Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet einen fleckenfreie Ansatz zu visualisieren und Purkinje-Zellen im Tiefkühlfrische Gewebe von Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn per Laser Capture Microdissection zu isolieren. Der Zweck dieses Protokolls ist, ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA für die RNA-Sequenzierung zu generieren.

Zusammenfassung

Laser Capture Microdissection (LCM) ist ein Vorteil, die für die Sammlung von zytologisch und/oder phänotypisch relevanten Zellen oder Regionen von heterogenen Gewebe ermöglicht. Erfasste Produkt kann verwendet werden, in einer Vielzahl von molekularen Methoden für Protein, DNA oder RNA isoliert. Erhaltung der RNA aus Post-mortem Gehirngewebe ist jedoch eine besondere Herausforderung. Immunhistochemische Färbung Verfahren, die weiter verschlechtern RNA oder Standard Visualisierungstechniken für LCM erfordern histologische. Daher haben wir ein Edelstahl-Protokoll zur Visualisierung in LCM mit dem Verwendungszweck der Erhaltung der Integrität der RNA in Post-Mortem Gehirngewebe entwickelt. Die Purkinje-Zelle des Kleinhirns ist ein guter Kandidat für Edelstahl-Visualisierung, aufgrund seiner Größe und charakteristischen Lage. Die zerebelläre Kortex besteht aus unterschiedlichen Schichten, die sich in Zelldichte unterscheiden, so dass sie eine gute Archetyp, unter starker Vergrößerung Mikroskopieren zu identifizieren. Purkinje-Zellen sind große Neuronen liegt zwischen Granulat Zellschicht, die dicht Mobilfunknetz kleinen Neuronen, und die molekulare Schicht, die in Zellkörpern spärlich ist. Wegen dieser Architektur ist der Einsatz von Edelstahl Visualisierung möglich. Geeignet wäre auch andere Organ oder eine Zelle Systeme, die diesen Phänotyp zu imitieren. Das Edelstahl-Protokoll soll fix Tiefkühlfrische Gewebe mit Ethanol und Lipide mit Xylol für verbesserte morphologische Visualisierung unter hoher Vergrößerung Lichtmikroskopie zu entfernen. Dieses Protokoll nicht für andere Fixierung Methoden berücksichtigt und ist speziell für Tiefkühlfrische Gewebeproben mit einer ultravioletten (UV) erfasst-LCM-System. Hier präsentieren wir Ihnen eine vollständige Protokoll für schneiden und Festsetzung von frisch gefrorenen Post-Mortem-zerebelläre Gewebe und Reinigung der RNA von Purkinje-Zellen, die durch UV-LCM, unter Beibehaltung der RNS-Qualität für die anschließende RNA-Sequenzierung isoliert. In unseren Händen dieses Protokoll produziert außergewöhnliches Maß an zellulären Visualisierung ohne Reagenzien Färbung und RNA mit hoher RNA Integrität Zahlen (≥8) ergibt, Bedarf für transkriptionelle Profilerstellung Experimente.

Einleitung

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung¹. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge²maximiert. Es wurde auch festgestellt, dass hohe Qualität und Quantität der RNA Voraussetzung für aussagekräftige Daten aus RNA Sequenzierung^{3 sind}. Jedoch ist bei Verwendung von RNA aus frisch gefrorenen Post Mortem Gewebe für LCM RNA-Abbau eine große Herausforderung, da es sofort nach Tod tritt und seine Ausdehnung wird durch verschiedene Faktoren im Zusammenhang mit dem Gewebe Sammlung Methode^{4,5 vermittelt} . Darüber hinaus ist RNA-Abbau noch verschärft, wenn befleckenden Techniken erforderlich sind, um histologische Details und Zelle Identifikation zu erkennen. Spezialisiert, Färbetechniken wie Hämatoxylin und Eosin, Nissl Fleck, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry sind hilfreich bei der Differenzierung von Zellen aus umgebenden Stroma aber haben gezeigt, dass RNA abgebaut und Protokoll-Ausdruck ändern Profile-⁶. Daher hat unser Labor ein Edelstahl Protokoll speziell für RNA in Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn für die Zwecke der RNA Sequenzierung nach LCM Isolierung des Purkinje Neuronen erhalten erstellt.

