberfläche zu beschriften. sialoglycoproteinzur Bildgebung oder Massenspektrometrieanalyse von Zelloberflächenmarkern.

Zusammenfassung

Neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) sind die zelluläre Basis für die komplexen Strukturen und Funktionen des Gehirns. Sie befinden sich in spezialisierten Nischen in vivo und können isoliert und in vitroerweitert werden und dienen als wichtige Ressource für die Zelltransplantation, um Hirnschäden zu reparieren. NSPC sind jedoch heterogen und auf molekularer Ebene nicht klar definiert oder werden aufgrund des Fehlens spezifischer Zelloberflächenmarker gereinigt. Das vorgestellte Protokoll, das bereits berichtet wurde, kombiniert ein neuronal-endotheliales Kokultursystem mit einer metabolischen Glykan-Etikettierungsmethode, um das Oberflächen-Sialoglycoproteom der primären NSSPCs zu identifizieren. Das NSPC-endotheliale Kokultursystem ermöglicht die Selbsterneuerung und -erweiterung von primären NSPCs in vitround erzeugt eine ausreichende Anzahl von NSPCs. Sialoglycans in kultivierten NSPCs werden mit einem unnatürlichen Sialsäure-Metabolur-Reporter mit bioorthogonale funktionelle Gruppen. Durch den Vergleich der sialoglycoproteome aus sich selbst erneuernden NSPCs, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert wurden, mit der Differenzierung der neuronalen Kultur identifizieren wir eine Liste von Membranproteinen, die in NSPCs angereichert sind. Im Einzelnen umfasst das Protokoll: 1) Einrichtung einer NSPC-endotheliale Kokultur und NSPC-Differenzierungskultur; 2) Etikettierung mit Azidozucker pro-O-acetyliertem N-Azidoacetylmannosamin (Ac₄ManNAz); und 3) Biotinkonjugation zu modifiziertem Sialoglycan zur Bildgebung nach Fixierung der neuronalen Kultur oder Proteinextraktion aus der neuronalen Kultur zur Massenspektrometrieanalyse. Anschließend werden die NSPC-angereicherten Oberflächenmarker-Kandidaten durch vergleichende Analyse von Massenspektrometriedaten sowohl aus dem erweiterten NSPC als auch aus differenzierten neuronalen Kulturen ausgewählt. Dieses Protokoll ist hochsensibel für die Identifizierung von Membranproteinen mit geringem Überfluss in den Ausgangsmaterialien und kann auf die Marker-Erkennung in anderen Systemen mit entsprechenden Modifikationen angewendet werden.

Einleitung

Neuronale Stammzellen sind definiert als eine multipotente Zellpopulation, die sich selbst erneuern kann, um einen Stammzellpool zu erhalten und sich in Neuronen und Glia zu differenzieren. Sie sind die wichtigsten Zelltypen im Nervensystem und können großes therapeutisches Potenzial in der regenerativen Medizin durch Zelltransplantation in kranke und verletzte Gehirne^{bieten 1,2}. Mit der Entwicklung wird die neuronale Stammzellpopulation heterogen^3,4, und der Anteil der neuronalen Stammzellen im Gehirn nimmt allmählich ab⁵. Im Allgemeinen befinden sich embryonale neuronale Stammzellen und andere neuronale Vorläuferzellen, kollektiv als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) bezeichnet, in den Keimzonen, der ventrikulären Zone und der subventrikulären Zone in Mäusen⁶. Im embryonalen Gehirn erzeugen neuronale Stammzellen Neuronen direkt oder indirekt über zwischengeschaltete Vorläuferzellen (IPCs) und bei einigen Arten durch die äußeren subventrikulären Zonenvorläufer (oRGs)^7,8. Die spezifische molekulare Signatur, Morphologie, Lage in der Stammzellnische und Differenzierungspotenzial bestimmen die Rolle jedes Subtyps bei der Hirnorganogenese und klinischen Anwendungen⁹. Die derzeit verfügbaren Zelloberflächenmarker können jedoch verschiedene Subtypen von NSPCs nicht eindeutig unterscheiden und reinigen, was das Verständnis und die Nutzung dieser Subtypen einschränkt.

