Methodenartikel

Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung

DOI:

10.3791/58950

⸱

7. Februar 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären menschlichen dermalen Fibroblasten mit MCPyV zu infizieren. Das Protokoll enthält Isolation der dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von MCPyV Virionen, Virusinfektion, Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung. Dieses Protokoll kann für die Charakterisierung von MCPyV-Wirt Interaktionen und entdecken andere Zelltypen infizierbar durch MCPyV erweitert werden.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) Infektion kann zum Merkel-Karzinom (MCC), eine sehr aggressive Form von Hautkrebs führen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV Molekularbiologie und onkogenen Mechanismen zu untersuchen haben durch einen Mangel an ausreichenden Zellmodelle Kultur erschwert. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen für die Durchführung und Nachweis MCPyV Infektion der primären menschlichen Hautzellen. Die Protokolle beschreiben die Isolation der menschlichen dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von rekombinanten MCPyV Virionen und Nachweis von Virus-Infektion durch immunofluorescent (IF) Färbung und in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR), die sehr empfindlich ist Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Ansatz. Die Protokolle hierin können angepasst werden, indem interessierte Forscher identifizieren, andere Zelltypen oder Zell-Linien, die MCPyV Infektion unterstützen. Die beschriebene Vorgehensweise der Fisch könnte auch zur Erkennung von niedrigen Niveau der viralen DNA in die infizierten menschlichen Haut angepasst werden.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) ist eine kleine, doppelsträngige DNA-Virus, das eine seltene, aber aggressiver Hautkrebs, Merkel Cell Carcinoma (MCC)1,2zugeordnet wurde. Die Sterblichkeit von MCC, rund 33 % übersteigt die der Melanom-3,-4. MCPyV hat eine kreisförmige Genom von ~ 5 kb1,5 geteilt durch eine nicht-kodierenden regulatorischen Region (NCRR) in frühen und späten Codierung Regionen1. Die NCRR enthält die viralen Ursprungs der Replikation (Ori) und bidirektionale Promotoren für virale Transkription6,7. Die frühen Region kodiert Tumor Antigen Proteine genannt großen T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternative LT ORF (alt) sowie ein Autoregulatory MiRNA1,8,9,10. Die späten Region kodiert das Kapsid Proteine VP1 und VP211,12,13. LT und sT sind die am besten untersuchten MCPyV Proteine und haben gezeigt, dass die virale DNA-Replikation und MCPyV-induzierten Tumorgenese5unterstützen. Klonale Integration der MCPyV DNA in das Wirtsgenom, die in bis zu 80 % der MCCs beobachtet wurde, ist wahrscheinlich ein ursächlicher Faktor für Virus-positiven Tumor Entwicklung14,15.

Die Inzidenz von MCC hat in den vergangenen zwanzig Jahren16verdreifacht. Asymptomatische MCPyV Infektion ist auch weit verbreitet in der allgemeinen Bevölkerung17,18,19. Mit der zunehmenden Zahl von MCC Diagnosen und die hohe Prävalenz von MCPyV Infektion ist für unser Verständnis des Virus und seine onkogenen Potential zu verbessern. Jedoch bleiben viele Aspekte der MCPyV Biologie und onkogenen Mechanismen schlecht verstandene20. Dies ist vor allem, weil MCPyV repliziert schlecht in etablierten Zelle Linien11,12,21,22,23 und bis vor kurzem Hautzellen unterstützen MCPyV Infektion nicht entdeckten22gewesen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV und seine Wechselwirkung mit Wirtszellen zu untersuchen haben durch einen Mangel an Zellkultursystem für die Vermehrung des Virus5behindert.

