Summary
Ce protocole utilise une approche sans tache de visualiser et d’isoler les cellules de Purkinje dans les tissus frais congelés de cervelet humain post-mortem par microdissection de saisie de laser. Ce protocole vise à produire des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour RNA-sequencing.
Abstract
Microdissection de saisie de laser (LCM) est un outil avantageux qui permet la collecte de cellules cytologiquement et/ou phénotypiquement pertinentes ou régions de tissus hétérogènes. Produit capturé peut être utilisé dans une variété de méthodes moléculaires pour les protéines, isolement d’ADN ou d’ARN. Cependant, la préservation de l’ARN de tissus post-mortem de cerveau humain est particulièrement difficile. Techniques de visualisation standard pour LCM nécessitent histologique ou méthodes de coloration immunohistochimique qui peuvent encore dégradent RNA. Par conséquent, nous avons conçu un protocole en acier inoxydable pour la visualisation dans LCM avec le but de préserver l’intégrité du RNA dans le tissu de cerveau humain post-mortem. Les cellules de Purkinje du cervelet est un bon candidat pour une visualisation en acier inoxydable, en raison de sa taille et sa localisation caractéristique. Le cortex cérébelleux a couches distinctes qui diffèrent dans la densité des cellules, ce qui les rend un bon archétype d’identifier sous microscope grossissement élevé. Les cellules de Purkinje sont grands neurones situées entre la couche de cellules de granules, qui est un réseau cellulaire dense de petits neurones, et la couche moléculaire, ce qui est rare dans les corps cellulaires. Grâce à cette architecture, l’utilisation de la visualisation en acier inoxydable est faisable. Autres systèmes d’organe ou cellule qui imitent ce phénotype conviendraient également. Le protocole en acier inoxydable est conçu pour corriger les tissus frais congelés avec de l’éthanol et supprimer les lipides avec xylène pour meilleure visualisation morphologique sous microscopie optique grossissement élevé. Ce protocole ne tient pas compte d’autres méthodes de fixation et est spécialement conçu pour les échantillons de tissus frais congelés capturées à l’aide d’un rayonnement ultraviolet (UV)-système de LCM. Nous présentons ici un protocole complet pour sectionnement et fixation tissu cérébelleux humain congelé frais post mortem et purification de l’ARN des cellules de Purkinje isolées par UV-LCM, tout en préservant la qualité de RNA pour RNA-sequencing ultérieur. Dans nos mains, ce protocole produit des niveaux exceptionnels de visualisation cellulaire sans besoin de réactifs de coloration et rendements RNA avec des nombres élevés de l’intégrité des RNA (≥8) selon les besoins pour des expériences de profilage transcriptionnels.
Introduction
Microdissection de saisie de laser (LCM) est un précieux outil de recherche qui permet de séparer les cellules pathologiquement pertinentes pour les évaluations subséquentes moléculairement entraînée. L’utilisation des analyses moléculaires dans ces échantillons de tissus hétérogènes et la corrélation avec les données cliniques et pathologiques est une étape nécessaire pour évaluer l’importance translationnelle de la recherche biologique1. Lors de l’analyse des données d’expression de gène de l’ARN, l’utilisation de coupes de tissus congelés est hautement recommandée car il permet l’excellente qualité de l’ARN ainsi que maximiser la quantité2. Il a été bien établi que la qualité et la quantité d’ARN sont essentiels pour des données significatives de RNA séquençage3. Toutefois, lorsque vous utilisez RNA de tissus frais congelés post mortem pour LCM, dégradation de l’ARN est un défi majeur, car il se produit immédiatement après la mort et son étendue est médiée par des facteurs divers associés avec les tissus collection méthode4,5 . En outre, dégradation de l’ARN est exacerbée lorsque des techniques de coloration sont nécessaires pour reconnaître les détails histologiques et l’identification de la cellule. Spécialisée de coloration des techniques telles que l’hématoxyline et éosine, teinté de Nissl, immunofluorescence et l’immunohistochimie sont utiles pour différencier les cellules du stroma environnant, mais auraient dû être divulgués à dégrader RNA et modifier l’expression de la transcription 6de profils. Par conséquent, notre laboratoire a créé un protocole en acier inoxydable spécialement conçu pour préserver les RNA dans post mortem cervelet humain aux fins de séquençage de RNA après isolement de LCM des neurones de Purkinje.
Dans le traitement des tissus congelés frais pour LCM, la méthode de fixation peut affecter variablement d’intégrité d’ARN et de tissus. Fixation de formol est standard pour la préservation morphologique, mais causes réticulation qui peuvent fragmenter RNA et nuire à la RNA amplification7. Fixation de l’éthanol est une meilleure alternative pour les ARN, comme c’est un fixateur coagulantes qui n’induit pas de réticulation1. Afin d’améliorer la visualisation de la morphologie tissulaire, xylène est le meilleur choix, car il supprime des lipides dans les tissus. Cependant, il existe connus des limitations lors de l’utilisation de xylène dans LCM, car les tissus peuvent sécher et devenir cassant causant fragmentation de tissu sur laser capture7. Xylène est aussi une toxine volatile et doit être manipulé correctement sous une hotte. Néanmoins, le xylène a été démontré pour améliorer la visualisation des tissus tout en préservant l’intégrité de RNA8. Par conséquent, notre protocole est centrée autour de l’utilisation de la fixation de l’éthanol 70 % et de déshydratation de l’éthanol, suivie d’incubation xylène pour plus de clarté morphologiques.