Die Identifizierung der primären NSPCs-Oberflächenmarker wird durch drei Haupthürden begrenzt. Die erste ist die begrenzte Zellanzahl von NSPCs im Gewebe, was es schwierig macht, Zelloberflächenproteinproben für eine gemeinsame Massenspektrometrieanalyse vorzubereiten. Die zweite Einschränkung ist die Schwierigkeit bei der Herstellung reiner Zellsubtypen zur Erzeugung subtypspezifischer Membranproteindaten. Die dritte Herausforderung schließlich ist das niedrige Verhältnis von Zelloberflächenproteinen in ganzen Zellproteinen, das ihre Nachweisempfindlichkeiten durch Massenspektrometrieanalyse behindert.

Um diese Probleme zu überwinden, entwickelten wir einen chemoprotemischen Ansatz zur selektiven Anreicherung und Identifizierung von Zelloberflächenproteinen in primären NSPCs durch metabolische Kennzeichnung der Sialoglycoproteine¹⁰. Um eine ausreichende Anzahl von NSPCs zu generieren, nutzten wir ein etabliertes Protokoll, um primäre embryonale NSPS in undifferenzierten Zuständen in vitro zu erweitern und zu erhalten, indem wir NSPCs mit Maushirn-Endothelzelllinien mit einer durchlässigen Unterstützung kokultieren. Matrixeinsatz(z.B. Transwell) System¹¹. Im Gegensatz dazu erzeugen NPSCs, die allein ohne Endothelzellen kultiviert werden, eine differenzierte Nachkommenschaft^11,12. So können Proteinproben aus diesen beiden Kultursystemen vergleichsweise analysiert werden, um Proteine zu identifizieren, die differenziell in NSPCs und differenzierten Neuronen exprimiert werden. Da die meisten Zelloberflächenproteine durch Sialinsäure¹³modifiziert werden, wurde der unnatürliche Sialinsäurevorläufer analog N-Azidoacetylmannosamin-Tetraacylatd (Ac₄ManNAz) verwendet, um den intrinsischen Stoffwechselweg zu kapern, so dass endogene, neu synthetisierte Sialoglykane werden mit Azido-Gruppen beschriftet, wodurch ein chemischer Griff¹⁴erzeugt wird. Durch azido-alkyne-vermittelte bioorthogonale Reaktionen, die Biotin zu Sialoglycans konjugieren, können Zelloberflächenproteine visualisiert und zur proteomischen Identifizierung durch ein Streptavidin-gekoppeltes Fluorophor oder Matrix¹⁴angereichert werden.

Hier führen wir die Färbung der SDS-PAGE-Gelanalyse der Oberfläche sialoglycoproteome von NSPCs durch, die in einer endotheliaalen Kokultur erweitert sind und Zellen in einem Nicht-Kokultursystem differenzieren. Wir reinigen auch selektiv Oberflächensialoglycoproteome in den beiden Kultursystemen für den proteomischen Vergleich. Unser Protokoll, verglichen mit den traditionellen zentrifugationsbasierten Zelloberflächenreinigungsprotokollen¹⁵, erhöht die Extraktionswirksamkeit durch Reduzierung der Oberflächenproteinextraktionsverfahren durch spezifische Tag-Konjugation und Affinität reinigung. In der Zwischenzeit erhöht es die Extraktionsreinheit von Zelloberflächenproteinen auf der Grundlage der Prämisse, dass Sialylierung vor allem an den Zelloberflächenproteinen stattfindet. Obwohl endotheliale Faktoren die Differenzierung erweiterter NSPC nicht vollständig blockieren können, bietet die vergleichende Studie zwischen einer Kokultur und einer differenzierten Kultur eine bequeme Methode, um mit Stammzellen angereicherte Oberflächenproteine zu lokalisieren, ohne dass Proteine aus NPCs zu analysieren, die durch FACS¹⁶gereinigt werden. Wir glauben, dass dieser Ansatz auf Studien von Oberflächenproteinen in anderen Systemen mit den entsprechenden Modifikationen angewendet werden kann.

Protokoll

Alle in dieser Studie verwendeten Tierprotokolle wurden vom IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) der Tsinghua University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des IACUC durchgeführt. Die Labortieranlage der Tsinghua University wurde von der AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) akkreditiert. Für die Inszenierung von Embryonen wurde der am Mittag des identifizierten Vaginalsteckers als Embryonaltag 0,5 (E0.5) berechnet.

HINWEIS: Alle Zellen werden im Zellinkubator unter Bedingungen von 37 °C und 5%_CO2kultiviert.

1. Vorbereitung der Maus Endothelkultur in durchlässigen Stützeinsätzen

HINWEIS: BEND3-Zellen werden gemäß den Anweisungen des Herstellers gepflegt.

