En rustfritt protokoll for høykvalitets RNA isolasjon fra Laser fange Microdissected Purkinje celler i menneskelig obduksjon lillehjernen

Summary

Denne protokollen bruker en flekk-fri tilnærming til å visualisere og isolere Purkinje celler i fersk-frosne vev fra menneskelige obduksjon lillehjernen via laser fange microdissection. Formålet med denne protokollen er å generere tilstrekkelig mengder av høy kvalitet for RNA-sekvensering.

Abstract

Laser fange microdissection (LCM) er en fordelaktig verktøy for innsamling av cytologically og/eller svært relevante celler eller områder fra heterogene vev. Fanget produktet kan brukes i en rekke molekylær metoder for protein, DNA eller RNA isolasjon. Men er bevaring av RNA fra postmortem hjernevev spesielt utfordrende. Standard visualiseringsteknikker for LCM krever histologic eller immunohistochemical flekker prosedyrer som kan ytterligere redusere RNA. Derfor har vi utviklet en rustfritt protokoll for visualisering i LCM hensikten med bevare RNA integritet i evaluering av hjernevev. Purkinje cellen av lillehjernen er en god kandidat for rustfritt visualisering, p.g.a. størrelsen og karakteristiske plassering. Lillehjernen cortex har forskjellige lag som varierer i cellen tetthet, noe som gjør dem en god arketypen å identifisere under forstørring mikroskopi. Purkinje celler er store neurons granule celle laget, som er en tett cellular nettverk av små neurons, og molekylær laget, som er spredt i cellen legemer. Bruk av rustfritt visualisering er mulig på grunn av denne arkitekturen. Andre organ eller celle systemer som etterligner denne fenotypen vil også være egnet. Rustfritt protokollen er utformet for å fastsette frisk-frosne vev med etanol og fjerne lipider med xylen for forbedret morfologiske visualisering under forstørring * lys. Denne protokollen ikke høyde for andre fiksering metoder og er spesielt utformet for frisk-frosne vevsprøver tatt ved hjelp av en ultrafiolett (UV)-LCM systemet. Her presenterer vi en full protokoll for skjæring og fikse frisk frosne obduksjon menneskelig lillehjernen vev og rensing av fra Purkinje celler isolert av UV-LCM, stund preserving RNA kvalitet for påfølgende RNA-sekvensering. I våre hender denne protokollen gir overlegne nivåer av mobilnettet visualisering uten flekker reagenser og gir RNA med høy RNA integritet tall (≥8) behov for transcriptional profilering eksperimenter.

Introduction

Laser fange microdissection (LCM) er en verdifull forskningsverktøy som for separasjon av patologisk relevante celler for påfølgende molecularly drevet evaluering. Bruken av molekylære analyser i disse heterogene vevsprøver og sammenhengen med patologisk og kliniske data er et nødvendig skritt i å vurdere translasjonsforskning betydningen av biologiske¹. Når du analyserer genuttrykk data fra RNA, bruk av frossent deler anbefales fordi det gir utmerket kvalitet på RNA samt maksimert antallet². Det har vært godt etablert at høy kvalitet og kvantitet av RNA er avgjørende for meningsfylt data fra RNA sekvensering³. Men når bruker RNA fra frisk frosne obduksjon vev for LCM, er RNA degradering en stor utfordring, som det skjer umiddelbart etter døden og utstrekning er formidlet av ulike faktorer assosiert med vev samling metode^4,5 . Videre forsterkes RNA fornedrelse når flekker teknikker er nødvendig for å gjenkjenne histologic detaljer og celle identifikasjon. Spesialiserte flekker teknikker, som hematoxylin og eosin, Nissl flekken, immunofluorescence og immunohistochemistry er nyttige i å skille celler fra omkringliggende stroma men har vist seg å redusere RNA og endre transkripsjon uttrykk Profiler⁶. Derfor, vårt laboratorium har skapt en rustfritt protokoll spesielt designet for å bevare RNA i evaluering av menneskelig lillehjernen anvendelsen av RNA sekvensering etter LCM isolasjon av Purkinje neurons.

I behandling frisk frossent for LCM, kan metoden fiksering ulik påvirke både RNA og vev integritet. Formalin fiksering er standard for morfologiske bevaring, men årsaker cross-linking som kan fragmentere RNA og forstyrre RNA forsterkning⁷. Etanol fiksering er et bedre alternativ for RNA isolasjon, som det er et coagulative bindemiddel som ikke brekning cross-linking¹. For å forsterke effekten av vev morfologi, er xylen det beste valget, som det fjerner lipider fra vevet. Det er imidlertid kjent begrensninger når utnytte xylen i LCM, vev kan tørke ut og bli sprø forårsaker vev fragmentering på laser fange⁷. Xylen er også en flyktige gift og må behandles riktig i avtrekksvifte. Xylen har likevel vist seg å forbedre vev visualisering samtidig bevare RNA integritet⁸. Derfor Sentre våre protokollen rundt bruk av 70% etanol fiksering og etanol dehydrering, etterfulgt av xylen inkubasjon morfologiske klarhet.