Il est important de noter les différents types de systèmes de microdissection laser-basé, comme ils auraient dû être divulgués diffèrent en vitesse, précision et qualité de RNA. Laser infrarouge (IR) capture microdissection et les systèmes microdissection des microfaisceaux de laser ultraviolets (UV) étaient les deux plates-formes de LCM nouveaux qui ont émergé, presque en même temps,8. Le système IR-LCM emploie un « système de contact » à l’aide d’un film thermoplastique transparent placé directement sur la section de tissus et cellules d’intérêt sélectivement adhèrent au film par impulsions ciblées d’un laser IR. Alternativement, le système UV-LCM est un « système de non-contact » par laquelle un faisceau laser focalisé coupe loin des cellules ou des régions d’intérêt dans le tissu ; Selon la configuration à deux plates-formes commerciales actuellement disponibles qui utilisent soit un design microscope inversé ou redressée, tissu est acquis dans un dispositif de collecte par une onde de pression induite par laser qu’il propulse contre la gravité ou le tissu est recueillis par gravité, respectivement. Des avantages significatifs du système UV-LCM incluent accélérer l’acquisition cellulaire, collection sans contamination avec l’approche sans contact et une dissection plus précise grâce à un beaucoup plus petit laser faisceau de diamètre9. Ce protocole a été spécialement conçu pour un système UV-LCM et n’a pas été testé dans un système IR-LCM. Soit design du système UV-LCM, lorsque les cellules s’accumulent dans le capuchon de la collection, l’utilisation d’une lamelle qui améliore la clarté cellulaire au cours de la microscopie ne convient pas, car les cellules seraient incapables d’entrer dans le plafond de la collection. Par conséquent, pour améliorer la visualisation des tissus, nous avons testé l’utilisation de bouchons collection Opaque, qui sont conçus pour agir comme un lamelle couvre-objet pour visualisation microscopique dans les systèmes UV-LCM, contre casquettes collection remplie liquide. Casquettes de la collection remplie liquide peuvent être difficile, car le liquide est soumise à l’évaporation et doit être remplacé fréquemment alors qu’il travaillait au microscope. Le temps devient un facteur important pour la stabilité du RNA, comme le tissu capturé dissout immédiatement7.
Notre laboratoire étudie les changements neuropathologique post-mortem dans le cervelet des patients atteints de tremblement essentiel (he) et neurodégénératives apparentées du cervelet. Nous avons démontré de modifications morphologiques centrées sur des cellules de Purkinje qui distinguent ET cas par rapport aux contrôles, y compris un réduction du nombre de cellules de Purkinje, a augmenté de régression dendritique et une variété de changements axonales, qui nous conduit à postuler que Purkinje dégénérescence des cellules est une fonctionnalité de base biologique ET pathogenèse10,11,12,13. Transcription de profilage a été utilisé dans de nombreuses maladies neurologiques pour explorer les bases moléculaires sous-jacents des changements cellulaires dégénératifs. Cependant, profils transcriptionnelles des échantillons hétérogènes, tels que des régions de tissus du cerveau, peuvent effectivement masquer l’expression de transcriptions de faible abondance et/ou diminuer la détection des changements moléculaires qui se produisent uniquement dans une petite population de touchés cellules, telles que les cellules de Purkinje du cortex cérébelleux. Par exemple, des cellules de Purkinje sont largement dépassés en nombre par les cellules de granules abondante dans le cortex cérébelleux par environ 1 : 3000 ; ainsi, pour cibler efficacement leur transcriptome exige l’isolation spécifique de ces neurones. Le cortex cérébelleux est délimité par des couches distinctes qui diffèrent dans la densité cellulaire et la taille des cellules. Cette architecture cellulaire est idéale pour visualiser dans un échantillon de tissus frais congelés sans réactifs de coloration contenant du colorant. En théorie, ce protocole pourrait également être appliqué à d’autres types de tissus qui ont même tissu distinctif organisation.
Ce protocole a été conçu pour fonctionner spécifiquement pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem. Plusieurs protocoles existent pour la fixation, la coloration de la visualisation et la préservation de RNA de nombreux types de tissus aux fins des deux IR et UV-LCM. Lorsque l'on envisage un plan expérimental pour UV-LCM, individus devraient adapter leur protocole au mieux les besoins et exigences de début et de fin des matériaux. Ici, nous combinons plusieurs aspects de différents protocoles de LCM pour fournir une méthode améliorée pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post mortem sans avoir besoin de colorant contenant des réactifs de coloration pour préparer l’ARN de haute qualité pour transcriptome séquençage.
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Protocol
Tous les échantillons humains utilisés dans le présent protocole ont été obtenus avec le consentement éclairé et ont été approuvés par l’interne Review Board (IRB) de Columbia University et l’Université de Yale.
Remarque : L’intégralité du présent protocole doit suivre RNA stricte gestion des lignes directrices, auquel cas une main gantée est toujours utilisée, toutes les surfaces sont nettoyées avec un décontaminant RNase et tous les documents de travail sont DNA/RNA/nucléase gratuite.
1. essai ARN l’intégrité des tissus avant LCM à partir
Remarque : Tests de qualité de RNA peut être fait par de nombreuses méthodes. Veiller à ce que l’ARN à partir de la section entière est testée afin de fournir un nombre représentatif de l’intégrité des RNA (RIN) pour l’échantillon.