1. Bereiten Sie BEND3 Zellmedium (BM) vor, indem Sie 50 ml FBS und 5 ml Penicillin-Streptomycin in 500 ml DMEM einteilen und gut mischen.
2. Das Medium aus der Schale absaugen und die BEND3-Zellenkultur einmal mit 1 ml PBS waschen. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in die Zellen und inkubieren Sie die Zellen für 4 min bei 37 °C.
3. Fügen Sie 1 ml BM in die Zellen, um Trypsin-EDTA und Pipette sanft nach oben und unten zu neutralisieren, um die Zellen vollständig zu dissoziieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 15 ml konisches Rohr und Pellet durch Zentrifugation bei Raumtemperatur (RT) für 5 min bei 400 x g.
4. Aspirieren Sie den Überstand aus dem Rohr und suspendieren Sie die Zellen mit 9 ml frischem BM, dann fügen Sie 1 ml Zellsuspension in einen durchlässigen Stützeinsatz. Fügen Sie weitere 2 ml frisches BM pro Brunnen in der unteren Kammer der Matrix hinzu. Fahren Sie mit der Kultur der Zellen für einen Tag fort.

2. Vorbereitung der primären kortikalen NSPC-Kultur der Maus

1. Zubereitung von Kulturplatte, Papainverdauungsmedium und kortikalhaftes Kulturmedium (AM)
   1. Mantel 6-Well-Platten mit Poly-L-Lysin (PLL) durch Zugabe von 1 ml PLL-Lösung pro Well in 6-Well-Platten. Dann inkubieren Sie die Platten bei RT für 30 min.
   2. Übertragen Sie die PLL-Lösung in ein 15 ml konisches Rohr. Waschen Sie die Platten 3 mal mit doppelt destilliertem Wasser. Die Platten lüften und bis zum Gebrauch beiseite legen.
   3. Bereiten Sie das Papain-Verdauungsmedium vor, indem Sie 50 U Papain, 50 L L L-Glutamin und 50 l 100 mg/ml Acetyl-L-Cystein in 5 ml DMEM einteilen. Mischen Sie das Medium kurz und erwärmen Sie es auf 37 °C für 30 min für die Enzymaktivierung.
   4. Bereiten Sie das kortikale Zellhafte Kulturmedium (AM): 500 l L-Glutamin, 500 l Natriumpyruvat, 500 l von 100 mg/ml N-Acetyl-L-Cystein, 500 l N2, 1 ml B27 und 5 l von 100 g/ml bFGF in 50 ml DMEM hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut und erwärmen Sie es vor Gebrauch auf 37 °C.
2. Herstellung von primären zerebralen kortikalen Zellen und anschließender Beschichtung
   1. Opfern Sie eine e10.5 getächte schwangere Maus durch Zervix-Dislokation.
      HINWEIS: Bei E10.5 vermehren sich die meisten Zellen in der Großhirnrinde, was zu großen Klonen von Nachkommen in vitro führt.
   2. Sterilisieren Sie den Bauch um 75% Ethanol. Verwenden Sie feine Schere und mikrogezackte Zangen, um den Bauch zu öffnen, indem Sie die Haut und den darunter liegenden Muskel entlang der rechten Seite der Mittellinie schneiden. Entfernen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit gezackten Zangen aus der Bauchhöhle und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere aus der Bauchhöhle.
   3. Waschen Sie die Gebärmutter mit 40 ml vorgekühlten HBSS in 10 cm Petrischale. Dann die Gebärmutter in eine neue 10 cm Petrischale geben und mit 40 ml vorgekühltem HBSS wieder waschen.
   4. Die Gebärmutter in eine neue 10 cm Petrischale mit 40 ml vorgekühltem HBSS geben. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und der Fruchtwassermembran, und schneiden Sie dann die Köpfe der Embryonen mit Jewelers Microforceps von den Stämmen ab.
   5. Die Köpfe mit 40 ml vorgekühltem HBSS waschen und die Köpfe auf eine neue 10 cm Petrischale mit 40 ml vorgekühltem HBSS übertragen. Verwenden Sie Jewelers Microforceps, um Haut und Knorpel, die das Gehirn bedecken, zu schälen, schneiden Sie dann die Zerebralparese ab und sammeln Sie sie in einem 15 ml konischen Rohr mit vorgekühltem HBSS.
   6. Pellet die Kortiken durch Zentrifugation für 3 min bei 4 °C und 300 x g. Aspirieren Sie den Überstand aus der Röhre, dann fügen Sie aktivierte Papain-Verdauungmittel und 15 l von 4 mg/ml DNase I in das Gewebepellet.
   7. Das Gewebepellet durch sanftes Wirbeln kurz aussetzen. Inkubieren Sie das Gewebe bei 37 °C für 30 min. Während dieser Zeit, lockern Sie das Gewebe durch kurze Wirbel alle 10 min.
      HINWEIS: Am Ende der Verdauung sollten keine sichtbaren Gewebestücke in der Röhre vorhanden sein.
   8. Pellet die kortikalen Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 4 °C und 450 x g. Den Überstand aus dem Rohr ansaugen und das Zellpellet mit vorgekühltem DMEM waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
      HINWEIS: Achten Sie beim Verdauen und Waschen darauf, das Gewebe und das Zellpellet nicht grob zu pipetten, um eine Schädigung der Zellen mit einer starken Scherkraft zu vermeiden.
   9. Aspirieren Sie den Überstand aus dem Rohr und fügen Sie dann 1,5 ml vorgekühlten HBSS in das Rohr. Dissoziieren Sie das kortikale Zellpellet in einzelne Zellen mit sanfter Pipettierung. Zählen Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer.
   10. Fügen Sie 2 ml AM und 2 x 10⁴ kortikale Zellen pro Brunnen in 6-Well-Platten hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5%_CO2 für 3 h, um die Zellen an der Platte anbringen zu lassen.