Bei der Verarbeitung von frischen gefrorenen Gewebes für LCM, beeinflussen die Befestigungsmethode variabel RNA und Gewebe Integrität. Formalin-Fixierung ist standard für morphologische Erhaltung, aber Ursachen Vernetzung, die möglicherweise fragment RNA und RNA Amplifikation⁷stören. Ethanol-Fixierung ist eine bessere Alternative zur RNA-Isolierung, wie es ein coagulative Fixiermittel, die nicht vernetzende¹induziert wird. Um die Darstellung der Morphologie der Gewebe zu erhöhen, ist Xylol die beste Wahl, da es Fette aus dem Gewebe entfernt. Allerdings gibt es Grenzen bekannte bei Xylol in LCM, wie das Gewebe können austrocknen und spröde verursacht Gewebe Fragmentierung auf Laser Capture⁷geworden. Xylol ist auch ein flüchtiger Toxin und muss in einer Dampfhaube richtig behandelt werden. Xylol ist dennoch nachweislich um Gewebe Visualisierung Beibehaltung auch RNA Integrität⁸zu verbessern. Daher konzentriert sich unser Protokoll auf die Verwendung von 70 % Ethanol Fixierung und Ethanol Dehydrierung, gefolgt von Xylol Inkubation für morphologische Klarheit.

Es ist wichtig, die verschiedenen Arten von lasergestützten Mikrodissektion Systeme, beachten, wie sie gezeigt haben, unterscheiden sich in Geschwindigkeit, Präzision und RNS-Qualität. Infrarot (IR) Laser capture Mikrodissektion und ultravioletten (UV) Laser Microbeam Microdissection Systeme waren beide neuartigen LCM-Plattformen, die fast gleichzeitig⁸entstanden. Die IR-LCM-System nutzt eine "Kontakte-System" mit einer transparenten thermoplastischen Folie direkt auf das Gewebe-Abschnitt platziert, und Zellen von Interesse gezielt einhalten des Films durch gezielte Impulse aus einem IR-Laser. Alternativ ist das UV-LCM-System ein "non-Contact-System", wobei ein fokussierten Laserstrahl entfernt die Zellen oder Regions of Interest im Gewebe schneidet; abhängig von der Konfiguration in zwei derzeit verfügbaren kommerziellen Plattformen, die entweder eine invertierte oder aufrechte Mikroskop-Design verwenden, Gewebe wird in einer Sammelvorrichtung durch eine Laser-induzierte Druckwelle, die es gegen die Schwerkraft katapultiert erworben oder Gewebe ist gesammelt durch die Schwerkraft, beziehungsweise. Wesentliche Vorteile des UV-LCM-Systems zählt schneller Zelle Erwerb, kontaminationsfrei Sammlung mit dem berührungslosen Ansatz und genauere Zergliederung durch eine viel kleinere Laser Beam Durchmesser⁹. Dieses Protokoll wurde speziell für ein UV-LCM-System und nicht in einem IR-LCM-System getestet wurde. In beiden UV-LCM-System-Design wenn Anhäufung Zellen in die Sammlung-Kappe, die Verwendung von einem Deckgläschen, die verbessert ist zellulären Klarheit während Mikroskopie nicht geeignet, da die Zellen nicht in der Lage, die Sammlung GAP einzugehen wäre. Daher haben wir getestet um Gewebe Visualisierung zu erhöhen, die Verwendung von undurchsichtigen Sammlung Caps, die als ein Deckglas für mikroskopische Visualisierung in UV-LCM-Systeme gegen Flüssigkeit gefüllte Sammlung Kappen dienen sollen. Flüssigkeit gefüllten Sammlung Kappen können schwierig sein, da die Flüssigkeit unterliegt der Verdunstung und häufig während der Arbeit am Mikroskop ausgewechselt werden. Zeit ist ein wichtiger Faktor für RNA-Stabilität, wie das aufgenommene Gewebe sofort⁷auflöst.