- Sélectionner avec soin les échantillons de tissus pour l’inclusion qui s’inscrivent dans le paramètre du plan expérimental. Si couper au cryostat, déplacer vers l’étape 1.2. Si ce n’est pas le cas, traiter le tissu en conséquence et passer à l’étape 1.11.
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Téléchargez les deux conteneurs de glace sèche. La taille dépendra du nombre d’échantillons.
- Dans le premier conteneur de glace carbonique, placer un tube à vide, étiquetée 2 mL avec le code de tissu.
Remarque : Il faut 10 min pour les tubes à geler. Tubes doivent être congelés avant de placer le tissu en eux ; Sinon, le tissu va fondre sur la surface du tube. - Dans un deuxième contenant de la glace sèche, placez le tissu d’un congélateur à-80 ° C nécessite de cocher RNA.
- Dans le premier conteneur de glace carbonique, placer un tube à vide, étiquetée 2 mL avec le code de tissu.
- Nettoyer le cryostat. Voir étape 4.7 pour procéder à un nettoyage.
- Retirez le tissu de la glace sèche et couper une petite mèche de tissu avec une lame de rasoir de RNase décontaminé. Le tissu doit être environ 1 cm x 1 cm de taille.
- Placez un monticule élevé d’environ 3 mm de la température de coupe optimale (OCT) composé sur un cryostat « chuck » et lui permettre de geler partiellement. Ensuite, placez le tissu sur le dessus de l’outil OPO — ne pas pousser en OCT, simplement lui permettre de se reposer sur le dessus.
- Une fois OCT durcit, placez le mandrin avec le tissu monté dans le bras de coupe cryostat et la position en face de la lame du cryostat.
- Garniture à 30 μm sections jusqu'à ce que le tissu soit même.
- Couper 300 μm du tissu et du lieu dans un tube congelé 2 mL. Placer le tube dans la glace sèche.
- Retirez le tissu de la « chuck » et remettre en place sur la glace jusqu’au moment de ranger.
- Répétez les étapes 1,4 à 1,9 pour tous les tissus.
- Une fois que tous les échantillons sont terminées, extraire l’ARN utilisant le kit d’extraction d’ARN fourni (Table des matières #15). Un protocole détaillé est fourni avec le kit d’extraction d’ARN. Suivez toutes les instructions, y compris l’étape facultative pour sécher la membrane de tube de collection et l’étape facultative pour la digestion de DNase (Table des matières #16).
- Testez l’intégrité de l’ARN extrait via une qualité évaluation bioanalyzer14.
2. préparer avant le départ de sectionnement pour LCM
-
Nettoyer les détenteurs de diapositives avant chaque série de tissus sectionnement pour LCM. Effectuez la procédure de nettoyage le jour pour laisser sécher une nuit complète avant chaque utilisation.
Remarque : détenteurs de diapositive sont utilisés pour la fixation de section du tissu dans l’éthanol et la compensation dans le xylène.- Glisser le porte-procédure de nettoyage : rincer avec décontaminant RNase suivie de diéthyl pyrocarbonate traité (DEPC) l’eau. Laisser sécher pendant la nuit à l’envers sur une surface libre de DNA/RNA/nucléase, évitant toute poussière ou toute autre contamination aéroportée.
Mise en garde : DEPC est hautement toxique et doivent être traités et éliminés en utilisant le protocole standard de produits chimiques dangereux EH & S.
- Glisser le porte-procédure de nettoyage : rincer avec décontaminant RNase suivie de diéthyl pyrocarbonate traité (DEPC) l’eau. Laisser sécher pendant la nuit à l’envers sur une surface libre de DNA/RNA/nucléase, évitant toute poussière ou toute autre contamination aéroportée.
- Nettoyer les pinceaux pour la coupe avec de la RNase decontaminator et laisser sécher pendant la nuit. Éviter toute poussière et autres contaminants.
- Déposer la membrane les lames sous ultraviolets pendant 30 min à température ambiante. Ne pas exposer que les diapositives à UV plus de 1 ou 2 jours avant d’utilisent. Cela renforce la liaison du tissu à la diapositive de la membrane.
Remarque : Étape 2.3 est cumulable avec l’étape 4, qui permet pour diapositive de traitement UV se produise le même jour comme tissu sectionnement (voir étape 4.4).
3. préparer des Solutions de Fixation avec l’eau libre de RNase et d’éthanol de qualité
Remarque : Toutes les solutions sont préparées frais pour chaque expérience. Assurez-vous que le support de diapositive, procédure de 1,1 de l’étape de nettoyage est terminé. Toutes les solutions sont préparées dans les supports de la diapositive.
- Placer 30 mL d’éthanol à 100 % dans un porte-lames.
- Éthanol dilué avec de l’eau libre de RNase/DNase/nucléase. Place 30 mL d’éthanol à 95 % dans un glisser le porte- et mettre sur la glace.
- Éthanol dilué avec de l’eau libre de RNase/DNase/nucléase. Place 30 mL d’éthanol à 70 % dans un glisser le porte- et mettre sur la glace.
- Place 30 mL de xylène à 100 % dans deux séparer les détenteurs de la diapositive et marquez-les comme #1 et #2.
4. préparer le Cryostat pour la Coupe du tissu
- Obtiens un seau de glace pour les solutions d’éthanol et un contenant de glace carbonique pour le tissu.