3. Aufbau von neural-endotheliale Kokultur und Ac₄ManNAz Etikettiersystem

1. Einen Tag nach dem Plattieren von BEND3-Zellen in den Einsätzen, saugen Sie das Medium in der unteren Kammer zuerst sanft an, dann die Einsätze. Waschen Sie die Einsender der Einsätze 3 mal mit vorgewärmtem DMEM. Waschen Sie die Außenfläche der Einsätze durch Spülen mit vorgewärmten DMEM.
2. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes AM in einen Einsatz ein, und übertragen Sie die Einsätze dann mit primären kortikalen Zellen in die Brunnen. Inkubieren Sie die Co-Kultur bei 37 °C und 5%_CO2 für 12 h.
3. Ac₄ManNAz in DMSO auflösen, um eine Lagerkonzentration von 200 mM zu erreichen. 12 h nach dem Einrichten der neuronalen endothelialen Kokultur, fügen Sie 1 l Ac₄ManNAz-Bestand pro Bodenkammer und 0,5 l Lager pro Einsatz in die Co-Kultur hinzu. Schütteln Sie die Platten sofort und sanft, um das Medium gut zu mischen. Fügen Sie für die Steuerzellen das gleiche Volumen von DMSO hinzu.
4. Kultur die Zellen für weitere 5 Tage bei 37 °C und 5%_CO2. Bereiten Sie das AM mit 10x bFGF als Nachspeisemedium (RM) vor. Während dieser Zeit fügen Sie 100 l RM pro Einsatz und 200 l RM pro Bodenkammer hinzu, um die endothelialen und neuronalen Zellen jeden zweiten Tag wieder einzuspeisen. Während der Nachfütterung nicht Ac₄ManNAz oder DMSO in die Kultur liefern.