Det er viktig å merke seg de forskjellige typene laser-basert microdissection systemer, som de har vist varierer i hastighet, presisjon og RNA kvalitet. Infrarød (IR) laser fange microdissection og ultrafiolett (UV) laser microbeam microdissection systemer var begge romanen LCM plattformer som dukket opp nesten samtidig⁸. IR-LCM systemet benytter en "kontakt system" bruke en gjennomsiktig termoplastisk film plassert direkte på delen vev, og cellene rundt overholder selektivt filmen av fokusert pulser fra en IR laser. Alternativt, UV-LCM systemet er en "ikke-kontakt system" der en fokusert laserstråle skjærer bort i celler eller områder av interesse i vev; avhenger på konfigurasjonen i to tilgjengelige kommersielle plattformer som bruker enten en invertert eller oppreist mikroskop design, vev er kjøpt i en samling enhet av en laser-induserte bølge som katapulter det mot tyngdekraften eller vev er samlet av tyngdekraften, henholdsvis. Betydelige fordeler av UV-LCM inkluderer raskere celle oppkjøpet, forurensning-fri samling med ikke-kontakt tilnærming og mer presis disseksjon på grunn av en mye mindre laser strålen diameter⁹. Denne protokollen ble spesielt utformet for en UV-LCM system og har ikke blitt testet i et IR-LCM system. Enten UV-LCM system design, når samler celler i samlingen hetten, bruk av en dekkglassvæske som forbedrer er mobilnettet klarhet under mikroskopi ikke egnet, som cellene kan ikke gå inn i samling hetten. Derfor for å forsterke vev visualisering, testet vi bruk av ugjennomsiktig samling lokk, som er utformet for å fungere som en dekkglassvæske for mikroskopiske visualisering i UV-LCM systemer, mot flytende fylt samling caps. Væske fylt samling caps kan være utfordrende, væsken er underlagt fordampning og må erstattes ofte mens du arbeider i mikroskopet. Tid blir en viktig faktor for RNA stabilitet, som fanget vevet oppløser umiddelbart⁷.

Vårt laboratorium studier postmortem neuropathologic endringene i lillehjernen av pasienter med viktig tremor (ET) og relaterte nevrodegenerative lidelser av lillehjernen. Vi har vist morfologiske endringer sentrert på Purkinje celler som skiller ET tilfeller versus kontroller, inkludert et redusert antall Purkinje celler, økt dendrittiske regresjon og en rekke axonal endringer, fører oss å postulere at Purkinje celle degenerasjon er en sentral biologiske funksjon i ET patogenesen^10,11,12,13. Transcriptional profilering er brukt i mange nevrologiske sykdommer for å utforske underliggende molekylær grunnlaget for degenerative mobilnettet endringer. Men transcriptional profiler fra heterogene utvalgene, for eksempel områder av hjernen vev, kan effektivt maske uttrykk for lav overflod utskrifter og/eller redusere påvisning av molekylære endringer som oppstår i en liten populasjon av berørte celler, for eksempel Purkinje celler i lillehjernen cortex. For eksempel mindretall Purkinje celler langt av rikelig granule cellene i lillehjernen cortex av ca 1:3000; dermed målrette effektivt mot krever deres transcriptome bestemte isolasjon av disse neurons. Lillehjernen cortex er preget av ulike lag som varierer i cellen tetthet og Cellestørrelse. Denne mobilnettet arkitekturen er ideelt å visualisere i en frisk-frosne Vevsprøve uten fargestoff inneholder flekker reagenser. I teorien, denne protokollen kan også brukes til andre vev typer som har lignende karakteristiske vev organisasjon.

Denne protokollen ble utformet spesielt for Purkinje celle effekt i menneskelig evaluering av lillehjernen. Det finnes flere protokoller for fiksering, farging visualisering og RNA bevaring av mange typer vev i forbindelse med både IR - og UV-LCM. Når du vurderer en eksperimentell design for UV-LCM, bør enkeltpersoner skreddersy sine protokollen for å best passer behovene og kravene til start- og materialer. Her kombineres mange aspekter av forskjellige LCM protokoller en forbedret metode for å visualisere Purkinje celler i evaluering av menneskelig lillehjernen uten fargestoff som inneholder flekker reagenser å forberede høykvalitets RNA transcriptome sekvensering.

Protocol

Alle menneskelige prøver benyttet i denne protokollen er anskaffet med samtykke og er godkjent av interne Review Board (IRB) ved Columbia University og ved Yale University.