Wir entdeckten, dass primäre menschliche dermale Fibroblasten (HDFs) von Neugeborenen menschliche Vorhaut Unterstützung robuste MCPyV Infektion sowohl in-vitro isoliert- und ex-Vivo-24. Aus dieser Studie haben wir die erste Zelle Kultur Infektionsmodell für MCPyV24. Aufbauend auf diesem Modellsystem, haben wir gezeigt, dass die Induktion von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Gene durch den WNT/β-Catenin Signalisierung Weg und andere Wachstumsfaktoren MCPyV Infektion stimuliert. Darüber hinaus fanden wir, dass die FDA-zugelassenen MEK Antagonist Trametinib effektiv MCPyV Infektion5,25hemmt. Aus diesen Studien haben wir auch eine Reihe von Protokollen für die Isolierung von menschlichen dermalen Fibroblasten24,25, MCPyV Virionen11,12, vorbereiten, durchführen von MCPyV Infektion auf menschlichen dermalen Fibroblasten 24 , 25 und Erkennung von MCPyV Proteine durch IF Färbung26. Darüber hinaus haben wir die in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR) Technologie27 eine hochempfindliche Fisch-Technik (HCR-DNA Fisch) entwickelt zur Erfassung von MCPyV DNA in infizierten menschlichen Hautzellen angepasst. Diese neuen Methoden werden für das Studium des ansteckenden Zyklus der MCPyV als auch die zelluläre Reaktion auf eine MCPyV Infektion nützlich sein. Das natürliche Reservoir Wirtszellen, die MCPyV Infektion beibehalten und die Zellen, die Anlass zu MCC Tumoren bleiben unbekannt. Die Techniken, die wir in dieser Handschrift beschreiben könnte angewendet werden, um verschiedene Arten von menschlichen Zellen, sowohl die Reservoir-Zellen zu identifizieren und Herkunft der MCC Tumoren zu untersuchen. Unsere etablierten Methoden wie HCR-DNA Fisch, konnte auch in der Erkennung von anderen DNA-Tumorviren und Charakterisierung von Host-Zell-Interaktionen eingesetzt werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menschlichen Neugeborenen Vorhäute wurden von Penn Skin Disease Research Center erhalten. Erwachsenen menschliche Fibroblasten wurden von ausrangierten normale Haut nach der Operation erhalten. Die Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Review Board genehmigt.

1. Isolierung der menschlichen dermalen Fibroblasten

  1. Verwenden Sie eine Schere schneiden Sie Fett und subkutane Gewebe aus der menschlichen Neugeborenen Vorhaut und schneiden die Hautprobe in halbieren oder Vierteln.
  2. Inkubieren Sie das Gewebe in 5 mL 10 mg/mL Dispase II in PBS mit Antibiotikum Antimykotikums ergänzt bei 4 ° C über Nacht.
  3. Trennen Sie in eine sterile 10 cm Teller sorgfältig die Epidermis der Hautschichten mit Mikrodissektion Pinzette.
  4. Übertragung resultierenden dermale Gewebe eine 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL 2 mg/mL Kollagenase Typ IV in FBS-freies Medium mit Antibiotikum Antimykotikums ergänzt.
  5. Inkubieren Sie die Probe bei 37 ° C in 5 % CO2 für 4-6 h mit periodischen schütteln, bis nur wenige makroskopische Gewebe Aggregate bleiben.
  6. Lassen Sie einzelne Zellen aus der Dermis durch Pipettieren nach oben und unten (verreiben) kräftig zehnmal mit einer 10 mL-Pipette.
  7. 180 X g für 5 min Zentrifugieren, und den Überstand verwerfen.
  8. Platte die dissoziierten Zellen in DMEM Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum 10 %, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin bei 37 ° C in 5 % CO2.