Mise en garde : La glace sèche est extrêmement froide, donc utilisez des gants de protection. Ne placez pas de glace et neige carbonique dans le même conteneur. Températures différentes dans la glace et la neige carbonique eux entraînera pour former ensemble à une température pour une période indéterminée. - Retirer le tissu du congélateur-80 ° C et lieu sur glace pour le transport au cryostat.
-
Paramètres du cryostat :
- Définir l’épaisseur de coupe à 14 μm.
- Définir l’épaisseur de garniture à 30 μm pour préserver la quantité de tissu.
- Pour cryostats avec chambre double et spécimen tenant des températures, régler la température de la chambre (CT) à-18 ° C. Pour cryostats avec une option de configuration, réglez la température à-17 ° C.
- Pour cryostats avec chambre double et spécimen tenue température, régler la température de l’objet (OT) à-16 ° C.
Remarque : L’ancien testament doit être plus chaud que le CT pour assurer la même coupe. Si le tissu est toujours déchiquetage, l’ERGOTHÉRAPEUTE peut être augmentée jusqu'à-15 ° C et la CT peut être augmentée jusqu'à-18 ° C.
- Placer le tissu dans le cryostat pendant au moins 20 min à laisser revenir à température optimale.
Remarque : Si le tissu n’est pas à la température optimale, il déchiquette à la coupe. Ne pas placer le tissu à-20 ° C la veille à préserver l’intégrité de RNA et de prévenir la formation de cristaux de glace. Permettre le tissu autant de temps que nécessaire pour est proportionnelle à la température optimale pour couper en douceur. Une implémentation facultative d’incubation de diapositive sous exposition aux UV peut se produire ici (voir étape 1.3). - Placer le « chuck » dans le cryostat pendant au moins 20 min permettre de descendre à la température du cryostat.
- Placer les brosses propres dans le cryostat pendant au moins 20 min permettre de descendre à la température du cryostat.
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Nettoyer le cryostat
- Nettoyer la scène avec un mélange 1:1 de RNase décontaminant et 70 % d’éthanol dilué à l’eau libre nucléase/DNA/RNA pour prévenir le gel sur scène.
- Nettoyer une nouvelle lame jetable cryostat décontaminant RNase et les placer dans le support de lame sur la scène. Laisser au moins 20 min pour la lame cryostat à revenir à la température du cryostat.
- Nettoyer la plaque anti-roll avec décontaminant RNase et joindre à la scène. Laisser au moins 20 min pour la plaque anti-roll à la température du cryostat.
Remarque : Une plaque anti-roll n’est pas requise pour la coupe mais il est vivement recommandée. Si une plaque anti-roll n’est pas disponible, une brosse de nettoyage fonctionne comme une alternative. Si la plaque anti-roll n’est pas à la bonne température, le tissu va fondre ou s’en tenir à la coupe.
5. découpe tissu
- Couper un petit morceau de tissu (~ 1 cm x 1 cm) pour la coupe. Retourner le tissu restant au congélateur de glace sèche /-80 ° C.
Remarque : Assurez-vous que la section de tissu est le cortex cérébelleux ~ 95 %, où se trouvent les cellules de Purkinje. - Placez un monticule élevé ancien environ 3 mm de OCT pour couvrir le « chuck ». Commencez par construire les couches sur le dessus en un lent mouvement circulaire, jusqu'à ce qu’il y a un petit monticule.
- Une fois que l’OCT est partiellement gelé, mais il y a encore peu de liquide dans le centre, placez le tissu sur le dessus de OCT. Ne poussez pas le tissu profondément en octobre autoriser le tissu de s’asseoir sur le dessus de OCT jusqu'à ce que complètement gelé. Cela prendra 1 à 2 min.
- Placer le « chuck » avec OCT congelé et les tissus dans le bras de coupe cryostat. Ajuster le tissu n’est ras de lame de coupe.
- Laisser le tissu de s’asseoir dans le bras de coupe pendant 15 à 20 min pour s’adapter à la nouvelle température.
Remarque : Selon l’épaisseur du tissu, il faut de temps pour l’acclimatation de la température. Laisser le tissu de s’asseoir aussi longtemps que nécessaire pour couper proprement. Ajuster les OT et CT pour aider à l’acclimatation de température des tissus. - Déplacer lentement le tissu de plus près à la lame. Une fois que le tissu a atteint la lame, démarrer le processus de compensation. Épaisseur de la garniture doit être définie sur 30 μm.
- Couper les 2 – 3 x jusqu'à ce que les couches du cortex sont visibles.
- Placer et aligner la plaque anti-roll juste au-dessus de la lame du cryostat.
Remarque : Une ligne argentée apparaîtra de la lumière dans le cryostat à l’interface de la lame et la plaque anti-roll. Cela indique la plaque anti-roll est directement sur le bord de la lame. - Commencer à couper les sections 14 μm. Les sections correctement coupées seront plat sous la plaque anti-roll.
Remarque : Si le tissu est coincé, assurez-vous que la plaque anti-roll est assez froide. Si nécessaire, placer un morceau de sec glaçons sur la volonté (côté sans toucher la scène) extérieur rapidement refroidir la plaque anti-roll. - 4 – 6 coupes et les aligner horizontalement sur la scène du cryostat.
- La pêche de la diapositive, ramasser tous les morceaux du tissu en même temps.