Unser Labor untersucht die Post-mortem neuropathischem Änderungen in das Kleinhirn von Patienten mit essentiellem Tremor (ET) und verwandte neurodegenerativen Erkrankungen des Kleinhirns. Wir haben gezeigt, dass morphologische Veränderungen auf Purkinje-Zellen, die ET Fällen im Vergleich zu Kontrollen, einschließlich einer reduzierten Anzahl von Purkinje-Zellen unterscheiden zentriert dendritischen Regression und eine Vielzahl von axonale Veränderungen führt uns zu postulieren, dass Purkinje Zelldegeneration ist eine biologische Kernfunktion ET Pathogenese^10,11,12,13. Transkriptionelle Profilierung wurde in viele neurologische Erkrankungen eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekulare Grundlagen der degenerativen Zellveränderungen zu erkunden. Doch transcriptional Profile aus heterogenen Proben, wie Gewebe Hirnregionen, können wirksam Maske den Ausdruck der niedrigen Fülle Transkripte und/oder vermindern die Erkennung von molekularen Veränderungen, die nur in eine kleine Population von betroffenen auftreten Zellen, wie Purkinje-Zellen im Kleinhirn Kortex. Beispielsweise sind der Purkinje-Zellen erheblich durch die reichlich Granulat-Zellen im Kleinhirn Cortex von ca. 1:3000 Unterzahl; so effektiv auf erfordert ihre Transkriptom spezielle Isolierung dieser Neuronen. Zerebelläre Kortex ist durch unterschiedliche Schichten abgegrenzt, die in Zelle Dichte und Größe der Zellen unterscheiden. Diese zellulären Architektur ist ideal, um in eine Tiefkühlfrische Gewebeprobe ohne Farbstoff-haltigen Färbung Reagenzien zu visualisieren. In der Theorie könnte dieses Protokoll auch angewendet werden, auf anderen Gewebetypen, die ähnlich markanten Gewebe haben Organisation.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um speziell für Purkinje Zelle Visualisierung im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn zu arbeiten. Zahlreiche Protokolle gibt es für die Befestigung, Visualisierung und RNA Erhaltung vieler Arten von Geweben für die Zwecke der beiden IR und UV-LCM Färbung. Wenn ein experimentelles Design für UV-LCM erwägen, sollten Einzelpersonen ihr Protokoll passen am besten die Bedürfnisse und Anforderungen von beginnend und endend Materialien anpassen. Hier verbinden wir viele Aspekte der verschiedenen LCM-Protokolle ermöglichen eine verbesserte Methode zur Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-ohne die Notwendigkeit des Farbstoffes mit Färbung Reagenzien, qualitativ hochwertige RNA Transkriptom vorzubereiten Sequenzierung.

Protokoll

Alle humanen Proben, die in diesem Protokoll genutzt mit Einwilligung gewonnen wurden und durch die internen Review Board (IRB) an der Columbia University und der Yale University genehmigt worden.

Hinweis: Die Gesamtheit dieses Protokolls sollte folgen strengen RNA Umgang mit Richtlinien, wobei eine behandschuhte Hand wird immer verwendet, alle Flächen mit einer RNase Dekontaminator gereinigt werden und alle Arbeitsmaterialien RNA/DNA/Nuklease frei sind.

1. Test RNA Integrität des Gewebes vor Beginn LCM

Hinweis: Qualitätsprüfung der RNA kann durch viele Methoden erfolgen. Sicherstellen Sie, dass RNA aus dem gesamten Bereich getestet wird, um eine repräsentative RNA-Integrität-Anzahl (RIN) der Stichprobe.

1. Wählen Sie sorgfältig Gewebeproben für die Aufnahme, die innerhalb der Parameter des experimentellen Designs passen. Wenn bei der Kryostat schneiden, wechseln Sie zur Schritt 1.2. Ist dies nicht der Fall, das Gewebe entsprechend zu verarbeiten und zu Schritt 1.11 bewegen.
2. Zwei Container von Trockeneis zu bekommen. Die Größe hängt von der Anzahl der Stichproben.
   1. Legen Sie im ersten Behälter von Trockeneis eine leere, beschriftete 2 mL-Tube mit dem Gewebe-Code.
      Hinweis: Es dauert 10 min für die Rohre einfrieren. Rohre müssen vor dem Einbau des Gewebes hinein eingefroren werden; Andernfalls wird das Gewebe auf die Rohroberfläche schmelzen.
   2. Legen Sie in einen zweiten Behälter mit Trockeneis das Gewebe aus einem-80 ° C Gefrierschrank, der RNA Prüfung erfordert.
3. Reinigen Sie den Kryostaten. Siehe Schritt 4.7, für detaillierte Reinigungsprozedur.
4. Entfernen Sie das Gewebe aus Trockeneis und schneiden Sie einen kleinen Ausschnitt des Gewebes mit einer Rasierklinge RNase dekontaminiert. Gewebe sollte ca. 1 cm x 1 cm groß sein.
5. Ein ca. 3 mm hohen Hügel der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung auf einem Kryostat "Chuck" und erlauben Sie es, teilweise einzufrieren. Legen Sie das Gewebe auf das Office-Anpassungstool — nicht in OCT schieben, einfach lassen Sie es an der Spitze liegen.
6. Sobald OCT härtet, legen Sie das Futter mit dem montierten Gewebe in der Kryostat schneiden Arm und Position vor der Kryostat-Klinge.
7. Schneiden Sie bei 30 μm Abschnitte, bis das Gewebe selbst ist.
8. Schneiden Sie 300 μm über Gewebe und Ort in einem gefrorenen 2 mL-Tube. Setzen Sie den Schlauch wieder in Trockeneis.
9. Entfernen Sie das Gewebe aus dem "Futter" und setzen Sie wieder in Trockeneis erst unmittelbar vor dem einlagern.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1,4 – 1,9 für alle Gewebe.
11. Sobald alle Proben abgeschlossen sind, entpacken Sie RNA mit dem RNA-Extraktion Kit zur Verfügung gestellt (Table of Materials #15). Ein detailliertes Protokoll ist mit dem RNA-Extraktion-Kit zur Verfügung gestellt. Befolgen Sie alle Anweisungen einschließlich der optionalen Schritt die Sammlung Rohr Membran und der optionalen Schritt für DNase Verdauung (Table of Materials #16) trocknen lassen.
12. Testen Sie die Integrität der extrahierten RNA über eine Qualität Bewertung Bioanalyzer¹⁴.