(2) rekombinante MCPyV Virion Vorbereitung

  1. Digest 50 µg pR17b Plasmids (Buchwert MCPyV Genom) mit 250 U der BamHI-HF in einem Volumen von 200 µL (4 h bei 37 ° C), das virale Genom aus dem Vektor-Backbone (Abbildung 2) zu trennen.
  2. Die verdaute DNA 1200 µL Puffer PB (ergänzt mit 10 µL 3 M NaAc, pH 5,2) hinzu und reinigen Sie über 2 Miniprep Spin Spalten (Kapazität 20 µg DNA) zu. Das verdaute pR17b Plasmid aus jeder Spalte mit 200 µL TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA) eluieren.
  3. Bereiten Sie die Ligatur Reaktion in einer 50 mL Zentrifugenröhrchen. 400 µL gereinigtes Plasmid DNA aus Schritt 2.2, 8,6 mL 1,05 x T4 Ligase Puffer und 6 µL hohe Konzentration T4-Ligase hinzufügen. Über Nacht bei 16 ° C inkubieren.
  4. Der Ligatur fügen Sie 45 mL Puffer PB (ergänzt mit 10 µL 3 M NaAc, pH 5,2 hinzu) und verwenden Sie vielfältige Vakuum durch 2 Miniprep Spin Spalten zu laden. Eluieren Sie jede Spalte mit 50 µL TE-Puffer. Erwarten Sie eine Rendite von ca. 30 µg DNA.
  5. Am späten Nachmittag/Abend, 6 x 106 293TT28 Samenzellen in einer 10 cm Schale mit DMEM Medium ergänzt mit fetalen Kälberserum 10 %, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin ohne Hygromycin B.
  6. Am nächsten Morgen dafür sorgen, dass die Zellen etwa 50 sind % konfluierende. Transfizieren mit 66 µL Transfection Reagens (1,1 µL/cm2), 12 µg Re ligiertes MCPyV isolieren R17b DNA aus Schritt 2.4, 8,4 µg ST Ausdruck Plasmid pMtB und 9,6 µg LT Ausdruck Plasmid pADL *29.
  7. Wenn die transfizierten Zellen fast konfluierende, am nächsten Tag sind, trypsinize die Zellen und übertragen Sie sie auf eine 15 cm Schüssel für eine weitere Expansion.
  8. Gegebenenfalls nehmen Sie eine kleine Anzahl von 293TT Zellen bei der Erweiterung und durchführen, wenn für MCPyV LT (CM2B4) Färbung und VP1 (MCV VP1 Kaninchen30) Transfection Leistungsfähigkeit zu bestimmen. Zu diesem Zeitpunkt möglicherweise nuklearen LT Signal sichtbar aber VP1 Ausdruck wird wahrscheinlich nicht nachweisbar sein.
  9. Wann wird die 15 cm Schüssel fast Zusammenfluss (in der Regel 5-6 Tage nach anfänglichen Transfektion), die Zellen in drei 15 cm Gerichte übertragen. Die Zellen von den 15 cm Speisen zu ernten, wenn sie fast konfluierende und die Virus-Ernte-Protokoll unten folgen.
    Hinweis: Führen Sie optional Qualitätskontrolle wenn wie in Schritt 2.8 beschrieben. Die meisten Zellen sollte MCPyV LT und VP1 positive in diesem Stadium.
  10. Um das Virus zu ernten, trypsinize Zellen, drehen 180 X g für 5 min bei RT und den Überstand zu entfernen. Fügen Sie eine Pellet Zellvolumen des DPBS-Mg (DPBS mit 9,5 mM MgCl2 und 1 X Antibiotikum Antimykotikums). Fügen Sie dann 25 mM Ammoniumsulfat (von einer 1 M pH 9 Vorratslösung) gefolgt von 0,5 % Triton x-100 (von einem 10 % Stammlösung), 0,1 % Benzonase und 0,1 % der eine ATP-abhängige DNase. Gut mischen und über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
  11. Inkubieren Sie die Mischung für 15 min auf Eis, und fügen Sie dann 0,17 Volumen von 5 M NaCl. Mischen und auf Eis für eine weitere 15 min. Spin für 10 min bei 12.000 X g in einer Zentrifuge 4 ° C inkubieren. Wenn der Überstand nicht klar ist, sanft invertieren Sie das Rohr und wiederholen Sie die Spinnerei Schritt. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch.
  12. Aufschwemmen der Pellets mit einem Band des DPBS ergänzt mit 0,8 M NaCl und Spin wieder, wie in Schritt 2.11 beschrieben.
  13. Kombinieren Sie die Überstände aus dem Schritt 2.11 und 2.12 und spin noch einmal wie in Schritt 2.11 beschrieben.
  14. Gießen Sie Steigungen von Iodixanol in 5 mL Polyallomer Rohre mit dünnen Wandstärken durch unterlegen (27 %, dann 33 % und 39 %) ~0.7 mL Schritten mit einer 3 mL Spritze mit einer langen Nadel oder einer Pipette p1000 ausgestattet.
  15. 3 mL geklärte Virus enthaltende Überstand auf die vorbereiteten Iodixanol Steigung zu laden.
  16. Für 3,5 h bei 234.000 X g und 16 ° C in einen SW55ti Rotor drehen. Legen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungswerte zu verlangsamen.
  17. Nach der Ultrazentrifugation Sammle 12 Fraktionen in silikonisierte Röhren (jede Fraktion ist ~ 400 µL).
  18. Analysieren der Fraktionen auf das Vorhandensein des Virus durch DsDNA-Reagenz und/oder Western-Blot für VP1 (MCV VP1 Kaninchen30). Bündeln Sie gradient Brüche mit Peak DsDNA und/oder VP1 Inhalte zu und charakterisieren Sie die Lager durch quantitative PCR, das virale Genom entspricht31zu berechnen. Speichern Sie MCPyV Virion Lager bei-80 ° C.