Remarque : En utilisant les brosses, soulevez les extrémités du tissu pour être plus facilement accessibles pour la diapositive à ramasser. Ne ramassez pas une section à la fois. Exposition à l’air de la température de la pièce va se dégrader l’intégrité RNA.
Mise en garde : Ne laissez pas la membrane toucher la scène du cryostat. Si la membrane touche la scène, il va commencer à se détacher de la lame de verre et qui provoquerait des erreurs lors d’une tentative de LCM. - Passer immédiatement à l’étape 6. Ne tardez pas de fixation.
6. fixation tissulaire/tache-moins visualisation
- Déplacer immédiatement vers le protocole de fixation de l’éthanol
- Placez la lame dans le porte-lame avec l’éthanol à 70 % pendant 2 min — sur la glace.
- Placez la lame dans le porte-lame avec éthanol à 95 % pour les 45 s — sur la glace.
- Placez la lame dans le porte-lame avec éthanol à 100 % pendant 2 min, à température ambiante.
- Tremper la lame 3 fois dans le porte-lame avec xylène 1 — à température ambiante.
- Placez la lame dans le porte-lame avec Xylène 2 pendant 5 min, à température ambiante.
- Laisser pour sécher dans un endroit propre pour au moins 30 min. de périodes sèches plus longues sont optimales, vers le haut à 60 min.
Mise en garde : Levez-vous de diapositives pour le séchage dans une hotte de laboratoire. Xylène est volatile. Pose lames plates provoquera xylène pour piscine dans la section de tissu, ce qui provoquera des tissus est trop sombre.
7. facultatif — Slide stockage
- Placer les lames séchées en bouteille de 50 mL tubes (une diapositive par tube) et de la place dans le congélateur à-80 ° C pendant 7 jours.
Remarque : Diapositives doivent être secs avant de les placer dans le congélateur à-80 ° C. Ne pas utiliser de déshydratant dans le tube comme particules seront intègrent dans le tissu et la membrane. S’assurer que le bouchon du tube est serré ; Si ce n’est pas le cas, condensation se produira sur la diapositive lorsque la décongélation pour utilisation.
Mise en garde : Intégrité de RNA diminue après 7 jours, à l’instar de la qualité de la visualisation des tissus.
8. dégel stockée diapositives pour une utilisation
- Retirez le tube avec une seule diapositive du congélateur-80 ° C 1 h avant l’utilisation prévue.
- Ne pas ouvrir immédiatement le tube. Laisser le tube à venir à la température ambiante. Condensation se produira à l’extérieur du tube seulement.
- Une fois que le tube est arrivé à température ambiante et toute condensation est allée (environ 30 à 40 min), retirer le capuchon et exposer la lame à l’air à température ambiante.
- Laisser la lame s’acclimater à la température ambiante pendant 15 à 20 min. laisser la lame à l’intérieur du tube avec le bouchon retirée.
Remarque : Slide est maintenant prêt pour LCM.
9. laser Microdissection de saisie des cellules de Purkinje :
Remarque : Cette section du protocole discutera seulement les spécificités liées à la capture des cellules de Purkinje pour l’ordonnancement de RNA ultérieur. Cette section suppose que l’utilisateur est familiarisé avec le microscope de capture laser UV et le logiciel affilié.
- Nettoyer la platine du microscope et la collection cap bras avec décontaminant RNase.
- Avec des mains gantées, placez la glissière sur le microscope et 500 μL un capuchon opaque dans le bras de la collection.
Remarque : Toujours s’assurer que la technique appropriée de RNA en nettoyant la zone de travail avec décontaminant RNase et utiliser mains gantées tout en touchant la diapositive ou un capuchon opaque. Gants peuvent être retirés une fois que la lame et le capuchon sont en place et capture laser a commencé. - À faible grossissement, aligner le bouchon opaque sur le tissu cérébelleux, veiller à ce que la PAC couvre toute la zone visualisée sur l’oculaire.
Remarque : Seulement l’oculaire du microscope montrera si le bouchon opaque est centré. La caméra s’affiche pas si le bouchon est centré sur le tissu. Selon le modèle de champ d’application de capture laser, la visualisation par le bouchon opaque sera soit sur l’oculaire seul ou visualisée dans l’oculaire et la caméra. - Visualiser les couches cérébelleuses avec 5 x - 10 x-objectif et placez le curseur sur la section où la couche moléculaire et la couche de cellules de granules croisent (la couche de cellules de Purkinje).
- Se déplacer à 40 X et visualiser les cellules de Purkinje.
Remarque : Voir Figure 1 et Figure 2 pour les visualisations de l’exemple. - Commencer à capturer des cellules de Purkinje.
Remarque : Pour effectuer la RNA-sequencing, au moins 5 ng d’ARN est nécessaire. Environ 1600-2000 Purkinje cellules entraîner suffisamment d’éléments pour l’ordonnancement de RNA. ARN sera stable jusqu'à 8 h au microscope. Tester l’énergie UV et UV se concentrer avant le prélèvement afin d’assurer des niveaux sont corrects. Au fil du temps, le tissu continuera à se dessécher et l’énergie UV et focus UV peuvent devoir être modifiée.
10. RNA Collection post LCM
-
Préparer le tampon de lyse cellulaire (préparer frais chaque fois)
- Diluer 2-mercaptoéthanol dans le tampon de lyse au 1/100 (10 μL:1 mL, respectivement). Tampon de lyse (RLT) figurent dans la Table des matières (#14 et #15).