2. bereiten Sie vor dem Start-Schnitt für LCM

1. Reinigen Sie die Folien-Inhaber vor jeder Runde von Gewebe schneiden für LCM. Führen Sie die Reinigung am Vortag verwenden, um komplette über Nacht trocknen lassen.
   Hinweis: Objekthalter dienen zum Gewebe Abschnitt Fixierung in Ethanol und Clearing in Xylol.
   1. Schieben Sie Halter Reinigungsverfahren: mit RNase Dekontaminator gefolgt von Diethyl Pyrocarbonate behandelt (DEPC) Wasser nachspülen. Lassen Sie über Nacht trocknen kopfüber auf eine RNA/DNA/Nuklease freien Oberfläche, Staub oder andere Verunreinigungen in der Luft zu vermeiden.
      Vorsicht: DEPC ist hochgiftig und sollten behandelt und entsorgt EH & S standard gefährliche Chemikalien-Protokoll verwenden.
2. Reinigen der Bürsten für mit RNase decontaminator und über Nacht trocknen lassen. Vermeiden Sie Staub und andere Verunreinigungen.
3. Ort der Membran gleitet unter UV-Licht für 30 min bei Raumtemperatur. Tun Sie nicht aussetzen verwendeten Folien UV-mehr als 1 – 2 Tage vor. Dies erhöht die Bindung des Gewebes auf die Membran Folie.
   Hinweis: Schritt 2.3 kombinierbar mit Schritt 4, wodurch für Folie UV-Behandlung am gleichen Tag wie Gewebe Stationspunkte (siehe Schritt 4.4) auftreten.

3. bereiten Sie Fixierung Lösungen mit RNase freies Wasser und qualitativ hochwertigen Ethanol

Hinweis: Alle Lösungen sind für jedes Experiment frisch zubereitet. Sicherstellen Sie, dass der Diahalter Reinigungsverfahren aus Schritt 1.1 abgeschlossen ist. Alle Lösungen sind im Objekthalter bereit.

1. 30 mL 100 % Ethanol in einem Diahalter zu platzieren.
2. Ethanol mit DNase/RNase/Nuklease freies Wasser zu verdünnen. Platz 30 mL 95 % Ethanol in einem Halter schieben und auf Eis gelegt.
3. Ethanol mit DNase/RNase/Nuklease freies Wasser zu verdünnen. Platz 30 mL 70 % Ethanol in einem Halter schieben und auf Eis gelegt.
4. Platz 30 mL 100 % Xylol in zwei separate Objekthalter und beschriften Sie sie als #1 und #2.