3. Infektion

  1. Pflegen der primären menschlichen dermale Fibroblasten in DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 1 % L-Glutamin. Nach dem Zusammenfluss erreichen, split Fibroblasten 1:4 ohne Schleudern nach unten.
    Hinweis: Verwenden Sie für höchste MCPyV Infektion Effizienz, primäre Fibroblasten zwischen 5 und 12, die zum Zeitpunkt der Beschichtung aktiv teilen.
  2. Zu menschliche dermale Fibroblasten infizieren, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  3. Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA, das Gericht und bei 37 ° C für ca. 5-10 min inkubieren.
  4. Überprüfen Sie unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Zellen von der Schüssel kommen.
  5. Fügen Sie 10 mL DMEM/F12 Medium mit 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF und 3 µM CHIR99021, alle MCPyV Infektion24, auf den Teller zu stimulieren und die Zelle-Lösung in eine 15 mL Tube übertragen.
  6. Spin-down der Zellen bei 180 X g für 2 min, und den Überstand verwerfen. Aufschwemmen der Zellen in DMEM/F12 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF und 3µM-haltigem Medium CHIR99021 mit 2-4 x 104 -Zellen pro mL.
  7. Samen Sie 200 µL Zellsuspension mit 1 mg/mL Kollagenase Typ IV in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ergänzt. MCPyV Virion Lager auf dem Eis auftauen. Fügen Sie 109 virale Genom äquivalente MCPyV Virionen (berechnet in Schritt 2.18) pro 1 µL Iodixanol für jeweils 2.500 bis 5.000 Zellen zu infizieren.   Tippen Sie auf der Seite der Platte vorsichtig und legen Sie die Platte in den Inkubator.
  8. Fügen Sie nach der Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO2 für 48-72 h, 20 % FBS in jede Vertiefung.
  9. Die Infektion bei 37 ° C in 5 % CO2 für 72-96 h Vorgehen zu ermöglichen.

4. Immunofluorescent Färbung

  1. Zellen mit 3 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min im Schritt 3.9 erhalten zu beheben.
  2. Zweimal waschen Sie die Zellen mit PBS.
  3. Inkubation der Zellen blockieren/Permeabilisierung Puffer (0,5 % Triton x-100, 3 % BSA mit PBS-Puffer durch 0,22 µm Filter gefiltert) bei RT für 1 h.
  4. Inkubation der Zellen mit der folgenden primären Antikörper: Maus monoklonalen Anti-MCPyV LT (CM2B4) (1: 1000) und Kaninchen polyklonale Anti-MCPyV VP1 Antikörper (1: 2000), bei RT für 3 h.
  5. Waschen Sie die Zellen mit PBS dreimal.
  6. Inkubation der Zellen mit den sekundären Antikörper: Fluor 594 Ziege Anti-Maus IgG (1: 1000) und Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen IgG (1: 500) bei RT für 1 h.
  7. Waschen Sie Zellen mit PBS dreimal.
  8. Counterstain Zellen mit 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride).
  9. Mount Deckgläsern auf Glas gleitet und analysieren mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.