Merk: Hele denne protokollen skal følge strenge RNA håndtering retningslinjer, der en gloved hånd brukes alltid alle overflater rengjøres med en RNase renseinstallasjon og alle materialer er RNA/DNA/Nuclease gratis.

1. test RNA integriteten til vev før starter MFM

Merk: Testing RNA kvalitet kan gjøres av mange metoder. Kontroller at RNA fra hele delen er testet for å gi RNA integritet nummer (RIN) for prøven.

1. Velg vevsprøver for inkludering som får plass i parameteren av eksperimentell design. Oppklipp på kryostaten, gå til trinn 1.2. Hvis ikke, behandle vevet tilsvarende og gå til trinn 1.11.
2. Få to beholdere med tørris. Størrelsen avhenger av hvor mange eksempler.
   1. I den første beholderen av tørre isen, plasserer du en tom, merket 2 mL tube med vev koden.
      Merk: Det tar 10 min for rør for å fryse. Rør må være frosset før plassere vevet inn i dem. ellers vil vevet smelte på røret overflaten.
   2. En andre beholder med tørris, plassere vev fra-80 ° C fryser som krever RNA sjekk.
3. Rengjør kryostaten. Se trinn 4.7 detaljert rengjøringsprosessen.
4. Fjerne vev fra tørris og skjær en liten del av vev med et RNase dekontaminert barberblad. Vev bør være ca 1 cm x 1 cm i størrelse.
5. Plasser en ca. 3 mm høye haugen av optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte på en kryostaten "chuck" og la den delvis fryse. Deretter plassere vev over Tilpasningsverktøy for Office, ikke Skyv inn OCT, bare la det hvile på toppen.
6. Når OCT stivner, plassere chuck med montert vevet i kryostaten kutte armen og beliggenhet foran kryostaten bladet.
7. Trim på 30 μm deler til vev er selv.
8. Kuttet 300 μm vev og sted i en frossen 2 mL tube. Sett røret i tørris.
9. Fjern vev fra "chuck" og Legg inn tørris helt klar til å sette bort.
10. Gjenta trinn 1.4-1.9 for alle vev.
11. Når alle prøver er fullført, ekstra RNA ved hjelp av RNA utvinning kit leveres (Tabell for materiale #15). En detaljert protokoll tilbys med RNA utvinning kit. Følg alle instruksjonene inkluderer det frivillig steget å tørke samling rør membranen og det frivillig steget for DNase fordøyelse (Tabell for materiale #16).
12. Teste integriteten til utdraget RNA via en kvalitet vurdering bioanalyzer¹⁴.

2. Forbered før starter snitting for LCM

1. Rengjør lysbilder innehaverne før hver runde vev snitting for LCM. Utføre klargjøringsprosedyren dagen før bruk tillate fullstendig tørke over natten.
   Merk: lysbilde holdere brukes til vev delen fiksering i etanol og lysning i xylen.
   1. Skyv holderen rengjøringsprosessen: skyll med RNase renseinstallasjon etterfulgt av diethyl pyrocarbonate behandlet (DEPC) vann. La tørr overnatting opp ned på en RNA/DNA/Nuclease gratis overflate og unngå støv eller andre luftbåren forurensning.
      Forsiktig: DEPC er svært giftig og bør håndteres og avhendes bruker EH & S standard farlige kjemikalier-protokollen.
2. Ren børster snitting med RNase decontaminator og la tørre over natten. Unngå støv og andre forurensninger.
3. Sted membranen glir under UV-lys i 30 min ved romtemperatur. Gjør ikke utsett lysbildene for UV-mer enn 1-2 dager før bruk. Dette forbedrer binding av vevet i membranen lysbildet.
   Merk: Trinn 2.3 kan kombineres med trinn 4, som tillater lysbildet UV-behandling på samme dag som vev snitting (se trinn 4.4).

3. forberedelse fiksering løsninger med RNase kostnadsfritt vann og høy kvalitet etanol

Merk: Alle løsninger er forberedt frisk for hvert eksperiment. Kontroller at lysbildeholderen rengjøringsprosessen fra trinn 1.1 er fullført. Alle løsninger er utarbeidet i lysbildet holdere.

1. Plass 30 mL av 100% etanol i ett lysbildeholderen.
2. Fortynne etanol med RNase/DNase/Nuclease gratis vann. Sted 30 mL av 95% etanol i en Skyv holderen og lagt på is.
3. Fortynne etanol med RNase/DNase/Nuclease gratis vann. Sted 30 mL av 70% etanol i en Skyv holderen og lagt på is.
4. Sted 30 mL av 100% xylen i to separate lysbildet holdere og merke dem som #1 og #2.