4. bereiten Sie Kryostaten für Gewebe schneiden

1. Holen Sie sich einen Eimer mit Eis für Ethanol Lösungen und einem Behälter mit Trockeneis für das Gewebe.
   Vorsicht: Trockeneis ist extrem kalt, also tragen Sie Schutzhandschuhe. Platzieren Sie Eis und Trockeneis nicht in demselben Container. Unterschiedlichen Temperaturen in Eis und Trockeneis werden zu bilden zusammen mit einer unbestimmten Temperatur führen.
2. Entfernen Sie das Gewebe von-80 ° C Gefrierschrank und auf Trockeneis für den Transport zu den Kryostaten.
3. Kryostat-Einstellungen:
   1. Legen Sie die Schnittdicke auf 14 μm.
   2. Legen Sie die trim Dicke auf 30 μm, Gewebe-Menge zu erhalten.
   3. Setzen Sie für Kryostaten mit dual Kammer und Probe halten Temperaturen Kammertemperatur (CT) auf-18 ° C. Stellen Sie die Temperatur für Kryostaten mit einer Einstellung bis-17 ° C.
   4. Für Kryostaten mit dual Kammer und Probe Haltetemperatur gesetzt die Objekttemperatur (OT) bis-16 ° C.
      Hinweis: OT muss wärmer als die CT sogar schneiden sicherzustellen. Wenn das Gewebe noch Schreddern, OT kann auf-15 ° C erhöht werden und die CT kann erhöht werden, bis-18 ° C.
4. Legen Sie das Gewebe in den Kryostaten für mindestens 20 Minuten optimale Temperatur zu ermöglichen.
   Hinweis: Wenn das Gewebe nicht optimale Temperatur erreicht hat, wird es beim Schneiden zerkleinern. Stellen Sie nicht das Gewebe bei-20 ° C am Vorabend um RNA Integrität zu bewahren und Kristall Eisbildung zu verhindern. Lassen Sie das Gewebe so viel Zeit wie nötig, um optimale Temperatur glatt schneiden equilibrate. Optionale Implementierung der Folie Inkubation unter UV-kann hier auftreten (siehe Schritt 1.3).
5. Legen Sie das "Futter" in Kryostaten für mindestens 20 min zu ermöglichen, die Temperatur des Kryostaten herunter zu kommen.
6. Legen Sie die sauberen Pinsel in Kryostaten für mindestens 20 min zu ermöglichen, die Temperatur des Kryostaten herunter zu kommen.
7. Reinigen Sie den Kryostaten
   1. Reinigen Sie die Bühne mit einer 1:1 Mischung von RNase Dekontaminator und 70 % Ethanol verdünnt mit RNA/DNA/Nuklease freies Wasser Einfrieren auf der Bühne zu verhindern.
   2. Reinigen Sie eine neue Einweg-Kryostat-Klinge mit RNase Dekontaminator und in den Klingenhalter auf der Bühne. Lassen Sie mindestens 20 Minuten für den Kryostaten Klinge auf die Temperatur des Kryostaten kommen.
   3. Reinigen Sie die Anti-Rolle-Platte mit RNase Dekontaminator und legen auf der Bühne. Lassen Sie mindestens 20 Minuten für die Anti-Roll-Platte, auf die Temperatur des Kryostaten zu kommen.
      Hinweis: Eine Anti-Rolle-Platte ist nicht erforderlich für den Schnitt aber wird dringend empfohlen. Wenn eine Anti-Rolle-Platte nicht verfügbar ist, funktioniert ein gereinigter Pinsel als Alternative. Wenn die Anti-Rolle-Platte nicht richtig temperiert ist, wird das Gewebe schmelzen oder bleiben beim Schneiden.