5. In-situ DNA-HCR

Hinweis: Dieses Verfahren erfordert, dass die Zellen auf Deckgläsern ausgesät werden. Zu diesem Zweck können die Infektionsbedingungen beschrieben (Schritt 3) auf das 24-Well-Plattenformat skaliert.

  1. Beheben von Zellen kultiviert auf Deckgläsern mit 4 % PFA mit PBS-Puffer für 10 min. waschen den Deckgläsern zweimal mit PBS, dann behandeln sie mit 70 % Ethanol auf die Zellen bei 4 ° C über Nacht permeabilize.
    Hinweis: Feste Proben können für mehrere Tage in diesem Zustand bleiben.
  2. Pre-hybridisieren Sie Proben durch ersetzt das Äthanol mit Sonde Hybridisierung Puffer und Inkubation für 60 min bei RT
  3. Verdünnen Sie die Wortanzahl (1 µM) (Tabelle 1) in Sonde Hybridisierung Lösung bei Verdünnung 1: 500 30 min vor Ende der Pre-Hybridisierung Schritt zu puffern und inkubieren Sie bei 45 ° C.
  4. Am Ende der Inkubationen pipette ~ 10 μL der verdünnten Probe Mix pro Deckglas auf Objektträger. Ort der Deckgläsern, Zelle-Seite nach unten, auf ihre jeweiligen Tröpfchen Hybridisierung Sonde mischen. Versiegeln der Kanten und Rücken von den Deckgläsern, die Folien mit einen großzügigen Betrag von Gummilösung.
  5. Erhitzen Sie die Folien mit zusätzlichen Sonden bei 94 ° C für 3 min durch Festlegen der Folien auf der flachen Seite eines Blocks Hitze. Übertragen Sie die Folien in eine feuchte Kammer und über Nacht bei 45 ° C inkubieren. Um eine einfache feuchte Kammer bilden, feuchten Sie leicht sterilen Papiertüchern mit dH2O und in der Unterseite von einem Kunststoff-Behälter, der mit einer Gummidichtung dichtet.
    Hinweis: Beim Aufheizen die Gummilösung kann kurz Blase. Jedoch sicherstellen Sie, dass die Dichtung nicht bricht.
  6. Sorgfältig ziehen Sie die Gummilösung mit Zange ab und die Deckgläsern Zelle-Seite nach oben Rücken in Vertiefungen von einer 24-Well-Platte. Waschen Sie die Deckgläsern mit Sonde Waschpuffer bei RT dreimal.
  7. Das Deckglas in der Verstärkung Puffer (200 µL in 24-Well Platten) bei RT inkubieren 30-60 Minuten.
  8. Unterdessen Tempern jeweils die zwei markierten Oligonukleotid-Haarnadeln erkennen die Sonden (Tabelle 1) in separaten PCR-Röhrchen durch Erhitzen auf 94 ° C für 90 s und Abkühlung auf RT für 30 min und vor Licht zu schützen. Mischen Sie die zwei Haarnadeln in Verstärkung Puffer, jeweils bei einer Verdünnung von 01:50.
  9. Machen Sie eine Oberfläche für die Amplifikation Reaktion durch Dehnung Paraffin Film über das offene Gesicht des 24-Well-Platte Deckel. 50-100 µL Tröpfchen der Haarnadel/Verstärkung Puffer Mischung auf der Paraffin-Film für jede Deckglas Pipette. Verwenden Sie Zange zum Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläsern aus der Vorverstärkung Lösung. Trocknen Sie das Deckglas durch Berühren der Kante zu einem porösen Einweg-Wipe und legen Sie Zelle-Seite nach unten auf das Droplet Verstärkung.
  10. Legen Sie die Platte Deckel hält die Deckgläsern in eine feuchte Kammer und Inkubation über Nacht bei RT im Dunkeln.
  11. Die Deckgläsern, Brunnen wieder zurückkehren. Inkubieren Sie die Proben mit 5 X SSCT [5 x Natrium-Chlorid-Natrium-Citrat (SSC) 0,1 % Tween 20 durch einen 0,22 µm-Filter gefiltert] enthaltend 0,5 µg/mL DAPI für 1 h bei RT waschen die Proben zweimal mit 5 X SSCT bei RT
  12. Montieren Sie die Deckgläsern auf Objektträger. Analysieren Sie die Zellen und die Proben unter Verwendung einer invertierten Fluoreszenzmikroskop Bild.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Manuskript beschriebene Protokoll erlaubt Isolierung von einer nahezu homogenen Bevölkerung von HDFs (Abbildung 1). Wie immunofluorescent Färbung zeigen, fast 100 % der menschlichen Haut Zellen isoliert verwenden, waren die in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen positiv gebeizt für dermalen Fibroblasten Marker Vimentin und Kollagen ich24, aber negativ für den menschlichen Vorhaut Keratinozyten Marker K14 (