4. forberede kryostaten vev snitting

1. Få en bøtte med isen for etanol løsninger og en beholder med tørris for vevet.
   Forsiktig: Tørris er svært kald, så bruk vernehansker. Ikke plass is og tørris i samme container. Ulike temperaturer i isen og tørris vil føre dem til skjemaet sammen i en ubestemmelig temperatur.
2. Fjern vev fra-80 ° C fryser og sted på tørris transport til kryostaten.
3. Kryostaten innstillinger:
   1. Angi snittykkelsen 14 μm.
   2. Angi trim tykkelse til 30 μm å bevare vev antallet.
   3. Kryostatens med doble kammer- og prøvetemperatur holde temperaturer, satt kammertemperaturen (CT) til-18 ° C. Kryostatens med én innstilling, satt temperaturen til-17 ° C.
   4. Kryostatens med doble kammer- og prøvetemperatur holder temperaturen, satt objektet temperaturen (OT) til-16 ° C.
      Merk: OT må være varmere enn CT å sikre selv kutte. Hvis vevet er fortsatt shredding, OT kan økes til-15 ° C og CT kan økes til-18 ° C.
4. Plass vevet i kryostaten minst 20 min skal kunne komme til optimal temperatur.
   Merk: Hvis vevet ikke er for optimal temperatur, vil det makulere ved skjæring. Ikke plass vevet i 20 ° C natten før å bevare RNA integritet og forhindre isdannelse krystall. Tillate vev så mye tid som nødvendig å equilibrate til optimal temperatur å kutte jevnt. Valgfri implementering av lysbildet inkubasjon under UV kan oppstå her (se trinn 1.3).
5. Sett "chuck" i kryostaten minst 20 min å tillate for å komme ned til temperaturen på kryostaten.
6. Sett de rene penslene i kryostaten minst 20 min å tillate for å komme ned til temperaturen på kryostaten.
7. Rengjør kryostaten
   1. Rengjør scenen med en 1:1 blanding av RNase renseinstallasjon og 70% etanol fortynnet med RNA/DNA/Nuclease gratis vann for å hindre frysing på scenen.
   2. Rengjør en ny disponibel kryostaten blad med RNase renseinstallasjon og plass i holderen på scenen. At minst 20 min for kryostaten bladet til å komme til temperaturen på kryostaten.
   3. Rengjør stabiliseringsplaten med RNase renseinstallasjon og legge til scenen. At minst 20 min for stabiliseringsplaten å komme til temperaturen på kryostaten.
      Merk: En Stabiliseringsplaten er ikke nødvendig for skjæring, men anbefales. Hvis en stabiliseringsplaten ikke er tilgjengelig, fungerer renset pensel som et alternativ. Hvis stabiliseringsplaten ikke er på riktig temperatur, vil vevet smelte eller stikke på kutte.

5. skjæring vev

1. Skjær en liten bit av vev (~ 1 cm x 1 cm) snitting. Returner resten vevet tørris /-80 ° C fryser.
   Merk: Kontroller at delen vev er ~ 95% lillehjernen cortex, der Purkinje celler finnes.
2. Plasser en ca. 3 mm høye haugen av OCT å dekke "chuck". Start med å bygge lagene øverst i en langsom, sirkulær bevegelse, inntil det er en liten stabel.
3. Når OCT delvis frosset, men det er fortsatt noen væske i midten plasser vev på OCT. Ikke Skyv vevet dypt i oktober Tillat vevet å sitte på OCT til helt frossen. Dette vil ta 1-2 min.
4. Plass "chuck" med frosne OCT og vev i kryostaten kutte armen. Justere vevet så det er flush med knivbladene.
5. Kan vev å sitte i kutte armen i 15-20 min å justere til nye temperatur.
   Merk: Avhengig av tykkelsen av vev, er tid nødvendig for temperatur acclimation. Kan vev å sitte så lenge for å klippe rent. Justere OT og CT å hjelpe med vev temperatur acclimation.
6. Sakte flytte vevet nærmere til bladet. Når vevet har nådd bladet, starte trim prosess. Trim tykkelse bør settes til 30 μm.
7. Klipp 2-3 x til cortex-lag er synlige.
8. Plasser og Juster stabiliseringsplaten like over kryostaten bladet.
   Merk: En sølv linje vises fra lyset i kryostaten på grensesnittet av bladet og stabiliseringsplaten. Dette angir stabiliseringsplaten står rett over kanten av bladet.
9. Begynner å kutte delene på 14 μm. Riktig kuttet delene blir flatt under stabiliseringsplaten.
   Merk: Hvis vevet er fast, kontroller at Stabiliseringsplaten er kaldt nok. Hvis nødvendig, å plassere et stykke tørt is på utsiden (siden ikke berører scenen) vil raskt chill stabiliseringsplaten.
10. Skjær 4-6 deler og justere dem vannrett over kryostaten scenen.
11. Angling lysbildet, plukke opp alle biter av vev samtidig.
    Merk: Ved hjelp av børster, løft opp endene av vevet skal være tilgjengelige for lysbildet ved henting. Ikke plukke opp ett avsnitt om gangen. Eksponering til romtemperatur luft vil forringe RNA integritet.
    Forsiktig: Ikke la membranen touch scenen av kryostaten. Hvis membranen berører scenen, det vil begynne å koble fra av objektglass og vil føre til feil når prøver LCM.
12. Umiddelbart gå til trinn 6. Ikke utsette fiksering.