5. Schneiden von Gewebe

1. Schneiden Sie ein kleines Stück des Gewebes (~ 1 cm x 1 cm) für Schnitt. Das restliche Gewebe Trockeneis/80 ° C Gefrierschrank zurück.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die Gewebe-Abschnitt ~ 95 % zerebelläre Kortex, wo Purkinje-Zellen befinden.
2. Legen Sie eine ca. 3 mm hohen Hügel Okt. um das "Futter" zu decken. Starten Sie durch den Aufbau der Schichten an der Spitze in langsamen, kreisenden Bewegungen, bis gibt es ein kleiner Hügel.
3. Sobald OCT ist teilweise gefroren, aber es noch etwas Flüssigkeit in der Mitte gibt, legen Sie das Gewebe auf OCT. Schieben Sie das Gewebe nicht tief in Okt. zulassen das Gewebe auf OCT bis vollständig gefroren zu sitzen. Dies dauert 1 – 2 Minuten.
4. Legen Sie die "Chuck" mit gefrorenen OCT und das Gewebe in der Kryostat schneiden Arm. Stellen Sie das Gewebe, so es mit Messer abschließt.
5. Lassen Sie das Gewebe in den Arm schneiden für 15-20 min zur Anpassung an neue Temperatur zu sitzen.
   Hinweis: Abhängig von der Dicke des Gewebes wird Zeit für Temperatur Akklimatisierung benötigt. Lassen Sie das Gewebe zu sitzen, so lange wie nötig zu sauber geschnitten. Passen Sie OT und CT mit Gewebe Temperatur Akklimatisierung zu unterstützen.
6. Bewegen Sie langsam das Gewebe näher an der Klinge. Sobald das Gewebe die Klinge erreicht hat, starten Sie die trim. Trim Dicke sollte 30 μm betragen.
7. Schneiden Sie 2 – 3 X, bis die Rinde Layer sichtbar sind.
8. Platzieren und Ausrichten der Anti-Rollen-Platte oberhalb der Kryostat-Klinge.
   Hinweis: Eine silberne Linie erscheint das Licht in den Kryostaten an der Schnittstelle zwischen der Klinge und Anti-Roll-Platte. Dies bedeutet, dass die Anti-Rolle-Platte direkt über den Rand des Blattes ist.
9. Beginnen Sie die Querschnitte bei 14 μm. Richtig Zuschnitte werden flach unter der Anti-Roll-Platte.
   Hinweis: Wenn das Gewebe fest ist, sicherzustellen Sie, dass die Anti-Rolle-Platte kalt genug ist. Wenn nötig, Platzierung eines Stückes trocken auf der Außenseite (Seite die Bühne nicht berühren) wird schnell Eis kühlen Sie die Anti-Rolle-Platte.
10. Schneiden Sie 4 – 6 Abschnitte und richten Sie sie horizontal über die Kryostat-Bühne.
11. Angeln die Folie, holen Sie alle Stücke des Gewebes gleichzeitig.
    Hinweis: Mit den Malwerkzeugen, heben Sie die Enden des Gewebes für die Folie bei Abholung leichter verfügbar sein. Einen Abschnitt zu einem Zeitpunkt nicht abholen. Raumtemperatur Luftkontakt wird RNA Integrität beeinträchtigt.
    Vorsicht: Lassen Sie sich nicht die Membran, tippen Sie auf die Bühne des Kryostaten. Wenn die Membran die Bühne berührt, fangen an, von der Glas-Folie zu lösen und zu Fehlern führen, wenn Sie LCM versuchen.
12. Verschieben Sie sofort zu Schritt 6. Verzögern Sie Fixierung nicht.

6. Befestigung Gewebe/Fleck-weniger Visualisierung

1. Sofort einziehen des Protokolls zur Fixierung von ethanol
2. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 70 % Ethanol 2 min. lang – auf dem Eis.
3. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 95 % Ethanol 45 s – auf dem Eis.
4. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit 100 % Ethanol 2 min. lang — bei RT
5. Tauchen Sie die Folie 3 Mal in den Diahalter mit Xylol 1 — bei RT
6. Legen Sie die Folie in den Diahalter mit Xylol 2 für 5 min – bei RT
7. In einem sauberen Bereich, für mindestens 30 min. längeren Durststrecke optimal, bis zu 60 min. sind trocknen lassen.
   Vorsicht: Folien für die Trocknung in einer Dampfhaube aufzustehen. Xylol ist flüchtig. Flach liegende Folien verursacht Xylol zum Pool im Abschnitt Gewebe die Gewebe zu dunkel wird.

7. optional – Folie Lagerung

1. Platzieren Sie getrocknete Folien in individuelle 50 mL Röhrchen (eine Folie pro Rohr) und Platz in den-80 ° C Gefrierschrank für bis zu 7 Tage.
   Hinweis: Folien müssen vor dem Einlegen in den Gefrierraum-80 ° C trocken sein. Verwenden Sie Trockenmittel im Inneren des Rohres nicht, da Partikel in das Gewebe und die Membran eingebettet werden. Sicherstellen Sie, dass die Röhre Kappe fest; ist dies nicht der Fall, Kondenswasser wird auf der Folie auftreten, wenn für den Gebrauch auftauen.
   Vorsicht: Integrität der RNA sinkt nach 7 Tagen, ebenso wie die Qualität der Gewebe Visualisierung.