- Ajouter 50 μL de tampon de lyse cellulaire au bouchon opaque, avec le bouchon vers le haut. Fermer soigneusement le tube au-dessus de la calotte.
- Maintenir le tube à l’envers pendant 1 min.
- Vortex le tube pendant 30 s et tourner rapidement le tampon de lyse au fond du tube.
- Rouvrir le tube et répétez les étapes 10.2 – 10,4.
- Placer le tube contenant 100 μL de tampon de lyse et l’ARN du congélateur à-80 ° C jusqu'à ce que tous les échantillons sont terminé et prêt pour l’extraction de l’ARN (Table des matières #14).
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Representative Results
Ce protocole détaille les étapes pour la préparation des tissus cérébraux humains congelés frais post mortem pour UV-LCM. Annotations et spécifications approfondies sont données pour la découpe du cryostat, comme il peut être difficile de couper le tissu cérébral congelées fraîches avec un degré élevé de précision. Le point le plus important à considérer est que les tissus frais congelés est extrêmement froid et nécessite une quantité importante de temps pour s’acclimater à la température la plus chaude d’un cryostat. Cette étape ne peut pas être précipitée, et il ne peut pas être exagéré comment central cette étape consiste dans le succès ou l’échec du présent protocole. Si le tissu n’est pas bien préparé au cryostat, toutes les tentatives ultérieures à identifier des cellules ou des régions d’intérêt sera très difficiles, voire impossible.
Après sectionnement cryostat et délai de séchage, le tissu est prêt pour LCM. En visualisant le tissu au microscope, les couches cellulaires du cervelet sont facilement visibles avec 5 X et 10 X lentilles de l’objectif. La figure 1 montre des images représentatives du tissu fixés dans l’éthanol seul (Figure 1A) et les tissus incubés dans le xylène après fixation de l’éthanol (Figure 1B). Nous avons rigoureusement testé divers temps d’incubation de l’éthanol et le xylène / températures sur la capacité à fixer et visualiser le tissu. Si le tissu est incubé pas assez longtemps dans le xylène, l’image résultante ressemblera davantage Figure 1A, plutôt que la Figure 1B. Causes de l’incubation de xylène le tissu pour devenir plus sombre et plus précise des couches cellulaires que fait l’éthanol seul. Lorsque vous coupez au microscope laser capture, l’objectif X 40 est nécessaire pour capturer uniquement les cellules de Purkinje et pas les tissus environnants. Incubation dans le xylène produit une haute qualité, image morphologiquement intact (Figure 1D) par rapport à la fixation de l’éthanol seule (Figure 1C).
Afin d’améliorer la visualisation de nos tissus, nous avons testé la capacité de la lamelle d’un capuchon Opaque. Autres protocoles UV-LCM utilisent un liquid bouchon rempli d’un tube de 200 – 500 μL qui dissout les tissus au contact. Casquettes remplies liquides peuvent réduire la visualisation des tissus, provoquant l’image qui en résulte est granulaire et irisé au microscope (Figure 2A). Visualisation des tissus à travers les résultats d’un capuchon Opaque (Figure 2B) dans un aspect de tissu lissés qui est plus douce et plus nette en forme. Le bouchon Opaque permet notamment, pour la collection jusqu'à 8 h sans nécessiter de remplacement. Les images représentant des cellules de Purkinje excisées à faible puissance (Figure 2C) et à forte puissance (Figure 2D, E) montrent enlèvement précis de tout le corps de cellules de Purkinje. Pour référence, Figure 2F montre un bleu Luxol Fast / hématoxyline et éosine (LH & E) teint le cortex cérébelleux, qui souligne plus particulièrement les différentes couches du cervelet et soumette les cellules de Purkinje moléculaire couche et cellules de granules des couches de juxtaposition.
Le but du présent protocole est d’obtenir la qualité RNA pour l’ordonnancement de RNA ultérieur. Nous avons testé notre protocole sur six échantillons de cerveau humain différent post-mortem, qui a subi trois jours de LCM à prélever des cellules de 1500 à 2000 pour l’extraction de l’ARN. Environ 6 à 8 h au microscope produit des cellules de 500 – 700, qui ont ensuite été combinés avec les produits de LCM jours précédents avant l’extraction de l’ARN. Les échantillons a subi une extraction de l’ARN et ont été remis en suspension dans 14 μL d’eau exempte de RNAse (Table des matières #14). Tous les six échantillons produits ARN de haute qualité, avec RNA intégrité numéros (RRI) ≥ 8 (Figure 3A-F). Cette procédure a donné lieu à des quantités de RNA de 11,5 ng (Figure 3A), 8,3 ng (Figure 3B), 13,6 ng (Figure 3C), 11,5 ng (Figure 3D), 14,9 ng (Figure 3E) et 26,9 ng (Figure 3-F). De la note est que tous les échantillons de cerveau humain post-mortem ont été testés pour la qualité de RNA avant LCM (tableau 1). Si l’échantillon d’origine a la dégradation de l’ARN, LCM se dégradera encore plus son intégrité.