4. Immunfluoreszenzfärbung von Sialoglycoproteinen in erweiterten primären NSPCs und differenzierten Neuronen

1. Bereiten Sie BTTAA-CuSO₄ Komplex 1 30x Vorrat mit 1,5 mM CuSO₄ und 9 mMBTTAA in doppelt destilliertem Wasser vor. Bereiten Sie frisch biotinkonjugierten Puffer 1 mit 50 M Biotin-Alkyn, 2,5 mM Natriumascorbat und 1x BTTAA-CuSO_4-Komplex in PBS vor.
2. Entfernen Sie die Einsätze von den Co-Kultur-Platten. Saugen Sie das Kulturmedium aus den unteren Brunnen und waschen Sie die Nervenzellen einmal mit vorgewärmten PBS.
3. Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen. Fügen Sie 1 ml vorgekühlte 4% Paraformaldehyd-PBS-Lösung pro Brunnen in die Zellen ein und fixieren Sie die Zellen bei RT für 10 min. Dann waschen Sie die Zellen 3 mal mit vorgekühlten PBS.
4. PBS aus den Brunnen ansaugen und 1 ml frisch zubereiteten biotinkonjugierten Puffer 1 pro Brunnen in die Zellen geben. Inkubieren Sie die Zellen bei RT für 10 min.
5. Saugen Sie den Reaktionspuffer aus den Brunnen. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS. Bereiten Sie den Färbepuffer vor, der 1% FBS und 1 g/mL Alexa Fluor 647-streptavidin enthält. Fügen Sie 1 ml Färbepuffer pro Bohrung in die Zellen ein und inkubieren Sie die Zellen bei RT für 30 min.
6. Saugen Sie den Färbepuffer aus den Brunnen und gewaschenen Zellen 3 mal mit vorgekühlten PBS. Bereiten Sie den Sperrpuffer vor, der 5% BSA und 0,3% nichtionisches Waschmittel-100 in PBS enthält. Fügen Sie 1 ml Sperrpuffer pro Bohrplatz in die Zellen ein und brüten Sie bei RT 10 min.
7. Bereiten Sie eine primäre Antikörperlösung vor, indem Sie die Antikörper gegen Nestin und Anti-S-Tubulin III zusammen in den Blockierpuffer im Verhältnis von 1:20 bzw. 1:1.000 verdünnen. Entfernen Sie den Sperrpuffer aus den Brunnen und fügen Sie 1 ml primäre Antikörperlösung pro Bohrung in die Zellen ein. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C über Nacht.
8. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus den Brunnen. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS. Bereiten Sie eine sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG1, Alexa Fluor 546 Ziege Anti-Maus IgG2b und DAPI zusammen in Blockierpuffer bei einer Verdünnung von 1:1.000 verdünnen. Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen und fügen Sie 1 ml sekundäre Antikörperlösung pro Brunnen in die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen bei RT für 2 h.
9. Die Antikörperlösung aus den Brunnen ansaugen und die Zellen 3 Mal mit vorgekühltem PBS waschen. Danach sind die Zellen für die Bildaufnahme bereit.

5. Reinigung von Sialoglycoproteinen aus erweiterten primären NSPCs und differenzierten Neuronen

1. Bereiten Sie BTTAA-CuSO₄ Komplex 2 15x Vorrat mit 1,5 mM CuSO₄ und 3 mMBTTAA in doppelt destilliertem Wasser vor. Herstellung des Proteinresuspensionspuffers A mit 4% SDS und 10 mM EDTA in doppelt destilliertem Wasser; Protein-Resuspensionspuffer B mit 150 mM NaCl, 50 mM Triethanolamin und 1% Polyoxyethylenoleylether (z.B. Brij97) in doppelt destilliertem Wasser mit pH 7,4. Mischen Sie vor der Verwendung den Puffer A:puffer B = 1:8 (vol/vol), um den vollständigen Proteinresuspensionspuffer vorzubereiten. Herstellung von Proteinwaschpuffer 1 mit 2% SDS in PBS; Protein-Waschpuffer 2 mit 8 M Harnstoff in 250 mM Ammoniumbicarbonat (ABC); und Proteinwaschpuffer 3 mit 2,5 M NaCl in PBS.
2. Entfernen Sie die Einsätze von den Co-Kultur-Platten. Das Kulturmedium aus den unteren Brunnen ansaugen und die Nervenzellen einmal mit vorgekühltem PBS waschen.
3. Aspirieren Sie die PBS aus den Brunnen und fügen Sie 200 l vorgekühlten RIPA-Puffer pro Well in die Platten. Inkubieren Sie die Teller auf Eis für 5 min. Sammeln Sie die Proteinlyse in 1,5 ml Röhren. Pellet die Zellablagerungen durch Zentrifugation für 10 min bei 4 °C und 12.000 x g.
4. Übertragen Sie den Überstand in neue 1,5 ml-Rohre. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie die Proteinkonzentration auf 1 mg/ml ein.
5. Fügen Sie 100 M Alkyn-Biotin, 2,5 mM Natriumascorbat und 1x BTTAA-CuSO₄ Komplex 2 bis 1 ml Proteinlyse hinzu und mischen Sie die Lösung gut. Inkubieren Sie die Mischung bei RT für 1 h.
6. Übertragen Sie die Reaktionslösung in 20 ml vorgekühltes Methanol in einem 50 ml konischen Rohr. Gut mischen und bei -30 °C über Nacht inkubieren, um die Proteine auszufällen.
7. Pellet das Protein scheide durch Zentrifugieren 15 min bei 4 °C und 4.500 x gaus. Waschen Sie das Proteinpellet zweimal mit 20 ml vorgekühltem Methanol. Aspirieren Sie den Überstand aus der Röhre. Setzen Sie das Proteinpellet mit 4 ml Proteinresuspensionspuffer wieder auf und übertragen Sie die Proteinresuspension in eine neue 15 ml konische Röhre.
8. Nehmen Sie 50 L Streptavidinperlen und waschen Sie sie 3 Mal mit PBS. Fügen Sie die gewaschenen Perlen in die Proteinresuspension. Inkubieren Sie die Lösung bei 4 °C für 3 h auf einem vertikalen Rotator bei einer Drehzahl von 20 Umdrehungen pro Minute.
9. Waschen Sie die Perlen sequenziell mit 6 Arten von Puffern: Proteinwaschpuffer 1, Proteinwaschpuffer 2, Proteinwaschpuffer 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC und 0,05 M ABC.
10. Nach dem Waschen die Perlen mit 20 l PBS wieder aufhängen und die Perlen in ein neues 1,5 ml Rohr geben. 20 L 2x Protein-Ladepuffer in die Perlen geben und bei 95 °C 10 min behandeln. Die Proteinproben sollten dann SDS-PAGE unterzogen und nach herstellerspezifischen Anweisungen mit Coomassie brillantblau R-250 gefärbt werden. Schneiden Sie die Proteine in Gel, wie von Coomassie brillant blau R-250 für die Massenspektrometrie-Analyse angegeben.