(8) Auftauen Folien zur Verwendung gespeichert

1. Entfernen Sie das Rohr mit einer Folie aus der Tiefkühltruhe-80 ° C 1 h vor der beabsichtigten Verwendung.
2. Öffnen Sie das Rohr nicht sofort. Lassen Sie das Rohr auf Raumtemperatur kommen. Kondensation tritt auf der Außenseite des Rohres nur.
3. Sobald das Rohr gekommen auf Raumtemperatur und alle Kondensation ist verschwunden (ca. 30-40 min), entfernen Sie die Kappe und die Folie, um die Raumtemperatur Luft aussetzen.
4. Lassen Sie die Folie auf Raumtemperatur für 15 – 20 min. verlassen akklimatisieren die Folie im Inneren des Rohres mit der Kappe entfernt.
   Hinweis: Folie ist nun bereit für LCM.

(9) Laser Capture Microdissection von Purkinje-Zellen:

Hinweis: In diesem Abschnitt des Protokolls werden nur Besonderheiten im Zusammenhang mit der Erfassung von Purkinje-Zellen für die anschließende RNA Sequenzierung diskutieren. In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass der Benutzer mit dem UV Laser Capture Mikroskop und die angeschlossene Software vertraut ist.

1. Saubere arm Mikroskoptisch und der GAP-Sammlung mit RNase Dekontaminator.
2. Legen Sie mit behandschuhten Händen die Folie auf dem Mikroskop und 500 μL opaken Kappe im Studienarm mit Auflistung.
   Hinweis: Immer richtige RNA-Technik durch den Arbeitsbereich mit RNase Dekontaminator Reinigung zu gewährleisten und behandschuhten Hände beim Berühren der Folie oder opaken Kappe verwenden. Handschuhe können entfernt werden, sobald die Folie und Deckel vorhanden sind und Laser Capture hat begonnen.
3. Richten Sie bei kleiner Vergrößerung die opake Kappe über das Kleinhirn Gewebe, um sicherzustellen, dass die Kappe das gesamte Gebiet in das Okular visualisiert deckt.
   Hinweis: Nur das Okular des Mikroskops wird zeigen, ob die opake Kappe zentriert ist. Die Kamera wird nicht angezeigt, wenn die Kappe über das Gewebe zentriert ist. Bauartbedingt Laser Capture Umfang werden die Visualisierung durch die opaken Kappe in das Okular nur oder in das Okular und Kamera visualisiert.
4. Visualisieren Sie die zerebelläre Schichten mit 5 x - 10 X-Objektiv und platzieren Sie den Cursor über den Abschnitt an molekularen Schicht und Granulat Zellschicht (die Purkinje-Zellschicht) schneiden.
5. Nach 40 X und visualisieren Sie Purkinje-Zellen zu.
   Hinweis: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 Beispiel Visualisierungen.
6. Mit der beginnen Sie Erfassung von Purkinje-Zellen.
   Hinweis: Auszuführenden RNA-Sequenzierung, mindestens 5 ng RNA ist erforderlich. Ca. 1600-2000 Purkinje-Zellen führen genug RNA-Material für die Sequenzierung. RNA wird für bis zu 8 h am Mikroskop stabil sein. Test UV-Energie und UV Konzentration vor der Entnahme zu gewährleisten sind korrekt. Im Laufe der Zeit das Gewebe wird weiterhin austrocknen und die UV-Energie und UV-Fokus können geändert werden müssen.

10. RNA Sammlung Post LCM

1. Vorbereiten den Zelle Lysis Puffer (bereiten frisch jedes Mal)
   1. Verdünnen Sie 2-Mercaptoethanol in Lyse Puffer bei 1: 100 (10 mL μL:1, beziehungsweise). Lyse (RLT) Puffer ist in Tabelle von Materialien (#14 und #15) zur Verfügung gestellt.
2. Die opaken Kappe, mit der Kappe nach oben fügen Sie 50 μL der Zelle Lysis Puffer hinzu. Schließen Sie den Schlauch vorsichtig über die Kappe.
3. Lassen Sie das Rohr auf dem Kopf stehend für 1 min.
4. Wirbel der Röhre für 30 s und schnell drehen den Lyse-Puffer an der Unterseite des Rohres.
5. Öffnen Sie das Rohr und wiederholen Sie die Schritte 10.2-10.4.
6. Legen Sie die Röhrchen mit 100 μL der Lyse Puffer und RNA aus dem-80 ° C Gefrierschrank, bis alle Muster fertig und bereit für die RNA-Extraktion (Table of Materials #14 sind).