6. fastsettelse vev/flekken-mindre visualisering

1. Straks flytte til etanol fiksering protokollen
2. Plasser lysbildet i lysbildeholderen med 70% etanol i 2 minutter, på is.
3. Plasser lysbildet i lysbildeholderen med 95% etanol for 45 s-på is.
4. Plasser lysbildet i lysbildeholderen med 100% etanol i 2 minutter, på RT.
5. Dypp lysbildet 3 ganger i lysbildeholderen med xylen 1-på RT.
6. Plasser lysbildet i lysbildeholderen med xylen 2 i 5 min-på RT.
7. La tørke i et rent område for minst 30 min. lengre tørre klokkeslett er optimal, opp til 60 min.
   Forsiktig: Stå opp lysbilder for tørking i avtrekksvifte. Xylen er flyktige. Legging lysbilder flat får xylen bassenget i delen vev som vil føre til vev er for mørkt.

7. tilleggsutstyr-Lysbilde lagring

1. Plass tørket lysbilder i individuelle 50 mL rør (ett lysbilde per tube) og plass i fryseren-80 ° C i opptil 7 dager.
   Merk: Lysbildene skal være tørr før plassere i-80 ° C fryseren. Ikke bruk fuktighet inne i røret som partikler vil legge inn i vev og membran. Kontroller at rør hetten er stram; Hvis ikke, kondens oppstår på lysbildet når tining for bruk.
   Forsiktig: RNA integritet reduseres etter 7 dager, som gjør kvaliteten på vev visualisering.

8. tining lagret lysbilder for bruk

1. Fjern røret med ett lysbilde fra-80 ° C fryseren 1t før bruksområde.
2. Ikke åpne røret umiddelbart. At røret for å komme til romtemperatur. Kondens skjer på utsiden av røret bare.
3. Når røret har kommet til romtemperatur og alle kondens er borte (ca 30-40 min), fjerne hetten og utsette lysbildet til romtemperatur luft.
4. La lysbildet å acclimate til romtemperatur i 15-20 min. la lysbildet inne i røret med cap fjernet.
   Merk: Lysbildet er nå klar for LCM.

9. laser fange Microdissection Purkinje celler:

Merk: Denne delen av protokollen vil bare diskutere detaljene knyttet til fange Purkinje celler for påfølgende RNA sekvensering. Denne delen forutsetter at brukeren er kjent med UV laser fange mikroskopet og tilknyttede programvaren.

1. Ren mikroskop scenen og samlingen cap arm med RNase renseinstallasjon.
2. Med hansker hender, plasserer du lysbildet på mikroskopet og 500 μL ugjennomsiktig cap i samlingen armen.
   Merk: Alltid sikre riktig RNA teknikk ved rengjøring arbeidsområdet med RNase renseinstallasjon og bruke hansker hender mens berører lysbildet eller ugjennomsiktig cap. Hanskene kan fjernes når lysbildet og cap er på plass og laser fangst har startet.
3. Ved lav forstørrelse, justere ugjennomsiktig lokket over lillehjernen vevet, sikre at lokket dekker hele området visualisert i øyet stykke.
   Merk: Bare øyet stykke mikroskopet vises hvis ugjennomsiktig hetten er sentrert. Kameraet vises ikke hvis hetten er midtstilt over vevet. Avhengig av laser fange området design, vil visualisering gjennom ugjennomsiktig cap enten være i øyet stykke bare eller visualisert både i øyet stykke og kameraet.
4. Visualiser lillehjernen lagene med 5 x - 10 x linsen og Plasser markøren over delen hvor molekylær lag og granule celle lag skjærer (Purkinje celle laget).
5. Flytt til 40 X og visualisere Purkinje celler.
   Merk: Se figur 1 og figur 2 for eksempel visualiseringer.
6. Starte fanger Purkinje celler.
   Merk: Utføre RNA-sekvensering, minst 5 ng av kreves. Ca 1600-2000 Purkinje celler resultere i nok RNA materiale for sekvenser. RNA blir stabil for opptil 8 timer på mikroskopet. Test UV energi og UV fokus før samling å sikre er riktig. Over tid, vevet vil fortsette å tørke ut og UV energi og UV fokus må endres.

