Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären menschlichen dermalen Fibroblasten mit MCPyV zu infizieren. Das Protokoll enthält Isolation der dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von MCPyV Virionen, Virusinfektion, Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung. Dieses Protokoll kann für die Charakterisierung von MCPyV-Wirt Interaktionen und entdecken andere Zelltypen infizierbar durch MCPyV erweitert werden.
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Methodenartikel
Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) Infektion kann zum Merkel-Karzinom (MCC), eine sehr aggressive Form von Hautkrebs führen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV Molekularbiologie und onkogenen Mechanismen zu untersuchen haben durch einen Mangel an ausreichenden Zellmodelle Kultur erschwert. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen für die Durchführung und Nachweis MCPyV Infektion der primären menschlichen Hautzellen. Die Protokolle beschreiben die Isolation der menschlichen dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von rekombinanten MCPyV Virionen und Nachweis von Virus-Infektion durch immunofluorescent (IF) Färbung und in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR), die sehr empfindlich ist Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Ansatz. Die Protokolle hierin können angepasst werden, indem interessierte Forscher identifizieren, andere Zelltypen oder Zell-Linien, die MCPyV Infektion unterstützen. Die beschriebene Vorgehensweise der Fisch könnte auch zur Erkennung von niedrigen Niveau der viralen DNA in die infizierten menschlichen Haut angepasst werden.
Einleitung
Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) ist eine kleine, doppelsträngige DNA-Virus, das eine seltene, aber aggressiver Hautkrebs, Merkel Cell Carcinoma (MCC)1,2zugeordnet wurde. Die Sterblichkeit von MCC, rund 33 % übersteigt die der Melanom-3,-4. MCPyV hat eine kreisförmige Genom von ~ 5 kb1,5 geteilt durch eine nicht-kodierenden regulatorischen Region (NCRR) in frühen und späten Codierung Regionen1. Die NCRR enthält die viralen Ursprungs der Replikation (Ori) und bidirektion....
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Protokoll
Menschlichen Neugeborenen Vorhäute wurden von Penn Skin Disease Research Center erhalten. Erwachsenen menschliche Fibroblasten wurden von ausrangierten normale Haut nach der Operation erhalten. Die Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Review Board genehmigt.
1. Isolierung der menschlichen dermalen Fibroblasten
- Verwenden Sie eine Schere schneiden Sie Fett und subkutane Gewebe aus der menschlichen Neugeborenen Vorhaut und schneiden die Hautprobe in halbieren oder Vierteln.
- Inkubieren Sie das Gewebe in 5 mL 10 mg/mL Dispase II in PBS mit Antibiotikum Antimykotikums ergänzt bei 4 ° C über Nacht.....
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Ergebnisse
In diesem Manuskript beschriebene Protokoll erlaubt Isolierung von einer nahezu homogenen Bevölkerung von HDFs (Abbildung 1). Wie immunofluorescent Färbung zeigen, fast 100 % der menschlichen Haut Zellen isoliert verwenden, waren die in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen positiv gebeizt für dermalen Fibroblasten Marker Vimentin und Kollagen ich24, aber negativ für den menschlichen Vorhaut Keratinozyten Marker K14 (
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Diskussion
Die Methoden, die oben beschrieben, inklusive Isolation der dermalen Fibroblasten aus menschlicher Hautgewebe, Vorbereitung der rekombinanten MCPyV Virionen, Infektion des kultivierten Zellen, immunofluorescent Färbung und eine empfindliche Fische Methode adaptiert von HCR-Technologie, die sollten Forscher MCPyV Infektion27analysieren können. Einer der kritischsten Schritte zur Erreichung MCPyV Infektion in-vitro-ist die Herstellung von hoch-Titer Virion Zubereitungen. Unter Verwendung des Protoko.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren möchten Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institut) und Dr. M. Celeste Simon (Universität von Pennsylvania) Danke für die Reagenzien und technische Unterstützung. Wir danken auch die Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Stipendien (R01CA187718, R01CA148768 und R01CA142723), das NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) und dem Penn CFAR Award (P30 AI 045008) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Fötales Kälberserum | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamin |
| DPBS, kein Kalzium, kein | Magnesium Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0,05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 mittel | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Rekombinantes humanes EGF-Protein, CF | R& D systems | 236-EG-200 | Bei -80 Grad Celsius lagern |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Bei -80 Grad Celsius lagern |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Bei -80 Grad Celsius lagern |
| Kollagenase Typ IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antibiotikum-Antimykotikum | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Schutz vor leichtem |
| DMEM-Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 Anti-Maus für Ziegen Thermo | Fisher Scientific | A11032 | Schutz vor Licht |
| Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen Anti-Kaninchen | IgG Thermo Fisher Scientific | A11034 | Schutz vor Licht |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Vor Licht schützen |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| anti-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Los # B2717 |
| MCV VP1 Kaninchen Kaninchen | polyklonales Serum #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (bFGF), humanes rekombinantes | Corning | 354060 | Lagerung bei -80 Grad Celsius |
| Benzonase-Nuklease | Sigma | E8263 | |
| Plasmid-sichere ATP-abhängige DNase | EPICENTRE | E3101K | |
| Sonden-Hybridisierungspuffer | Molekulare Technologien | ||
| Sondenwaschpuffer | Molekulare Technologien | ||
| Amplifikationspuffer | Molekulare Technologien | ||
| 594-markierte Haarnadeln | Molekulare Technologien | B4 | Schutz vor Licht |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagenz | Thermo Fisher | Scientific P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Puffer PB | Qiagen | 19066 | |
| blaue Miniprep Spin Säule | Qiagen | 27104 | |
| 50 ml konische Zentrifugenröhrchen | Corning | 352070 | |
| T4 Ligase | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Referenzen
- Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P.
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Nachdrucke und Genehmigungen