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Methoden, die oben beschrieben, inklusive Isolation der dermalen Fibroblasten aus menschlicher Hautgewebe, Vorbereitung der rekombinanten MCPyV Virionen, Infektion des kultivierten Zellen, immunofluorescent Färbung und eine empfindliche Fische Methode adaptiert von HCR-Technologie, die sollten Forscher MCPyV Infektion27analysieren können. Einer der kritischsten Schritte zur Erreichung MCPyV Infektion in-vitro-ist die Herstellung von hoch-Titer Virion Zubereitungen. Unter Verwendung des Protoko...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institut) und Dr. M. Celeste Simon (Universität von Pennsylvania) Danke für die Reagenzien und technische Unterstützung. Wir danken auch die Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Stipendien (R01CA187718, R01CA148768 und R01CA142723), das NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) und dem Penn CFAR Award (P30 AI 045008) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fötales KälberserumHyCloneSH30071.03
MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamin
DPBS, kein Kalzium, keinMagnesium Thermo Fisher Scientific14190136
0,05% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mittelThermo Fisher Scientific11330-032
Rekombinantes humanes EGF-Protein, CFR& D systems236-EG-200Bei -80 Grad Celsius lagern
CHIR99021Cayman Chemical13122Bei -80 Grad Celsius lagern
CHIR99021SigmaSML1046Bei -80 Grad Celsius lagern
Kollagenase Typ IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antibiotikum-AntimykotikumThermo Fisher Scientific15240-062Schutz vor leichtem
DMEM-MediumThermo Fisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 Anti-Maus für Ziegen ThermoFisher ScientificA11032Schutz vor Licht
Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen Anti-KaninchenIgG Thermo Fisher ScientificA11034Schutz vor Licht
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Vor Licht schützen
ParaformaldehydSigmaP6148
anti-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Los # B2717
MCV VP1 Kaninchen Kaninchenpolyklonales Serum #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycinRoche10843555001
Basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (bFGF), humanes rekombinantesCorning354060Lagerung bei -80 Grad Celsius
Benzonase-NukleaseSigmaE8263
Plasmid-sichere ATP-abhängige DNaseEPICENTREE3101K
Sonden-HybridisierungspufferMolekulare Technologien
SondenwaschpufferMolekulare Technologien
AmplifikationspufferMolekulare Technologien
594-markierte HaarnadelnMolekulare TechnologienB4Schutz vor Licht
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNA ReagenzThermo FisherScientific P7581
BamHI-HFNEBR3136
Puffer PBQiagen19066
blaue Miniprep Spin SäuleQiagen27104
50 ml konische ZentrifugenröhrchenCorning352070
T4 LigaseNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602
Alexa

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181(2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499(2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468(2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112(2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Humane dermale FibroblastenVirusisolationimmunfluoreszenzzytochemische F rbungIn situ Hybridisierungviraler DNA NachweisZellkulturmodellvirale ProteinexpressionFluoreszenzmikroskopieViruskonzentration

Verwandte Artikel