10. RNA samling innlegget LCM

1. Forberede lyseringsbuffer celle (forberede fersk hver gang)
   1. Fortynne 2-mercaptoethanol i lyseringsbuffer på 1: 100 (10 μL:1 mL, henholdsvis). Lyseringsbuffer (RLT) finnes i Tabellen for materiale (#14 og #15).
2. Legge til 50 μL av cellen lyseringsbuffer ugjennomsiktig cap, med cap grossist. Lukk forsiktig røret over hetten.
3. La røret opp ned for 1 min.
4. Vortex tube for 30 s og raskt spinne lyseringsbuffer til bunnen av røret.
5. Åpne røret og gjenta 10.2-10.4.
6. Sett røret som inneholder 100 μL lyseringsbuffer og RNA fra-80 ° C fryseren til alle prøver er ferdig og klar for RNA utvinning (Tabell for materiale #14).

Representative Results

Denne protokollen detaljer trinnene for å forberede frisk frosne obduksjon hjernevev for UV-LCM. Grundig spesifikasjoner og merknader gis for kryostaten skjæring, som det kan være vanskelig å kutte frisk frosne hjernevev med en høy grad av presisjon. Det viktigste punktet å vurdere er at fersk frossent er svært kaldt og krever en betydelig mengde tid til acclimate til varmere temperaturen på en kryostaten. Dette trinnet kan ikke flyttes, og den kan ikke være overdrevet hvor sentralt dette trinnet er i suksess eller fiasko i denne protokollen. Hvis vevet ikke er skikkelig forberedt på kryostaten, vil alle påfølgende forsøk på å identifisere celler eller områder av interesse være svært vanskelig, om ikke umulig.

Etter kryostaten snitting og tørking tidsramme er vevet klar for LCM. Når visualisere vevet under mikroskopet, er mobilnettet lag av lillehjernen lett synlig med 5 X og 10 X målet objektiver. Figur 1 viser representant bilder av vev fast i etanol bare (figur 1A) og vev ruges i xylen etter etanol fiksering (figur 1B). Vi testet grundig ulike etanol og xylen inkubasjon tider / temperaturer på muligheten til å både fikse og visualisere vevet. Hvis vevet ikke er ruges lenge nok i xylen, nærmere det resulterende bildet ligner på figur 1A, i stedet for figur 1B. Xylen inkubasjon årsaker vev blir mørkere og bedre delineates mobilnettet lag enn gjør etanol alene. Når kutte i laser fange mikroskopet, er den 40 X linsen nødvendig for å sikre fanger bare Purkinje celler, og ikke de omkringliggende vev. Inkubasjon i xylen produserer en høy kvalitet, morphologically intakt bildet (figur 1D) sammenlignet med etanol fiksering alene (figur 1C).

For å forbedre effekten av våre vev, testet vi dekkglassvæske muligheten for en ugjennomsiktig cap. Protokoller UV-LCM benytte en væske fylt cap på en 200-500 μL rør som oppløser vev på kontakt. Væske fylt caps kan redusere vev visualisering, forårsaker det resulterende bildet være detaljert og iriserende under mikroskopet (figur 2A). Vev visualisering gjennom ugjennomsiktig cap (figur 2B) resultatene i en smoothened vev utseende som er mykere og skarpere i skjemaet. Spesielt gjør ugjennomsiktig lokket samling opptil 8 h uten behov for erstatning. Representant bilder av forbrukeravgift Purkinje celler strømsparingsmodus (figur 2C) og høy effekt (figur 2D, E) viser nøyaktig fjerning av bare Purkinje celle kroppen. For referanse, figur 2F viser en Luxol rask blå / Hematoxylin og Eosin (LH & E) farget lillehjernen cortex, som spesielt fremhever forskjellige lag av lillehjernen og plasseringen av Purkinje celler på den molekylære Lag og granule celle lag sammenstillingen.

Formålet med denne protokollen er å få høy kvalitet RNA for påfølgende RNA sekvensering. Vi testet våre protokollen på seks forskjellige obduksjon menneskelige hjerne prøver, som hver gjennomgikk tre dager med LCM samle 1500-2000 celler for RNA utvinning. Ca 6-8 h på mikroskopet produsert 500-700 celler, som ble deretter kombinert med tidligere dager LCM produktene før RNA ekstraksjon. Gjennomgikk RNA utvinning og var resuspended i 14 μL RNAse-fritt vann (Tabell for materiale #14). Alle seks prøver produsert høykvalitets RNA, med RNA integritet tall (RINs) ≥8 (Figur 3A-F). Denne fremgangsmåten resulterte i RNA mengder 11.5 ng (Figur 3A), 8.3 ng (Figur 3B), 13,6 ng (Figur 3C), 11.5 ng (Figur 3D), 14,9 ng (Figur 3E) og 26,9 NG (Figur 3F). Merk er at alle obduksjon menneskelige hjerne prøvene testet for RNA kvalitet før LCM (tabell 1). Hvis prøven opprinnelsesland har RNA fornedrelse, vil LCM bare ytterligere svekke integriteten.