Ergebnisse

Das gesamte Verfahren zur In-vitro-Expansion und metabolischen Kennzeichnung primärer embryonaler NSPCs dauert 6 Tage (Abbildung 1A). Die Qualität der BEND3-Zelllinie und frisch isolierte primäre NSSSPCs sind der Schlüssel zu einem erfolgreichen Experiment. BEND3-Zellen sind die Quelle von löslichen Faktoren, die die Selbsterneuerung und Proliferation von NSPCs stimulieren. Es sollte sichergestellt werden, dass die BEND3-Zellen frei von Kontamination sind und...

Diskussion

Oberflächenmarker werden häufig verwendet, um bestimmte Zelltypen in vitro und in vivo^17,18zu beschriften und zu reinigen. Die Entdeckung von Oberflächenmarkern trägt wesentlich zur regenerativen Medizin und Stammzellforschung bei, indem molekulare Werkzeuge zur selektiven Anreicherung einer Stammzellpopulation aus normalen oder pathologischen Geweben und Kulturgerichten zur Verfügung gestellt werden, die eine gereinigte Zelle anbieten. Ressourcen für die klinisc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-Glutamin	Gibco	25030081	1%
Natriumpyruvat	Sigma	P5280	1%
N2 Ergänzung	Gibco	17502048	1 bis 100
N-Acetyl-L-Cystein	Sigma	A7250	1 mM
Papain	Worthington	LS003726	10 U/mL
B27 Supplement	Gibco	17504044	1 bis 50
Poly-L-Lysin	Sigma	P4707
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1%
Fötales Rinderserum	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0,25 %	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyd	Sigma	158127	4 %
Saccharose	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
RIPA Puffer	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE Ladepuffer 2x	Solarbio	P1018
6-Well-Platte	Corning	3335
Tris-Glycin Protein Gel	invitrogen	xp00100box
Maus monoklonal anti-Nestin	Entwicklungsstudie Hybridoma Bank	Ratte-401	1 bis 20
Monoklonales Anti-Beta-Tubulin III	der Maus Sigma	T8860	1 bis 1.000
Alexa Fluor 488 Anti-Maus IgG1	Invitrogen	A-21121	1 bis 1.000
Alexa Fluor 546 Anti-Maus IgG2b	Invitrogen	A-21143	1 bis 1.000
Albumin Rind V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA Assay-Kit	Thermo Scientific	23225
Dimethylsulfoxid	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkin-Biotin	Click Chemistry Tools	TA105
BTTAA	Click Chemistry Tools	1236
Ac4ManNAz	Klick-Chemie-Werkzeuge	1084	100 &Mikro; M
9AzSia	im Labor
Natriumascorbat	Sigma	A4034
Methanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Flour 647-konjugiertes Streptavidin	Invitrogen	S21374	1 bis 1.000
Triethanolamin	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptavidin	invitrogen	60210
Ammoniumbicarbonat	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isofluran	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNase I	Sigma	DN25 12	& Mikro; g/mL
Harnstoff	Sigma	U5378