Figure 1 : Couches cérébelleux et visualisation des cellules de Purkinje avec et sans traitement de xylène. Les images représentatives avec et sans xylène après fixation de l’éthanol et la déshydratation. La couche moléculaire (ML) et la couche de cellules de granules (GCL) sont étiquetés. Les cellules de Purkinje sont marqués par des flèches. (A), 5 X représentation de la visualisation de la couche cérébelleux sans xylène. Barre d’échelle : 10 µm. (B), 5 X représentation de la visualisation de la couche cérébelleuse avec xylène. Barre d’échelle : 10 µm. (C) 40 X représentation de la visualisation de la couche cérébelleux sans xylène. Echelle : 1 µm. (D) 40 X représentation sous forme de visualisation de la couche cérébelleuse avec xylène. Echelle : 1 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Visualisation des cellules de Purkinje avant et après LCM. Des images représentatives à 40 X avec xylène après fixation de l’éthanol et la déshydratation. Le ML et GCL sont étiquetés. Les cellules de Purkinje sont marqués par des flèches. (A) visualisation au microscope sous liquide rempli de cap à 40 x. Echelle : 1 µm. visualisation (B) au microscope sous collection Opaque boucher à 40 X. Echelle : 1 µm. (C) 5 X visualisation du cortex cérébelleux montrant les cellules de Purkinje excisées entre le ML et le GCL. Barre d’échelle : 10 µm. (D) 40 X visualisation d’une cellule de Purkinje avant l’excision. Echelle : 1 µm. (E) visualisation X 40 de capture réussie des cellules de Purkinje. Echelle : 1 µm. (F) 20 X représentant LH & E teint cervelet affichage cellule de Purkinje organes avec des flèches marquées. Barre d’échelle : 5 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Échantillons de RNA Bioanalyzer de contrôle de la qualité des résultats de LCM. Panneaux A-F montrent les affichages de contrôle de la qualité représentatives RNA. Chaque panel est un échantillon différent qui a subi le même processus de LCM de fixation et de visualisation avec l’éthanol et le xylène seulement. Numéros d’intégrité de RNA (RRI) sont tous > 8.0. Résultat [] concentrations représentant un rendement d’au moins 5 ng d’ARN total. Tous les échantillons sont élués dans 14 µL d’eau exempte de RNAse. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Échantillon | RIN - Section Prep | RIN - LCM | [ARN] - LCM | PMI-congelés |
| A | 9.2 | 8.6 | 822 pg/µL | 450 min |
| B | 9.8 | 8 | 598 pg/µL | 550 min |
| C | 9.1 | 8.5 | 976 pg/µL | 455 min |
| D | 9.8 | 8.2 | 823 pg/µL | 463 min |
| E | 9.8 | 9.1 | 1069 pg/µL | 1139 min |
| F | 9.6 | 8.3 | 1923 pg/µL | 1080 min |
Tableau 1 : Résumé de l’intégrité de l’ARN . Numéro de l’échantillon correspondre aux résultats bioanalyzer présentés à la Figure 3. Préparations de section sont exécutées avant le LCM pour s’assurer qu’à partir de tissu est de bonne qualité. Montré sont le tissu original RINs de section preps, LCM RINs et concentration d’ARN de LCM, ainsi que les intervalles de post-mortem à gelés (PMI-congelés) pour les tissus.
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Discussion
Le protocole présenté ici est spécialement modifié pour être une approche inox en visualisant les tissus morphologiquement distinctes pour UV-LCM. Cette méthode est conçue pour maximiser l’intégrité RNA pour ultérieur séquençage direct de RNA, tout en conservant un niveau de visualisation des tissus. La capacité de distinguer les différents types de cellules pour la capture, pour créer la plus pure population de cellules possible, est indispensable pour comprendre les différents profils moléculaires dans les tissus humains15. Dans le cadre du présent protocole, sélection de tissu est primordiale, comme l’utilisation de l’antigène ou colorants réactifs spécifiques ne sont pas utilisés et n’est donc pas adaptés aux études nécessitant une telle différenciation. Alors qu’il s’agit d’une limitation du présent protocole, la visualisation de tissu qui en résulte et l’intégrité de la RNA sont tout à fait supérieurs et maintiennent la pertinence dans d’autres conceptions expérimentales. De nombreux autres protocoles existent qui utilisent également des méthodes alternatives de coloration spécifiquement pour UV - et IR-LCM dans le but de préserver des RNA. Cependant, la plupart des autres méthodes contiennent au moins une souillure ou antigène spécifique6,16,17, sont conçus pour un seul type de cellules ou organes (qui ne sont pas des tissus humains autopsie)18,19, 20, ou exiger des kits de RNA-seq spécialisés afin d’améliorer l’intégrité21. Une coloration violet de crésyle (Nissl) est un colorant populaire contenant le réactif utilisé dans de nombreux protocoles, car il les taches des noyaux dans les neurones dans le cerveau et provoque la moindre quantité de RNA dégradation6. Cependant, le plus gros noyau de la cellule de Purkinje n’est pas bien taché par violet de crésyle, ne fournir aucun avantage significatif pour la visualisation des cellules de Purkinje. Ce qui est important, nous avons n'identifié qu’une seule étude de LCM dans la documentation qui décrit la collection de cellules de Purkinje humaines, qui sont d’un intérêt considérable pour l’étude des troubles cérébelleux de dégénératives et du développement. Cette étude teinté de tissus congelés avec du violet de crésyle et isolé des cellules de Purkinje avec un système IR-LCM ; Goûtez aussi faibles que 5 ont été utilisés mais jugé acceptable pour microarray analysis22RINs. Par conséquent, c’est la première étude de protocole qui est conçue spécifiquement pour l’ARN haute qualité des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem excisés par UV-LCM.