Figur 1 : Lillehjernen lag og Purkinje celle visualisering med og uten xylen behandling. Representant bilder med og uten xylen følgende etanol fiksering og dehydrering. Molekylær lag (ML) og granule celle lag (GCL) er merket. Purkinje celler er merket med piler. (A) 5 X representasjon av lillehjernen lag visualisering uten xylen. Skala bar: 10 µm. (B) 5 X representasjon av lillehjernen lag visualisering xylen. Skala bar: 10 µm. (C) 40 X representasjon av lillehjernen lag visualisering uten xylen. Skala bar: 1 µm. (D) 40 X representasjon av lillehjernen lag visualisering xylen. Skala bar: 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2 : Purkinje celle visualisering før og etter MFM. Representant bilder på 40 X med xylen følgende etanol fiksering og dehydrering. ML og GCL er merket. Purkinje celler er merket med piler. (A) visualisering i mikroskopet under væske fylt cap på 40 x. Skala bar: 1 µm. (B) visualisering i mikroskopet under ugjennomsiktig samling cap på 40 X. Skala bar: 1 µm. (C) 5 X visualisering av lillehjernen cortex viser forbrukeravgift Purkinje celler mellom ML og GCL. Skala bar: 10 µm. (D) 40 X visualisering av en Purkinje celle før excision. Skala bar: 1 µm. (E) 40 X visualisering av vellykket Purkinje celle fange. Skala bar: 1 µm. (F) 20 X representant LH & E farget lillehjernen viser Purkinje cellen legemer med merkede piler. Skala bar: 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 : RNA kvalitetskontroll Bioanalyzer resultater MFM prøver. Paneler A-F Vis representant RNA kvalitetskontroll readouts. Hvert panel er et annet eksempel som gjennomgikk samme LCM prosessen med fiksering og visualisering med etanol og xylen bare. RNA integritet tallene (RINs) er alle > 8.0. Representant konsentrasjoner [] gir en avkastning på minst 5 ng av totalt. Alle prøvene var elut i 14 µL RNAse uten vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksempel	RIN - delen Prep	RIN - MFM	[RNA] - MFM	PMI-frosset
A	9.2	8.6	822 pg/µL	450 min
B	9.8	8	598 pg/µL	550 min
C	9.1	8.5	976 pg/µL	455 min
D	9.8	8.2	823 pg/µL	463 min
E	9.8	9.1	1069 pg/µL	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg/µL	1080 min

Tabell 1: Sammendrag av RNA integritet . Eksempel tallene tilsvarer bioanalyzer resultatene presentert i Figur 3. Delen forberedelser utføres før LCM å sikre at starter vev er av god kvalitet. Vist er det opprinnelige vev RINs fra delen forutbetalt, MFM RINs og konsentrasjonen av RNA fra LCM, samt evaluering intervallene til frosset (PMI-frossen) for vev.

Discussion

Protokollen presenteres her er spesielt modifisert for å være en rustfritt tilnærming visualisere morphologically forskjellige vev for UV-LCM. Denne metoden er utformet for å maksimere RNA integritet for påfølgende direkte RNA sekvensering, samtidig opprettholde en forsterket plan flate av vev visualisering. Muligheten til å skille ulike celletyper fangst, for å lage den reneste populasjonen av celler mulig, er avgjørende for å forstå ulike molekylær profiler i menneskelig vev¹⁵. I forbindelse med denne protokollen, vev valg er viktig, som bruk av antigen eller fargestoff bestemt reagenser benyttes ikke og derfor er ikke egnet for studier som krever en slik oppfatning. Mens dette er en begrensning av denne protokollen, av resulterende vev visualisering og RNA er ganske overlegen og opprettholde relevansen i andre eksperimentell design. Det finnes mange andre protokoller som også benytte alternative flekker metoder spesielt for UV - og IR-LCM å bevare RNA. Men de fleste andre metodene inneholder minst én flekker eller antigen bestemt reagens^6,16,17, er beregnet på én celle eller organ type (som ikke er menneskelig obduksjon vev)^{18,19, 20}, eller krever spesialisert RNA-seq kits å forbedre integriteten²¹. Cresyl violet (Nissl) flekker er en populær farge som inneholder reagens som brukes i mange protokoller som flekker atomkjerner i nervecellene i hjernen og forårsaker minst RNA fornedrelse⁶. Imidlertid er større kjernen av Purkinje cellen ikke også farget av cresyl violet, gir ingen betydelige fordeler for å visualisere Purkinje celler. Viktigere, identifisert vi bare én LCM studie i litteraturen som beskrevet samlingen av menneskelige Purkinje celler, som er av betydelig interesse for studiet av lillehjernen degenerative og utviklingsmessige lidelser. Denne studien farget frosne vev med cresyl fiolett og isolert Purkinje celler med en IR-LCM system; prøve RINs så lavt som 5 ble brukt, men ansett som akseptabelt for microarray analyse²². Derfor er dette den første protokoll studien som er designet spesielt for høy kvalitet RNA fra Purkinje celler i evaluering av menneskelig lillehjernen forbrukeravgift via UV-LCM.