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte für die Zubereitung von frisch gefrorenen Post-Mortem-menschlichen Hirngewebe für UV-LCM. Gründliche technische Daten und Anmerkungen sind für Kryostat schneiden, angegeben, da es frisch gefrorenen Hirngewebe mit einem hohen Maß an Präzision schneiden schwierig sein kann. Der wichtigste Punkt ist, dass frisches gefrorenes Gewebe extrem kalt ist und eine erhebliche Menge an Zeit erfordert, um auf die wärmere Temperatur von einem Kryostat zu akklimat...

Diskussion

Die hier vorgestellten Protokoll ist speziell geändert, um einen rostfreien Ansatz bei der Visualisierung von morphologisch unterschiedlichen Gewebes für UV-LCM. Diese Methode soll die Integrität der RNA für die anschließende direkte RNA Sequenzierung, unter Beibehaltung einer Steigerung des Niveaus der Gewebe Visualisierung zu maximieren. Die Fähigkeit, verschiedene Zelltypen für Erfassung, erstellen die reinste Population von Zellen möglich ist, zu unterscheiden ist wichtig für das Verständnis der unterschiedlicher mol...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membran-Objektträger für Gewebe. Wir raten davon ab, Objektträger aus Glas zu verwenden.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Nur undurchsichtige Kappen werden zur Verbesserung der Visualisierung auf inversen Zielfernrohren verwendet
RNase Away Molecular	BioProducts	7005-11	Andere RNase-Dekontaminationsprodukte sind ebenfalls geeignet. Zur Reinigung aller Oberflächen vor der Arbeit.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	Wenn Sie alternatives Ethanol verwenden, achten Sie auf eine hohe Qualität. Essentiell für die Gewebefixierung.
Xylole (ACS-zertifiziert)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	Wenn Sie alternatives Xylol verwenden, stellen Sie eine hohe Qualität sicher. Unverzichtbar für die Visualisierung von Geweben.
UltraPure destilliertes Wasser	Invitrogen	10977-015	Anderes RNA/DNA/Nuklease-freies Wasser ist ebenfalls geeignet. Wird nur in der Ethanolverdünnung verwendet.
Slide-Fix Objektträgerdosen	Evergreen	240-5440-G8K	Jeder Objektträgerhalter/jede Dose ist ebenfalls geeignet. Muss vor Gebrauch gereinigt werden. Wird zur Fixierung nach dem Schneiden verwendet.
Stabilisator, Zb. 70 mm 100 μ m	Leica Biosystems	14041933980	Der Typ der Anti-Roll-Platte wird durch die Art des Kryostaten und die Position der Befestigung auf der Bühne bestimmt. Alle Kryostate haben unterschiedliche Anforderungen.
Diethylpyrocarbonat (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC von jedem Anbieter ist geeignet. Befolgen Sie die Anweisungen zur Wasseraufbereitung.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes können bei jedem Anbieter bestellt und in jeder Größe verwendet werden. Kimwipes sind zur Reinigung von Mikroskopen und Kryostaten zu verwenden.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Jede Marke von OCT ist akzeptabel. Es wird kein Gewebe in das OCG eingebettet, es ist streng, Gewebe an "Chuck" zu befestigen.
Edge-Rite Low-Profile-Mikrotomklingen	Thermo Scientific	4280L	Der Klingentyp wird durch die Art des Kryostaten bestimmt. Alle Kryostate haben unterschiedliche Anforderungen.
Leica Microsystems 3P  25 + 30MM KRYOSTAT-FUTTER	Fisher Scientific	NC0558768	Der Futtertyp wird durch die Art des Kryostaten bestimmt. Alle Kryostate haben unterschiedliche Anforderungen. Beide Größen sind geeignet.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Erforderlich für die RNA-Extraktion nach LCM. RLT-Lysepuffer ist unerlässlich, um gefangene Zellen aus der undurchsichtigen Kappe zu sammeln.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Erforderlich für die RNA-Extraktion von Schnittvorbereitungen, die vor der LCM durchgeführt werden, um die RNA-Integrität des Ausgangsgewebes zu testen.
RNase-freies DNase-Set	Qiagen	79254	Dnase entfernt jegliche DNA, um eine reine RNA-Population zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass Dnase frisch hergestellt wird.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Gekauftes Volumen nach Ermessen des Benutzers. Notwendig für die Zugabe zu RLT-Puffer für die Zelllyse. Verhindert RNase-Aktivität.
Globe Scientific  Lot zertifiziertes graduiertes Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml)	Fisher Scientific	22-010-092	Jedes 2-ml-Röhrchen, das frei von RNase, DNase, humaner DNA und Pyrogen ist, ist geeignet.