La stabilité de l’ARN en post-mortem des tissus humains est un obstacle bien connu, comme les molécules d’ARN dans les cellules sont tout à fait sous réserve de la désintégration naturelle après la mort. Plus précisément, ARNm s’est avéré être les plus sensibles aux nucléolytiques dégradation5. Surveillance de l’intervalle post-mortem (PMI) temps de congélation (PMI-congelé) est une métrique qui a montré une corrélation à la dégradation de l’ARN dans certaines études23,24,25. Toutefois, le tableau 1 montre nos intervalles PMI congelés pour les six échantillons illustrés à la Figure 3, qui n’indique aucune corrélation relative avec les valeurs de la PMI et de la qualité de la RNA. Par conséquent, il est nécessaire d’effectuer une diligence raisonnable en vérifiant l’intégrité RNA avant de commencer un projet de capture du laser. Si l’intégrité de RNA de l’échantillon de départ est de piètre qualité, l’ARN résultant d’un produit de LCM sera de qualité encore plus bas. Lorsque l’intégrité de RNA bas ne peut être évitée, autres méthodes améliorant d’ARN pour le séquençage pourraient être employés en plus de ce protocole21. Notamment, RNA faibles intrants ou dégradé peut conduire à la complexité avec sourdine et résultats sous-optimaux nécessitant souvent des étapes de l’amplification supplémentaire. L’ajout de cycles PCR amplification s’est avéré d’amplifier les séquences inégalement, mais aussi de créer des doublons de lecture sur le séquençage de26,27. Utilisation de l’ARN de qualité des échantillons de LCM pour le séquençage est donc très avantageuse.
La méthode de visualisation utilisée dans le présent protocole fortement tributaire de l’utilisateur de compétences lors de la coupe fraîche congelée tissu sur un cryostat. Le protocole va vaste détail comment préparer au mieux le tissu pour le sectionnement et placer le tissu sur la diapositive. Ce sont sans doute les deux étapes les plus critiques du présent protocole. Si le tissu n’est pas acclimaté à la température du cryostat, déchiquetage se produit, ce qui entrave considérablement la qualité morphologique du tissu. Déchiquetage est le résultat de quelques problèmes potentiels ; dépannage de possibilités inclure attente plus longue pour les tissus à température ou en modifiant le cryostat OT et/ou CT à un éventail plus chaud. Une fois le tissu a été coupé et placé sur la scène avec succès, il est important d’orienter le tissu et la lame correctement pour s’assurer que tous les tissus s’inscrit dans la membrane et peut être ramassée avec précision de la scène. Lorsque vous essayez de ramasser le tissu de la scène du cryostat, le tissu doit être froid, et la lame devrait être chaude. Il existe des protocoles alternatifs qui recommandent pour refroidir la lame avant de ramasser le tissu et réchauffé avec un doigt sur la surface de tissu placement28; Cependant, dans nos mains, il ne fournit aucun avantage et entraîne souvent des difficultés à ramasser le tissu et les plis de l’excès de tissu. Avec une lame à température ambiante, le tissu se fond immédiatement au contact de la diapositive. Afin d’assurer un ramassage propre, il faut incliner la lame afin qu’il entre en contact avec le tissu à la zone de la membrane mais ne va pas jusqu'à toucher la scène elle-même. La membrane commence à se détacher de la lame de verre, si elle touche la scène, ce qui endommage la membrane et rend laser capture difficile. Dans ce cas, il sera perceptible dès que LCM a commencé et ne peut Ωtre annulθe. Options de dépannage sont limitées ; Si à tout moment, on croit la membrane ou la diapositive a été compromise, il est sage de se défaire. Il est recommandé pour la pratique des tissus congelés frais coupes avant le démarrage d’un projet ou à l’aide d’un noyau de pathologie qui peut produire des tissus de haute qualité sectionnement. Toutefois, si vous utilisez un noyau de la fonction, s’assurer que la technique appropriée de RNA pour empêcher la contamination de la RNase. Dégradation de l’ARN peut facilement se produire lorsqu’une mauvaise technique est utilisée.
Nous présentons ici une méthode complète pour la visualisation en acier inoxydable de cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem aux fins de l’UV-LCM. Nous avons également inclus des méthodes de conservation appropriées RNA et techniques afin d’assurer des niveaux élevés d’intégrité RNA. Ce protocole n’est pas nécessairement spécifique à n’importe quelle un cellule ou le type de tissu, mais ne maintient l’obligation que la région/cellule d’intérêt est morphologiquement reconnaissable du stroma environnant sans la nécessité d’une reconnaissance spécifique de l’antigène ou colorant.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimerait le cerveau de la New York Bank, Dr Jean Paul Vonsattel et Dr Etty Cortés, pour leur aide dans le découpage et préserver les échantillons de tissu de cerveau humain congelé pour ces expériences. Les auteurs tiennent à remercier les personnes qui ont généreusement fait don de leur cerveau pour la recherche continue dans le tremblement essentiel. Dr. Faust et Dr Martuscello aimerait remercier Columbia University département de pathologie et biologie cellulaire pour leur soutien continu et un espace de recherche de base. Les auteurs aimerait remercier NIH R01 NS088257 Louis/Faust) pour financer la recherche pour ce projet. Images de LCM ont été réalisés dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Les auteurs aimerait Theresa Swayne et Laura Munteanu pour leur assistance continue avec la microscopie spécialisée.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
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