Stabiliteten av RNA i evaluering av menneskelig vev er et velkjent hinder, RNA molekyler i cellene er ganske underlagt naturlig nedbrytning etter døden. Spesielt har mRNA vist seg å være de mest følsomme nucleolytic fornedrelse⁵. Overvåking av obduksjon intervallet (PMI) er frysing (PMI-frossen) en beregning som har vist noen sammenheng med RNA fornedrelse i noen studier^23,24,25. Tabell 1 viser imidlertid PMI-frosne intervaller for seks utvalgene som vist i Figur 3, som angir ingen relativ sammenheng med PMI verdier og RNA kvalitet. Derfor er det nødvendig å utføre due diligence i å sjekke RNA integritet før du starter en laser fange prosjektet. Hvis RNA integriteten til Start utvalget av lav kvalitet, blir det resulterende RNA fra en LCM produktet enda lavere kvalitet. Når lave RNA integritet ikke unngås, kan andre metoder for å styrke RNA for sekvensering brukes i tillegg til denne protokollen²¹. Spesielt, kan lav-input eller forringet RNA føre til dempet kompleksitet og suboptimal resultater som ofte nødvendiggjør ekstra forsterkning trinnene. Tillegg av PCR sykluser forsterkning har blitt vist å forsterke sekvenser ulikt, samt lage Les duplikater på sekvensering^26,27. Utnyttelse av høy kvalitet fra LCM prøver for sekvensering er derfor svært fordelaktig.

Metoden visualisering ansatt i denne protokollen tungt avhengig av brukeren er kompetanse når fersk frosset vev på en kryostaten. Protokollen går inn detaljert informasjon om hvordan du best forberede vevet snitting og plassere vev på lysbildet. Dette er utvilsomt de to viktigste trinnene i denne protokollen. Hvis vevet ikke er acclimated til kryostaten temperaturen, oppstår shredding, som hindrer betydelig morfologiske kvaliteten av vev. Shredding er et resultat av noen potensielle problemer; Feilsøking muligheter inkludere vente lengre for vev å komme til temperatur eller endre kryostaten OT og/eller CT for varmere. Når vev er vellykket kuttet og plassert på scenen, er det viktig å orientere vevet og lysbildet riktig å sikre alle vev passer membranen og kan bli nøyaktig plukket opp fra scenen. Når du prøver å plukke opp vev fra kryostaten scenen, vevet må være kaldt, og lysbildet skal være varm. Alternative protokoller finnes som anbefaler for å chill lysbildet før plukke opp vev og oppvarmet med en finger over området av vev plassering²⁸; men i våre hender, dette gir ikke noen fordel, og ofte forårsaker problemer med å plukke opp vev og overdreven vev folder. Med en ved romtemperatur smelter vev umiddelbart ved kontakt med lysbildet. For å sikre en ren pickup, er det nødvendig å vinkle lysbildet slik at det kommer i kontakt med vev på membran området, men ikke gå så langt som å røre scenen selv. Membranen begynner å koble fra av objektglass hvis det berører scenen, som skader membranen og lager laser fange vanskelig. Hvis dette skjer, vil det være merkbar når LCM har begynt og kan ikke angres. Feilsøkingsalternativer er begrenset. Hvis til enhver tid det er tenkt membran eller lysbilde har blitt kompromittert, er det lurt å forkaste. Det anbefales å praksis frisk frossent snitting før du starter et prosjekt eller bruke en patologi kjerne som kan produsere høykvalitets vev snitting. Men hvis bruker en kjerne, sørge for at riktig RNA teknikk er fulgt for å hindre RNase forurensning. RNA fornedrelse kan lett oppstå når feil teknikken brukes.

Vi har presentert her en komplett metode for rustfritt visualisering av Purkinje celler i evaluering av menneskelig lillehjernen i forbindelse med UV-LCM. Vi har også inkludert riktig RNA bevaring metoder og teknikker for å sikre høye nivåer av RNA integritet. Denne protokollen er ikke nødvendigvis gjelder alle én celle eller vev type gjør men opprettholder kravet om at området/cellen rundt er morphologically skilles fra den omkringliggende stroma uten behov for antigen eller fargestoff innpassing.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.